Идентификация регуляторных некодирующих РНК вируса папилломы человека типа 16 (Papillomaviridae: Alphapapillomavirus: Human papillomavirus) в опухолях шейки матки

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Введение. Вирусы папилломы человека высокого канцерогенного риска признаны этиологическими агентами рака шейки матки. Постоянная экспрессия вирусных онкобелков Е6 и Е7 необходима для поддержания злокачественного фенотипа опухолевых клеток. Точный механизм регуляции экспрессии вирусных онкогенов в опухолевых клетках до конца не выяснен.

Цель работы – идентификация вирусных некодирующих РНК (нкРНК) при ВПЧ16-положительном раке шейки матки.

Материалы и методы. Для обнаружения вирусных нкРНК в ВПЧ16-положительных первичных плоскоклеточных карциномах шейки матки и клеточных линиях SiHa и CasKi использовали полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией. Для выяснения функций нкРНК использовали метод нокдауна с олигонуклеотидами, комплементарными нкРНК.

Результаты. Мы идентифицировали нкРНК, транскрибируемые в регуляторной области ВПЧ16, в клеточных линиях и в 32 из 32 плоскоклеточных карцином шейки матки с эписомальной или интегративной формами вирусной ДНК. Нокдаун смысловых или антисмысловых цепей нкРНК приводит к снижению или увеличению уровней мРНК онкогенов Е6 и Е7 в клетках, соответственно. Эти изменения уровней мРНК онкогенов сопровождаются модуляцией уровней белка р53, основной мишени онкобелка Е6.

Заключение. Присутствие впервые выявленных регуляторных нкРНК во всех исследованных опухолях и клеточных линиях свидетельствует об их необходимости для поддержания в них постоянной экспрессии онкогенов Е6 и Е7. Полученные данные могут быть полезны для понимания фундаментальных аспектов регуляции экспрессии вируса в ВПЧ16-позитивных опухолях.

Об авторах

Наталия Петровна Киселева

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

Email: natalia-kis@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-0236-4548
SPIN-код: 6117-0705
Scopus Author ID: 82913

кбн,  вед н.с.

Россия, 115478, Москва, Каширское шоссе, 24

М. Д. Федорова

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

Email: fedorova_maria@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0002-8813-7516
SPIN-код: 4943-5931
Scopus Author ID: 707781

кбн, снс

Россия, 115478, Москва, Каширское шоссе, 24

А. Э. Заикина

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

Email: minnegalieva_ae@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7439-4212

лаборант-исследователь

Россия, 115478, Москва, Каширское шоссе, 24

Н. В. Ёлкина

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

Email: muuu222-222@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0503-6016
SPIN-код: 2304-9710
Scopus Author ID: 975978

лаборант-исследователь

Россия, 115478, Москва, Каширское шоссе, 24

Е. Е. Голдобина

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

Email: kegga@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-4036-3415

лаборант-исследователь

Россия, 115478, Москва, Каширское шоссе, 24

Д. С. Ёлкин

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

Email: yodanila@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4793-6063
SPIN-код: 9946-6863
Scopus Author ID: 1132390

аспирант

Россия, 115478, Москва, Каширское шоссе, 24

П. М. Абрамов

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

Email: apmlol6@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-7995-3490

аспирант

Россия, 115478, Москва, Каширское шоссе, 24

Л. С. Павлова

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

Email: larisamama@bk.ru
ORCID iD: 0000-0003-3993-4823
Scopus Author ID: 173325

нс

Россия, 115478, Москва, Каширское шоссе, 24

С. В. Винокурова

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: vinokourova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1615-3928
SPIN-код: 3453-4502
Scopus Author ID: 88396

