Рекомбинантная химотрипсиноподобная пептидаза tenebrio molitor с неканоническим субстрат-связывающим сайтом

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Охарактеризована щелочная химотрипсиноподобная сериновая пептидаза большого мучного хрущака Tenebrio molitor с неканоническим субстрат-связывающим субсайтом, которая может быть использована в качестве добавки в различные биопрепараты. Фермент был получен в форме рекомбинантного препарата, очистка была проведена с использованием аффинной хроматографии на Ni2+-NTA агарозе. Было определено, что константы специфичности (kcat/Km) для субстратов химотрипсина Glp-AAF-pNA, Suc-AAPF-pNA и Ac-Y-pNA составляли 7.0, 4.2 и 0.9 (мкM∙мин)–1 соответственно. Оптимум активности наблюдался при рН 9.0. Фермент был стабилен при щелочных рН, в присутствии БСА также и при кислых рН. Пептидаза ингибировалась синтетическими ингибиторами, такими как PMSF, TPCK, химостатин, в то время как ЭДТА, Е-64, пепстатин не влияли на активность фермента. Очищенный фермент продемонстрировал высокую стабильность в течение 2.5 ч в присутствии БСА. Короткий жизненный цикл насекомого и секреция множества пептидаз в средней кишке с высокой каталитической активностью и стабильностью могут сделать T. molitor отличным альтернативным источником промышленно важных ферментов для использования в качестве добавок в различных биопрепаратах (например, пятновыводителях, моющих средствах и т. п.).

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

В. Ф. Терещенкова

Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, химический факультет

Автор, ответственный за переписку.
Email: elp@belozersky.msu.ru
Россия, Москва

Н. И. Жиганов

Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, биологический факультет

Email: elp@belozersky.msu.ru
Россия, Москва

А. С. Губаева

Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, химический факультет

Email: elp@belozersky.msu.ru
Россия, Москва

Ф. И. Акентьев

Национальный исследовательский центр “Курчатовский институт”; “Курчатовский геномный центр”, НИЦ “Курчатовский институт”

Email: elp@belozersky.msu.ru
Россия, Москва; Москва

Я. Е. Дунаевский

Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского

Email: elp@belozersky.msu.ru
Россия, Москва

Д. Г. Козлов

Национальный исследовательский центр “Курчатовский институт”

