Dose-dependent Effects of Azospirilla Lectin on the Growth of wheat Seedlings under Salt Stress

Full Text

Засоление почвы является одним из основных абиотических стрессов, который ограничивает рост и продуктивность растений. Пшеница (Triticum aestivum L. сорта Саратовская 29) умеренно солеустойчива, однако ее урожайность сильно снижается при высоких уровнях солености. Исследования приспособления растений к засолению показывают, что этот процесс в онтогенезе протекает неравномерно. Наибольшую чувствительность к высоким концентрациям солей проявляют растения на первых стадиях развития, то есть при прорастании семян и появлении всходов [1]. Основной ущерб растениям, обусловленный засолением, вызван накоплением ионов натрия, которые токсичны для большинства организмов [2, 3]. NaCl является преобладающей солью в большинстве засоленных сред. Когда корни растений находятся в среде с высоким содержанием NaCl, внешние Na⁺ и Cl^– создают большой электрохимический градиент, который стимулирует приток ионов соли, нарушая ионный гомеостаз и в конечном итоге повреждая проростки [4, 5]. Корень — это часть растения, непосредственно контактирующая с солями и реагирующая на солевой стресс, посылая химические сигналы через стебель листу [6]. Засоление вызывает окислительный стресс у растений, причинами которого являются образование активных форм кислорода, таких как супероксид (O₂^–), пероксид водорода (H₂O₂), гидроксильный радикал (•OH) и синглетный кислород (¹O₂). Активные формы кислорода обладают чрезвычайно высокой реакционной способностью и в конечном итоге приводят к апоптозу и гибели клеток [7, 8]. Однако растения разработали эффективные ферментативные антиоксидантные системы для предотвращения окислительного повреждения [9]. Супероксиддисмутаза (КФ 1.15.1.1) превращает O₂^– в H₂O₂. Каталаза (КФ 1.11.1.6) и различные пероксидазы (КФ 1.11.1.7) катализируют расщепление H₂O₂. Эффективность антиоксидантных ферментов гасить O₂^– и H₂O₂ связана со стрессоустойчивостью растения [7].

Среди первичных механизмов повреждения клеток при окислительном стрессе лидирует перекисное окисление остатков жирных кислот в мембранных фосфолипидах. При этом снижается их гидрофобность и нарушается стабильность мембран, изменяется работа мембраносвязанных ферментов, повышается проницаемость мембран для ионов, исчезает способность избирательно накапливать вещества. В этом случае соли попадают в клетку пассивно, что еще больше увеличивает повреждение [7]. Как правило, процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивают по скорости и количеству образования одного из конечных продуктов окисления — малонового диальдегида (МДА).

Окислительное повреждение белков заключается в модификации аминокислот, разрыве пептидной цепи, агрегации сшитых продуктов реакции и т. д., тогда как окисление некоторых аминокислотных остатков приводит к образованию оксогрупп, которые усиливают восприимчивость белков к протеолизу [10].

Считается, что флавоноиды являются участниками антиоксидантной защиты клеток, так как являются ловушками для свободных радикалов, а также способны хелатировать ионы металлов, участвующие в радикальных процессах [11].

Изучение потенциала химических веществ, регулирующих рост растений, для минимизации образования свободных радикалов и смягчения повреждения мембран является ступенькой к управлению солевым стрессом у растений [12]. Учитывая необходимость экологизации сельского хозяйства, актуальным является поиск веществ, продуцируемых высшими растениями, грибами и микроорганизмами. Большинство почвенных микроорганизмов могут колонизировать растения, связываясь с ними и усиливая рост и урожайность. Эти микроорганизмы обычно называют ризобактериями, способствующими росту растений (PGPR — Plant Growth-Promoting Rhizobacteria). Среди PGPR представители рода Azospirillum хорошо известны и широко используются в сельском хозяйстве [13]. Азотфиксирующие азоспириллы привлекли внимание из-за их роста в тесной связи с корнями различных трав и злаков, их широкого географического распространения и стимулирования роста и развития растений. Эти бактерии приносят пользу растениям несколькими прямыми и косвенными способами. Положительные эффекты объясняются биологической фиксацией азота; производством растительных гормонов, таких как индолилуксусная кислота, которые способствуют развитию корней и увеличивают поглощение воды и питательных веществ; производством соединений, повышающих мембранную активность и пролиферацию тканей корня; смягчением последствий стрессора и борьбой с многочисленными патогенами растений [13]. Механизмы биоконтроля, опосредованного растениями, включают способность бактерий вызывать защитные реакции растений, повышающие устойчивость [14]. В последнее время гораздо больше внимания уделяется анализу роли PGPR в улучшении роста растений в условиях стресса [15].