кбн, руковолитель лаборатории

Россия, 115478, Москва, Каширское шоссе, 24

Список литературы

  1. Forman D., de Martel C., Lacey C.J., Soerjomataram I., Lortet-Tieulent J., Bruni L., et al. Global burden of human papillomavirus and related. Vaccine. 2012; 30(Suppl. 5): F12–23. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2012.07.055
  2. Doorbar J., Egawa N., Griffin H., Kranjec C., Murakami I. Human papillomavirus molecular biology and disease association. Rev. Med. Virol. 2015; 25(Suppl. 1): 2–23. https://doi.org/10.1002/rmv.1822
  3. zur Hausen H. Papillomaviruses in the causation of human cancers – a brief historical account. Virology. 2009; 384(2): 260–5. https://doi.org/10.1016/j.virol.2008.11.046
  4. Fehrmann F., Laimins L.A. Human papillomaviruses: targeting differentiating epithelial cells for malignant transformation. Oncogene. 2003; 22(33): 5201–7. https://doi.org/10.1038/sj.onc.1206554
  5. Goodwin E.C., DiMaio D. Repression of human papillomavirus oncogenes in HeLa cervical carcinoma cells causes the orderly reactivation of dormant tumor suppressor pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000; 97(23): 12513–8. https://doi.org/10.1073/pnas.97.23.12513
  6. Goodwin E.C., Yang E., Lee C.J., Lee H. W., DiMaio D., Hwang E.S. Rapid induction of senescence in human cervical carcinoma cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000; 97(20): 10978–83. https://doi.org/10.1073/pnas.97.20.10978
  7. Magaldia T.G., Almsteada L.L., Belloneb S., Prevatt E.G., Santin A.D., DiMaio D. Primary human cervical carcinoma cells require human papillomavirus E6 and E7 expression for ongoing proliferation. Virology. 2012; 422(1): 114–24. https://doi.org/10.1016/j.virol.2011.10.012
  8. Wells S.I., Francis D.A., Karpova A.Y., Dowhanick J.J., Benson J.D., Howley P.M. E2 induces senescence in HPV-positive cells via pRB- and p21CIP-dependent pathways. EMBO J. 2000; 19(21): 762–71. https://doi.org/10.1093/emboj/19.21.5762
  9. Prasanth K.V., Spector D.L. Eukaryotic regulatory RNAs: an answer to the ‘genome complexity’ conundrum. Genes Dev. 2007; 21(1): 11–42. https://doi.org/10.1101/gad.1484207
  10. Iwakiri D. Multifunctional non-coding Epstein–Barr virus encoded RNAs (EBERs) contribute to viral pathogenesis. Virus Res. 2016; 212: 30–8. https://doi.org/10.1016/j.virusres.2015.08.007
  11. Conrad N.K. New insights into the expression and functions of the Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus long noncoding PAN RNA. Virus Res. 2016; 212: 53–63. https://doi.org/10.1016/j.virusres.2015.06.012
  12. Klaes R., Woerner S.M., Ridder R., Wentzensen N., Duerst M., Schneider A., et al. Detection of high-risk cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer by amplification of transcripts derived from integrated papillomavirus oncogenes. Cancer Res. 1999; 59(24): 6132–6.
  13. Fedorova M., Vinokurova S., Pavlova L., Komel’kov A., Korolenkova L., Kisseljov F., et al. Human papillomavirus types 16 E1 mRNA is transcribed from P14 early promoter in cervical neoplasms. Virology. 2016; 488: 196–200. https://doi.org/10.1016/j.virol.2015.11.015
  14. Szuhai K.V., Bezrookove V., Wiegant J., Vrolijk J., Dirks R.W., Rosenberg C., et al. Simultaneous molecular karyotyping and mapping of viral DNA integration sites by 25-color COBRA-FISH. Genes Chromosomes Cancer. 2000; 28(1): 92–7. https://doi.org/10.1002/(sici)1098-2264(200005)28:1<92::aid-gcc11>3.0.co;2-2
  15. Meissner J.D. Nucleotide sequences and further characterization of human papillomavirus DNA present in the CaSki, SiHa and HeLa cervical carcinoma cell lines. J. Gen. Virol. 1999; 80(Pt. 7): 1725–33. https://doi.org/10.1099/0022-1317-80-7-1725
  16. Beiter T., Reich E., Weigert C., Niess A.M., Simon P. Sense or antisense? False priming reverse transcription controls are required for determining sequence orientation by reverse transcription–PCR. Anal. Biochem. 2007; 369(2): 258–61. https://doi.org/10.1016/j.ab.2007.06.044
  17. Matsui M., Prakash T.P., Corey D.R. Argonaute 2-dependent regulation of gene expression by single-stranded miRNA mimics. Mol. Ther. 2016; 24(5): 946–55. https://doi.org/10.1038/mt.2016.39
  18. Seedorf K., Krämmer G., Dürst M., Suhai S., Röwekamp W.G. Human papillomavirus type 16 DNA sequence. Virology. 1985; 145(1): 181–5. https://doi.org/10.1016/0042-6822(85)90214-4
  19. Patrushev L.I., Kovalenko T.F. Functions of noncoding sequences in mammalian genomes. Biochemistry (Mosc.). 2014; 79(13): 1442–69. https://doi.org/10.1134/S0006297914130021
  20. Cripe T.P., Haugen T.H., Turket J.P., Tabatabai F., Schmid P.G. 3rd, Dürst M., et al. Transcriptional regulation of the human papillomavirus-16 E6-E7 promoter by a keratinocyte-dependent enhancer, and by viral E2 trans-activator and repressor gene products: implications for cervical carcinogenesis. EMBO J. 1987; 6(12): 3745–53. https://doi.org/10.1002/j.1460-2075.1987.tb02709.x
  21. Melgar M.F., Collins F.S., Sethupathy P. Discovery of active enhancers through bidirectional expression of short transcripts. Genome Biol. 2011; 12(11): R113. https://doi.org/10.1186/gb-2011-12-11-r113
  22. Scheffner M., Huibregtse J.M., Vierstra R.D., Howley P.M. The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53. Cell. 1993; 75(3): 495–505. https://doi.org/10.1016/0092-8674(93)90384-3
  23. Melsheimer P., Vinokurova S., Wentzensen N., Bastert G., von Knebel Doeberitz M. DNA aneuploidy and integration of human papillomavirus type 16 E6/E7 oncogenes in intraepithelial neoplasia and invasive squamous cell carcinoma of the cervix uteri. Clin. Cancer Res. 2004; 10(9): 3059–63. https://doi.org/10.1158/1078-0432.ccr-03-0565
  24. Kassab M.A., Mudassir M., Singh A., Muthuraman N., Bhagat M., Palanichamy J.K., et al. Gene silencing and activation of human papillomavirus 18 is modulated by sense promoter associated RNA in bidirectionally transcribed long control region. PLoS One. 2015; 10(6): e0128416. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0128416
  25. Han J., Kim D., Morris K.V. Promoter-associated RNA is required for RNA-directed transcriptional gene silencing in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007; 104(30): 12422–7. https://doi.org/10.1073/pnas.0701635104