Email: elp@belozersky.msu.ru
Россия, Москва

М. А. Белозерский

Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского

Email: elp@belozersky.msu.ru
Россия, Москва

Е. Н. Элпидина

Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского

Email: elp@belozersky.msu.ru
Россия, Москва

Список литературы

  1. de Souza A.N., Martins M.L. // Braz. J. Microbiol. 2001. V. 32. № 4. P. 271–275. https://doi.org/10.1590/S1517-83822001000400003
  2. Zambare V.P., Nilegaonkar S.S., Kanekar P.P. // World J. Microbiol. Biotechnol. 2007. V. 23. P. 1569–1574. https://doi.org/10.1007/s11274-007-9402-y
  3. Abidi F., Limam F., Nejib M.M. // Process Biochem. 2008. V. 43. № 11. P. 1202–1208. https://doi.org/10.1016/ j.procbio.2008.06.018
  4. Kumar C.G., Takagi H. // Biotechnol. Adv. 1999. V. 17. № 7. P. 561–594. https://doi.org/10.1016/s0734-9750(99)00027-0
  5. Singh J., Vohra R., Sahoo D. // Biotechnol. Lett. 1999. V. 21. P. 921–924. https://doi.org/10.1023/A:1005502824637
  6. Anwar A., Saleemuddin M. // Arch. Insect. Biochem. Physiol. 2002. V. 51. № 1. P. 1–12. https://doi.org/10.1002/arch.10046
  7. Vinokurov K.S., Elpidina E.N., Oppert B., Prabhakar S., Zhuzhikov D.P., Dunaevsky Y.E., Belozersky M.A. // Comp. Biochem. Physiol. B. Biochem. Mol. Biol. 2006 b. V. 145. № 2. P. 138–146. https://doi.org/10.1016/j.cbpb.2006.05.004
  8. Sanatan P.T., Lomate P.R., Giri A.P., Hivrale V.K. // BMC Biochem. 2013. V. 14. https://doi.org/10.1186/1471-2091-14-32
  9. Sharifi M., Chitgar M.G., Ghadamyari M., Ajamhasani M. // Romanian Journal of Biochemistry. 2012. V. 49. № 1. P. 33–47.
  10. Mahdavi A., Ghadamyari M., Sajedi R.H., Sharifi M., Kouchaki B. // J. Insect Sci. 2013. V. 13. https://doi.org/10.1673/031.013.8101
  11. Zou Z., Lopez D.L., Kanost M.R., Evans J.D., Jiang H. // Insect Mol. Biol. 2006. V. 15. № 5. P. 603–614. https://doi.org/10.1111/j.1365–2583.2006.00684.x
  12. Choo Y.M., Lee K.S., Yoon H.J., Lee S.B., Kim J.H., Sohn H.D., Jin B.R. // Eur. J. Entomol. 2007. V. 104. № 1. P. 1–7. https://doi.org/10.14411/eje.2007.001
  13. Jiang H., Vilcinskas A., Kanost M.R. // Adv. Exp. Med. Biol. 2010.V. 708. P. 181–204. https://doi.org/10.1007/978-1-4419-8059-5_10
  14. Kanost M.R., Jiang H. // Curr. Opin. Insect Sci. 2015. V. 11. P. 47–55. https://doi.org/10.1016/j.cois.2015.09.003
  15. Cao X., Jiang H. // Insect Biochem. Mol. Biol. 2018. V. 103. P. 53–69. https://doi.org/10.1016/j.ibmb.2018.10.006
  16. Cao X., Gulati M., Jiang H. // Insect Biochem. Mol. Biol. 2017. V. 88. P. 48–62. https://doi.org/10.1016/j.ibmb.2017.07.008
  17. Lin H., Xia X., Yu L., Vasseur L., Gurr G. M., Yao F., Yang G., You M. // BMC Genomics. 2015. V. 16. Article 1054. https://doi.org/10.1186/s12864-015-2243-4
  18. Elpidina E.N., Tsybina T.A., Dunaevsky Y.E., Belozersky M.A., Zhuzhikov D.P., Oppert B. // Biochimie. 2005. V. 87. № 8. P. 771–779. https://doi.org/10.1016/j.biochi.2005.02.013
  19. Sato P.M., Lopes A.R., Juliano L., Juliano M.A., Terra W.R. // Insect Biochem. Mol. Biol. 2008. V. 38. № 6. P. 628–633. https://doi.org/10.1016/j.ibmb.2008.03.006
  20. Perona J.J., Tsu C.A., Craik C.S., Fletterick R.J. // Biochemistry. 1997. V. 36. № 18. P. 5381–5392. https://doi.org/10.1021/bi9617522
  21. Bown D.P., Wilkinson H.S., Gatehouse J.A. // Insect Biochem. Mol. Biol. 1997. V. 27. № 7. P. 625–638. https://doi.org/10.1016/s0965-1748(97)00043-x
  22. Tsu C.A., Perona J.J.., Schellenberger V., Turck C.W., Craik C.S. //J. Biol. Chem. 1994. V. 269. № 30. P. 19565–19572.
  23. Tsu C.A., Craik C.S. // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. № 19. P. 11563–11570. https://doi.org/10.1074/jbc.271.19.11563
  24. Whitworth S.T., Blum M.S., Travis J. // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. № 23. P. 14430–14434. https://doi.org/10.1074/jbc.273.23.14430
  25. Houben-Weyl Methods of Organic Chemistry: Synthesis of Peptides and Peptidomimetics, 4th Ed. V. E22a. In: / Eds. Goodman M., Toniolo C., Moroder L., Felix A. Stuttgart, NY: Thieme, 2004. 785 p.
  26. Горбунов А.А., Акентьев Ф.И., Губайдуллин И.И., Жиганов Н.И., Терещенкова В.Ф., Элпидина Е.Н., Козлов Д.Г. // Биотехнология. 2020. Т. 36. № 6. С. 136–145.
  27. Frugoni J.A.C. // Gazz. Chem. Ital. 1957. V. 87. P. 403–407.
  28. Elpidina E.N., Semashko T.A., Smirnova Y.A., Dvoryakova E.A., Dunaevsky Y.E., Belozersky M.A., et al. // Anal. Biochem. 2019. V. 567. P. 45–50. https://doi.org/10.1016/j.ab.2018.12.001
  29. Krahn J., Stevens F.C. // Biochemistry. 1970. V. 9. № 13. P. 2646–2652. https://doi.org/ 10.1021/bi00815a013
  30. De Vonis Bidlingmeyer U., Leary T.R., Laskowski M.Jr. // Biochemistry. 1972. V. 11. № 17. P. 3303–3310. https://doi.org/10.1021/bi00767a028
  31. Vinokurov K.S., Elpidina E.N., Oppert B., Prabhakar S., Zhuzhikov D.P., Dunaevsky Y.E., Belozersky M.A. // Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol. 2006 a. V. 145. № 2. P. 126–137. https://doi.org/10.1016/j.cbpb.2006.05.005
  32. Zhu Y.C., Baker J.E. // Arch. Insect. Biochem. Physiol. 2000. V. 43. № 4. P. 173–184. https://doi.org/10.1002/(SICI)1520-6327(200004) 43:4<173:: AID-ARCH3>3.0.CO;2-8
  33. Mazumdar-Leighton S., Broadway R.M. // Insect Biochem. Mol. Biol. 2001. V. 31. № 6–7. P. 633–644. https://doi.org/10.1016/s0965-1748(00)00168-5
  34. Herrero S., Combes E., Van Oers M.M., Vlak J.M., de Maagd R.A., Beekwilder J. // Insect Biochem. Mol. Biol. 2005. V. 35. № 10. P. 1073–1082. https://doi.org/10.1016/j.ibmb.2005.05.006
  35. Tamaki F.K., Padilha M.H., Pimentel A.C., Ribeiro A.F., Terra W. R. // Insect Biochem. Mol. Biol. 2012. V. 42. № 7. P. 482–490. https://doi.org/10.1016/j.ibmb.2012.03.005
  36. Matsuoka T., Kawashima T., Nakamura T., Yabe T. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2017. V. 81. № 7. P. 1401–1404. https://doi.org/10.1080/09168451.2017.1318698
  37. Gráf L., Szilágyi L., Venekei I. Chapter 582 – Chymotrypsin. Handbook of Proteolytic Enzymes. 3 Ed. In: / Eds. Rawlings N. D., Salvesen G. Academic Press, 2013. P. 2626–2633. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-382219-2.00582-2
  38. Botos I., Meyer E., Nguyen M., Swanson S.M., Koomen J.M., Russell D.H, Meyer E.F. // J. Mol. Biol. 2000. V. 298. № 5. P. 895–901. https://doi.org/10.1006/jmbi.2000.3699
  39. Perona J.J., Craik C.S. // Protein Sci. 1995. V. 4. № 3. P. 337–360. https://doi.org/10.1002/pro.5560040301