Бесспорным фактом является участие лектинов, молекул белковой природы в установлении межклеточных биологических взаимодействий, в том числе N₂-фиксирующих систем. Долгое время считалось, что при взаимодействии углеводов с белками при образовании N₂-фиксирующих ассоциаций и симбиозов растительные лектины действуют как узнающие молекулы [16]. Однако появились новые данные для лектинов N₂-фиксирующих бактерий, которые подчеркивают роль бактериальных лектинов в таких взаимодействиях [17, 18]. Никитина с соавт. [18] показали, что взаимодействие азоспирилл с корнями начинается как взаимодействие лиганд-рецептор и что лектины поверхности бактерий наряду с другими факторами участвуют в этом процессе. С поверхности бактерий A. brasilense Sp7 был выделен лектин, являющийся полифункциональным гликопротеином [18]. Эффекты этого лектина, такие как стимулирование прорастания семян, митогенная и фермент-модифицирующая активности, а также способность изменять содержание стрессовых метаболитов в растительных клетках являются дозозависимыми [19–22]. Многие лектин-индуцированные эффекты были зафиксированы при низких концентрациях лектина.

По-видимому, как и другие регуляторы роста, лектины могут оказывать дозозависимое действие на устойчивость пшеницы при солевом стрессе.

Цель работы — исследование влияние различных концентраций лектина на активность антиоксидантных ферментов, общее содержание белка, перекисное окисление липидов и содержание вторичных метаболитов, таких как общее количество фенолов и флавоноидов в корнях проростков пшеницы.

МЕТОДИКА

Получение препаратов лектинов. Лектин выделяли с поверхности клеток штамма A. brasilense Sp7 (IBPPM 150) из коллекции ризосферных микроорганизмов Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (http://collection.ibppm.ru). Очистку белка и определение лектиновой активности проводили как было описано ранее [21].

Стерилизация семян, получение корней проростков и их предобработка препаратами лектинов. Семена пшеницы Triticum aestivum L. сорта “Саратовская 29” (ГНУ НИИ Сельского хозяйства Юго-Востока РСХА, Россия) были поверхностно стерилизованы в 70%-ном (об./об.) этаноле 1 мин, затем пятикратно отмыты стерильной водой. Семена проращивали в асептических условиях в чашках Петри на стерильной дистиллированной воде и инкубировали в темноте при 25°C. Для экспериментов были использованы корни четырехдневных проростков. Для изучения влияния лектина и засоления на изучаемые параметры, корни проростков выдерживали в течение 2 ч либо в растворе 1%-ного NaCl, либо в растворах лектина (концентрации 0.1–1.2 мM) и 1%-ного NaCl.

Определение активности антиоксидантных ферментов. Свежие корни (0.5 г) гомогенизировали отдельно в 4 мл 50 мМ натрий-фосфатного буфера (pH 7.0), содержащего 0.1 мМ ЭДТА-Na₂, 1%-ный (масса/об.) поливинилпирролидон и 0.05% (масса/об.) Triton X-100 в ледяной бане. Гомогенат центрифугировали при 12000 g в течение 15 мин при 4°C. Надосадочную жидкость использовали для определения активности супероксиддисмутазы (СОД), пероксидазы (ПО) и каталазы (КАТ) в соответствии с методиками, описанными Хайруллиным с соавт. [23], Эби [24] и Альшер с соавт. [25] соответственно.

Определение растворимого белка. Надосадочную жидкость использовали также для определения содержания белка в корнях по методу Бредфорда [26], используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта.

Определение содержание фенольных соединений и флавоноидов. Свежие корни экстрагировали в течение 20 мин 50%-ным метанолом. Экстракты фильтровали под вакуумом с использованием фильтровальной бумаги Whatman № 1 (“Sigma-Aldrich”, США). В экстрактах спектрофотометрическим методом определяли суммарное количество растворимых фенольных соединений с реактивом Фолина–Дениса (поглощение при 725 нм) [27] и содержание флавоноидов по реакции с 1%-ным водным раствором хлористого алюминия (поглощение при 415 нм) [28]. Для сравнительного анализа вариантов содержание определяемых веществ выражали в% к контролю. За 100% принимали количество фенолов и флавоноидов, содержащихся в клетках контрольных корней.

