Выявление “некультивируемых” клеток Mycobacterium tuberculosis культуральными методами

Выявлены особенности реактивации “некультивируемых” клеток (НК) Mycobacterium tuberculosis (МТБ) для последующего размножения в жидкой среде, а также предложен подход количественной детекции таких клеток культуральными методами. После инокулирования, полученных in vitro НК МТБ в стандартную жидкую среду Сотона, наблюдалась продолжительная (до 20 сут) лаг-фаза, при которой размножение клеток отсутствовало. В течение лаг-фазы клетки секретировали вещества неустановленной природы, тормозящие или полностью прекращающие реактивацию и рост культур при исходных концентрациях НК выше 10⁷–10⁸ кл./мл. Введение мясопептонного бульона (3.25 г/л) в стандартную среду Сотона со сниженной в 10 раз концентрацией глицерина существенно стимулировало реактивацию и размножение НК при их инокулировании в концентрациях выше порогового значения. Такая модификация состава среды позволяла выявлять до 10³ раз больше клеток в популяции МТБ методом наиболее вероятного числа клеток (НВЧК). Увеличение числа детектируемых НК в популяции (в среднем 2.5 порядка) достигалось также добавлением в среду для реактивации рекомбинантного белка RpfB (5 нг/мл), одного из белков семейства Rpf – факторов реактивации покоящихся бактерий. Возможно, действие Rpf связано с продуктами его ферментативной активности, поскольку увеличение НВЧК в популяции НК наблюдалось также при добавлении продуктов гидролиза пептидогликана (ПГ) микобактерий, полученных совместным действием RpfB и эндопептидазы RipA. Подобный эффект оказывало также добавление озвученных фрагментов пептидогликана (ФПГ) в концентрации до 1 мкг/мл. Полученные результаты могут быть использованы в качестве подходов для оптимизации состава жидких сред и условий культивирования с целью выявления возбудителя туберкулеза в состоянии “некультивируемости” в клинических образцах.