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Последовательность rProSerP38. R| – место процессинга трипсином (отщепление пропептида). Красным отмечены аминокислотные остатки активного центра (HDS), голубым – субстрат-связывающего субсайта S1 (GGD).

Скачать (16KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Зависимость активности процессированного препарата рекомбинантной пропептидазы rProSerP38 T. molitor от времени процессинга. Планки погрешностей отражают доверительный интервал.

Скачать (12KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Стабильность зрелой формы рекомбинантной пептидазы rSerP38 T. molitor. Планки погрешностей отражают доверительный интервал.

Скачать (11KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Стабильность процессированной рекомбинантной пептидазы rProSerP38 T. molitor. Планки погрешностей отражают доверительный интервал.

Скачать (11KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Очистка процессированного препарата рекомбинантной пропептидазы rProSerP38 T. molitor методом металл-хелатной аффинной хроматографии на Ni2+-NTA агарозе: 1 – активность фермента по субстрату Suc-AAPF-pNA, 2 – градиент концентрации имидазола (мМ).

Скачать (14KB)
Метаданные
7. Рис. 6. Результат постэлектрофоретического тестирования активности по флуорогенному субстрату Suc-AAPF-AMC: 1 – препарат rProSerP38 до процессинга; 2 – препарат пептидазы rProSerP38, процессированной трипсином; 3 – объединенные фракции элюата 16–18 до обессоливания; 4 – объединенные фракции 16–18 после обессоливания и концентрирования.

Скачать (13KB)
Метаданные
8. Рис. 7. Стабильность процессированного и очищенного препарата пептидазы rProSerP38 T. molitor. Планки погрешностей отражают доверительный интервал.

Скачать (10KB)
Метаданные
9. Рис. 8. Стабильность зрелой формы рекомбинантной пептидазы rSerP38 T. molitor в присутствии БСА.

Скачать (12KB)
Метаданные
10. Рис. 9. Влияние рН на активность рекомбинантной пептидазы rSerP38 T. molitor.

Скачать (10KB)
Метаданные
11. Рис. 10. Влияние рН на стабильность рекомбинантной пептидазы rSerP38 T. molitor (7 нМ): а) без БСА, инкубация 30 мин; б) в присутствии БСА (0.62 мкМ).

Скачать (24KB)
Метаданные
12. Рис. 11. Активность рекомбинантной пептидазы rSerP38 T. molitor по отношению к различным субстратам.

Скачать (28KB)
Метаданные
13. Рис. 12. Зависимость скорости ферментативной реакции гидролиза пептидазой rSerP38 субстратов: а) Glp-AAF-pNA (0.1–1.0 мкМ); б) Suc-AAPF-pNA (0.1–1.0 мМ); в) Ac-Y-pNA (0.1–3.0 мМ).

Скачать (48KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».