Определение интенсивности ПОЛ. Перекисное окисление липидов в ткани листьев определяли путем измерения количества малонового диальдегида (МДА) с использованием тиобарбитуровой кислоты. Свежие корни проростков (1 г) гомогенизировали в 4.0 мл 10%-ной трихлоруксусной кислоты и центрифугировали при 5000 g в течение 10 мин при 4°C. Надосадочную жидкость анализировали на МДА по методу Ву с соавт. [29]. Для расчета содержания МДА использовали коэффициент молярной экстинкции, равный 155 мМ^-1 см^-1. Содержание МДА выражали в мкмоль/г сырого веса. Для сравнительного анализа вариантов cодержание МДА выражали в% к контролю. За 100% принимали количество МДА, содержащегося в клетках контрольных корней.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку данных проводили с использованием дисперсионного анализа (ANOVA) с помощью пакета программ “AGROS” для статистического анализа (версия 2.09, Департамент статистического анализа Российской академии сельскохозяйственных наук). Результаты представлены как средние арифметические значения со стандартной ошибкой (объем выборки n = 3). Варианты, достоверно различающиеся по критерию Фишера (F-критерию) при p ≤ 0.05, обозначены в таблицах с результатами разными буквами латинского алфавита.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Солевой стресс значительно усиливал активность пероксидазы корней в отсутствие лектина. У растений, подвергшихся стрессу, воздействие лектина на корни в течение 30 мин приводило к увеличению активности ПО линейным образом, зависящим от концентрации. Активность достигала пика при 0.6 мМ лектина, увеличение составляло 60%. Через 120 мин инкубации активность фермента снижалась до контрольного значения (табл. 1).

 

Таблица 1. Влияние лектина A. brasilense Sp7 на активность пероксидазы, каталазы и СОД в корнях проростков пшеницы при воздействии смоделированного засоления

Лектин, мМ	Время инкубации, мин
	15	30	60	120
Пероксидаза
Контроль 0.1 0.3 0.6 1.2	3.0 105 ± 2a 110 ± 3b 120 ± 2c 122 ± 5c	3.4 102 ± 2a 110 ± 4b 160 ± 4d 175 ± 2c	3.8 110 ± 2b 112 ± 3b 120 ± 3c 120 ± 2c	4.0 110 ± 2a 105 ± 4a 100 ± 2a 98 ± 3a
Каталаза
Контроль 0.1 0.3 0.6 1.2	10 98 ± 2a 100 ± 3a 98 ± 3a 100 ± 2a	15 100 ± 3a 98 ± 4a 96 ± 2a 100 ± 3a	20 65 ± 3c 71 ± 4d 85 ± 2d 95 ± 3b	22 89 ± 3b 100 ± 4a 98 ± 3a 96 ± 2a
СОД
Контроль 0.1 0.3 0.6 1.2	0.8 100 ± 3a 100 ± 2a 100 ± 4a 110 ± 3b	1.5 100 ± 3a 105 ± 4a 110 ± 3b 115 ± 2b	2.0 105 ± 2a 115 ± 3b 150 ± 4c 110 ± 3b	2.4 110 ± 4b 115 ± 4b 105 ± 3a 110 ± 2b

Примечание. Результаты представлены как средние арифметические значения со стандартной ошибкой. Разными буквами обозначены достоверно отличающиеся величины (P < 0.05). За 100% приняты значения активности ферментов в корнях, не подвергавшихся обработке лектином.

 

Активность КАТ в корнях увеличивалась при солевом стрессе и существенно снижалась после воздействия на корни лектина в течение 1 ч. Использование лектина в концентрации 1.2 мМ не влияло на активность КАТ у растений, подвергавшихся солевому стрессу, но при 0.1–0.6 мМ лектина активность значительно снижалась. Ингибирование достигало пика при 0.1 мМ лектина (табл. 1).

Активность СОД в корнях значительно повышалась при солевом стрессе. Через 1 ч инкубации в условиях стресса активность изменялась параболически с увеличением концентрации лектина (табл. 1). Наиболее эффективная концентрация лектина составила 0.6 мМ.