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Анализ транскрипции в районе URR ВПЧ16 методом ОТ-ПЦР. а: сплошная линия – схема URR ВПЧ16, расположенного между поздним геном L1 и ранними генами E6/Е7; позиции олигонуклеотидов, использованных для нокдауна нкРНК, обозначены звёздочками; изогнутые стрелки – старты транскрипции ранних генов [13]; вертикальная черта – точка начала (1 п.н.) и конца отсчёта (7904 п.н.) нуклеотидов в кольцевом геноме ВПЧ16; ORF L1 – конец рамки считывания вирусного белка L1; polyA – сигнал полиаденилирования РНК поздних генов; чёрные прямоугольники под сплошной линией – транскрипты поздних и ранних генов; серые прямоугольники – продукты ОТ-ПЦР обнаружены; белые прямоугольники – продукты ОТ-ПЦР отсутствуют; цифры внутри прямоугольников – позиции прямого (F) и обратного (R) праймеров (п.н.) согласно сиквенсу ВПЧ16 AF125673 (GenBank); б–д – электрофореграммы продуктов ПЦР: б – клетки SiHa; в – клетки CasKi; г – клетки опухоли шейки матки. [RT+] и [RT−] – синтез кДНК проведён в присутствии и отсутствии обратной транскриптазы соответственно; [К+] – ПЦР с ДНК ВПЧ16 (позитивный контроль ПЦР); [К−] – Н2О вместо ДНК-матрицы (контроль на контаминацию реактивов ПЦР); М – маркер, 100 п.н.