Продукт перекисного окисления липидов МДА являлся индикатором окислительного повреждения клеточных мембран. В условиях, имитирующих солевой раствор, воздействие лектина A. brasilense Sp7 приводило к максимальному снижению МДА после 60 мин инкубации с корнями проростков. Кроме того, содержание МДА в корнях изменялось параболически с увеличением концентрации лектина и было самым низким при 0.3 мМ лектина в условиях солевого стресса. Необходимо отметить, что обработка NaCl заметно увеличивала содержание МДА в корнях по сравнению с контролем (рис. 1а). В контрольных образцах содержание МДА составляло 3.2 мкмоля/г сырой массы корней.

 

Рис. 1. Влияние лектина (2–5) A. brasilense Sp7 на содержание МДА (а), ФС (б) и флавоноидов (в) в корнях проростков пшеницы при засолении: 1 – контроль, без лектина; 2 – 0.1 мM; 3 – 0.3 мM; 4 – 0.6 мM; 5 – 1.2 мM. Результаты представлены как средние арифметические значения со стандартной ошибкой. Разными буквами обозначены достоверно отличающиеся величины (P < 0.05).

 

Еще одним важным показателем защиты растений от стресса является восстановление содержания общего белка. Уменьшение общего содержания белка при стрессе может быть связано с ингибированием синтеза белка и с его деградацией. Солевой стресс приводил к максимальному снижению содержания белка в корнях после обработки в течение часа. Использование 0.3 мМ концентрации лектина значительно нивелировало вызванное стрессом снижение и увеличило содержание белка на 30% по сравнению с растениями, не обработанными лектином. Содержание белка в корнях также увеличивалось при более низкой и более высокой концентрации лектина (0.1 и 0.6 мМ соответственно), но в меньшей степени, чем в предыдущем случае. Однако использование лектина в концентрации 1.2 мМ не приводило к существенному изменению содержания белка в корнях по сравнению с таковым у необработанных лектином растений в условиях солевого стресса (табл. 2).

 

Таблица 2. Влияние лектина A. brasilense Sp7 на содержание общего растворимого белка в корнях проростков пшеницы в условиях смоделированного засоления

Лектин, мМ	Растворимый белок
	Время инкубации, мин
	15	30	60	120
Контроль 0.1 0.3 0.6 1.2	20 98 ± 2a 98 ± 3a 100 ± 3a 100 ± 2a	15 100 ± 3a 96 ± 4a 98 ± 2a 100 ± 3a	10 71 ± 3c 83 ± 4d 75 ± 2c 54 ± 3b	16 100 ± 3a 89 ± 4a 98 ± 3a 96 ± 2a

Примечание. Результаты представлены как средние арифметические значения со стандартной ошибкой. Разными буквами обозначены достоверно отличающиеся величины (P < 0.05). За 100% приняты значения содержания растворимого белка в корнях, не подвергавшихся обработке лектином.

 

В условиях, имитирующих солевой стресс, общее содержание фенолов больше всего увеличивалось после 60-минутной инкубации с 0.3 мМ лектина с корнями проростков. Увеличение составило 50% по сравнению с контролем (рис. 1б). Комбинированное воздействие на корни 0.3 мМ лектина и солевого стресса приводило к увеличению содержания флавоноидов, которое достигало максимума через 1 ч воздействия (непонятно). Увеличение составило 60% по сравнению с контролем (рис. 1в).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Азоспириллы могут синтезировать лектины — гликопротеины, обладающие способностью высокоспецифично связывать остатки углеводов на поверхности растительной клетки. Лектин A. brasilense Sp7 способствует росту растений, способен модифицировать активность ферментов, а также может изменять содержание стрессовых метаболитов в клетках растений, что свидетельствует о его способности индуцировать адаптационные процессы в корнях проростков пшеницы [19–21, 30–34].

Засоление является неблагоприятным экологическим фактором, который может снижать урожайность растений более чем на 50%. Засоление почвы в основном происходит из-за хлорида натрия. Самыми легкими мишенями прямого воздействия засоления являются семена и корни растений, поскольку соли в основном концентрируются в верхних слоях почвы [35]. Исследования адаптации растений к засолению показывают, что наибольшую чувствительность к высоким концентрациям солей проявляют растения при прорастании семян и появлении всходов [7].

Результаты данного исследования показали, что лектин A. brasilense Sp7 повышал устойчивость корней проростков пшеницы в условиях солевого стресса. NaCl не только непосредственно токсичен для клеточного метаболизма, но также способствует интенсивному образованию АФК и развитию окислительного стресса. Накопление АФК играет центральную роль в реакции растений на стресс [36]. Инактивация избыточного количества АФК важно для защиты от окислительного повреждения в условиях стресса [12, 37].

Лектин существенно изменял уровень активности антиоксидантных ферментов в корнях, подвергшихся стрессу, уже через несколько минут после стресса. Происходило увеличение активности ПО и СОД и снижение активности КАТ. Наши данные подтверждают результаты Арзанеш с соавт. [38], которые показали, что азоспириллы могут повышать активность ПО и СОД растений при различных абиотических стрессах. Снижение активности КАТ могло быть связано с действием салициловой кислоты, синтез которой индуцируется лектинами азоспирилл [39].

При действии неблагоприятных факторов, в том числе и засоления, происходит ингибирование синтеза белка, увеличение деградации протеинов и в целом нарушение белкового метаболизма, о чем свидетельствует снижение показателя общего растворимого белка [40]. Действительно, в нашем исследовании солевой стресс несколько снижал содержание общего растворимого белка в корнях проростков пшеницы. Низкие концентрации лектина (0.3 мМ) значительно повышали уровень растворимого белка в корнях по сравнению с корнями, не обработанными лектином, в условиях стресса. Этот результат свидетельствует о том, что лектин, проявляя защитный эффект, способствует нормализации белкового метаболизма в условиях засоления.

Наиболее ранние изменения в ответ на неблагоприятные внешние факторы происходят на уровне наружной мембраны растительной клетки — плазмалеммы. Одной из быстрых и неспецифических реакций клеточных мембран, вызванных любым стрессом, является усиление перекисного окисления липидов мембраны, что является основной причиной повреждения и гибели растений. Количество малонового диальдегида — продукта перекисного окисления липидов является, показателем окислительного повреждения клеточных мембран. Предварительная обработка лектином в концентрации 0.3 мМ снижала уровень МДА в корнях, подвергшихся стрессу.

Фенольные соединения являются обязательными компонентами клеток высших растений и выполняют в них различные функции. Они участвуют в окислительно-восстановительных процессах (компоненты электрон-транспортных цепей дыхания и фотосинтеза), иммунных реакциях; они используются в качестве резервного энергетического материала; регулируют рост и развитие растений; защищают клетки от стресса. Обладая высокой реакционной способностью, эти вторичные метаболические соединения могут инактивировать свободные радикалы, тем самым защищая клетки от АФК. Имеются отдельные данные, свидетельствующие об увеличении содержания фенолов в стрессовых тканях растений [41]. Фенольные кислоты и флавоноиды являются наиболее распространенными фенольными соединениями в пшенице и встречаются как в свободной, так и в связанной форме в различных концентрациях. Оценка содержания фенолов в корнях проростков пшеницы, обработанных лектинами, показала, что лектин A. brasilense Sp7 может значительно увеличить содержание фенольных соединений в корнях в начальный период моделирования солевого стресса.

Таким образом, обработка лектином A. brasilense Sp7 оказывает дозозависимое действие на активность антиоксидантных ферментов, ПОЛ, общее содержание растворимого белка и содержание фенолов в корнях пшеницы при солевом стрессе. Настоящие результаты являются дополнением к полученным ранее данным о том, что лектины азоспирилл могут участвовать в адаптации и вызывать индукцию защитных механизмов растений. Было показано, что лектины азоспирилл способны изменять содержание ряда стрессовых метаболитов — пероксида водорода, цАМФ [19], оксида азота, диацилглицерина, салициловой кислоты [21, 30] низкомолекулярных антиоксидантов [34]. Таким образом, протекторный эффект лектинов в растениях носит мультинаправленный (полифункциональный) характер. Это является одной из причин считать эти белки способными повышать выживаемость растений в условиях действия стрессоров и тем самым выполнять роль одного из компонентов общих клеточных защитных систем. Все это позволяет рассматривать лектины как перспективное для практического применения соединения для защиты растений от стресса и повышения их продуктивности.

About the authors

S. А. Alen’kina

Saratov Scientific Centre of the Russian Academy of Sciences (IBPPM RAS)

Author for correspondence.
Email: s.alenkina@yandex.ru

Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms

Russian Federation, Saratov, 410049

M. А. Кupryаshinа

Saratov Scientific Centre of the Russian Academy of Sciences (IBPPM RAS)

Email: s.alenkina@yandex.ru

Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms

Russian Federation, Saratov, 410049

References

Supplementary files