Скачать (142KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Анализ направления транскрипции в URR ВПЧ16 методом ОТ-ПЦР в клетках SiHa. а: сплошная линия – схема URR ВПЧ16, обозначения как в подписи к рис. 1, а. F1, F2 и R1, R2 – генспецифические праймеры для синтеза кДНК с антисмысловой и смысловой цепей соответственно; б, в – анализ продуктов ОТ-ПЦР методом электрофореза в агарозном геле. [RT+] и [RT−] – синтез кДНК проведён в присутствии и отсутствии обратной транскриптазы соответственно; [К+] – ПЦР с ДНК SiHа (позитивный контроль ПЦР); [К−] – Н2О вместо ДНК-матрицы (контроль на контаминацию реактивов ПЦР); [Pr−] – ПЦР без праймеров (контроль на самопраймирование РНК), адаптор – см. раздел «Материалы и методы»; цифры – позиции всех элементов в п.н. согласно сиквенсу ВПЧ16 AF125673 (GenBank); М – маркер, 100 п.н. Овал указывает позицию продукта ПЦР в геле.

Скачать (146KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Влияние нокдауна нкРНК на уровень мРНК и активность ранних генов ВПЧ16 в клетках SiHa. а: сплошная линия – схема участка генома ВПЧ16 с ранними генами (обозначения как в подписи к рис. 1); варианты сплайсинга мРНК обозначены жирной чертой для экзонов, тонкой чертой для интронов, справа обзначен кодирующий потенциал каждого варианта; малый серый прямоугольник – позиция исследуемого района мРНК; цифры – позиции всех элементов в п.н. согласно сиквенсу ВПЧ16 AF125673 (GenBank); S – трансфекция коктейлями олигонуклеотидов, комплементарными к смысловой цепи нкРНК; АS – трансфекция коктейлями олигонуклеотидов, комплементарными к антисмысловой цепи нкРНК; К – трансфекция без добавления олигонуклеотидов, кДНК синтезирована с гексапраймерами; б, в – на оси ординат указаны уровни РНК ВПЧ16, нормализованные по отношению к мРНК гена HPRT; б – уровень мРНК суммарного транскрипта ранних генов; в – уровень нкРНК. Статистическая обработка данных проведена в программе GraphPad Prism v.7.00 с помощью парного t-теста; г – анализ экспрессии р53 методом вестерн-блоттинга. Представлен типичный результат трансфекции. GAPDH – контроль белковой нагрузки; цифры над блоттом – нормализованные уровни белка р53 по отношению к контролю в процентах (рассчитано по программе Image Studio Lite v.5.2.).

Скачать (97KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Анализ уровней нкРНК и мРНК ранних генов ВПЧ16 в опухолях шейки матки. На оси ординат указано отношение числа копий мРНК к числу копий нкРНК. Количество копий каждого типа РНК рассчитано в 1 нг исходной тотальной РНК. Черные, серые и белые прямоугольники – образцы с эписомальной, интегративной и смешанной формой присутствия вирусной ДНК соответственно; заштрихованный прямоугольник – клеточная линия SiHa.

Скачать (66KB)
Метаданные

© Киселева Н.П., Федорова М.Д., Заикина А.Э., Ёлкина Н.В., Голдобина Е.Е., Ёлкин Д.С., Абрамов П.М., Павлова Л.С., Винокурова С.В., 2022

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».