Obtaining analogues of fermented milk products from seed meal using new strains of lactic acid bacteria

Full Text

В последнее время существенно возрос интерес к получению растительных аналогов молока и кисломолочных продуктов на их основе в связи с высоким содержанием белка и ненасыщенных жирных кислот и отсутствием лактозы и холестерина, что привлекательно для определенных групп населения [1, 2]. Источниками аналогов молока и получаемых из него ферментированных продуктов являются ценные для пищевых производств семена масличных культур, орехи, бобы [3–5]. Основные стадии получения аналогов молока включают измельчение растительного сырья, экстракцию водными растворами, удаление крупных частиц [6–8].

Растительные экстракты с хорошим содержанием белка, витаминов, минеральных компонентов и микроэлементов – походящие субстраты для сквашивания монокультурами или консорциумами молочнокислых бактерий (МКБ) родов: Lactobacillus (L. acidophilus, L. brevis, L. helveticus, L. delbrueckii); Lacticaseibacillus (L. сasei) и Levilactobacillus (L. brevis), Streptococcus (Str. salivarius) и получения ферментированных напитков [9, 10]. Их свойства определяются множеством параметров, в том числе, составом исходного растительного сырья, его предварительной подготовкой и самими микроорганизмами – агентами сквашивания.

Общим и существенным ограничением для массового получения новых ферментированных напитков становится ценность цельных семян для пищевой и перерабатывающей промышленности, поэтому актуален поиск доступного и подходящего сырья. Таким исходным сырьем может быть шрот тыквенных семян (pumpkin seed meal) с относительно богатым составом, высоким содержанием белка и ненасыщенных жирных кислот и других компонентов [11], который используется, в основном, в качестве кормовой добавки для сельскохозяйственных животных [12]. Судя по оценкам ежегодного урожая тыквы в десятки миллионов тонн [12] и растущему мировому производству тыквенного масла, шрот, получаемый при его производстве, является массовым отходом. Однако к настоящему времени не описаны исследования по получению аналогов кисломолочных продуктов непосредственно из экстракта шрота тыквенных семян.

Данная работа была направлена на выделение и подбор штаммов молочнокислых бактерий – наиболее эффективных агентов сквашивания экстракта, поскольку применяемые культуры МКБ не обязательно адаптированы к новым субстратам, что было показано ранее [13, 14]. Среди источников выделения потенциально ценных штаммов представляет интерес кумыс – национальный напиток в регионах Азии, с высоким титром бактерий и дрожжей (5 × 10⁷ КОЕ/мл и 1–2 × 10⁷ КОЕ/мл) [15], а также широким разнообразием МКБ, зависящим от места происхождения и способа приготовления [16, 17].

Цель работы – выделение новых штаммов молочнокислых бактерий из кумыса и использование их для ферментации экстракта шрота тыквенных семян, подбор оптимальной схемы получения лактоферментированого напитка и его характеристика.

МЕТОДИКА

В качестве исходного объекта для выделения МКБ было отобрано 7 образцов кумыса, произведенного в летний период в Башкирии (Россия). Образцы шрота семян тыквы урожая 2020 г. были предоставлены предприятием “Маслодел”, Россия.

Аликвоты кумыса разводили в серии десятикратных разведений в стерильной воде и высевали на плотную питательную среду MRS (“Merck KGaA”, Германия) с рН 5.7 или сусло-агар. Чашки с посевами инкубировали при 37°C в течение 2 сут.

Принадлежность выросших и пересеваемых колоний к молочнокислым бактериям определяли по тесту на сквашивание стерильного обезжиренного молока. Рабочие культуры МКБ, выращенные в жидкой среде MRS, хранили при 4°C. Численность жизнеспособных клеток МКБ оценивали по титрам колониеобразующих единиц (КОЕ) после высевов на чашках с MRS-агаром и инкубации при 37°C в течение 48 ч. Наиболее ценные для использования при производстве кисломолочных продуктов штаммы были депонированы в ЦКП “_{Коллекция} уникальных и экстремофильных _{микроорганизмов} различных физиологических групп биотехнологического назначения” (UNIQEM) ФИЦ Биотехнологии РАН под регистрационными номерами UQM 41618, UQM 41619, UQM 41620 и хранятся в криоконсервированном виде.

Морфологию клеток выделенных изолятов МКБ изучали при просмотрах препаратов под микроскопом Axioplan (“Carl Zeiss”, Германия). Резистентность к различным значениям рН оценивали по результатам роста на стандартно применяемой MRS и других жидких средах (молоке, слабощелочных белковых экстрактах). Кислотность измеряли с использованием pH-метра 150 МИ (ООО “Измерительная техника”, Россия).

Выделенные штаммы идентифицировали по результатам анализа нуклеотидной последовательности фрагментов гена 16S рРНК, выполненного в ЦКП “Биоинженерия” ФИЦ Биотехнологии РАН в соответствии с ранее описанными методиками [18].

Схема подготовки сырья для сквашивания включала: измельчение шрота тыквенных семян до муки на лабораторной мельнице Stegler LM-1000, экстракцию компонентов щелочными растворами рН от 6.2 до 9.0, при нагревании до 90°C (30 мин) с перемешиванием, удаление нерастворимых частиц фильтрованием. Для оптимальной экстракции были подобраны соотношения экстрагента и муки. Для удаления посторонней микрофлоры полученные экстракты подвергали термообработке при 0.5 атм 30 мин и затем охлаждали до 37°C.

Экстракты шрота семян инокулировали новыми штаммами из кумыса и штаммами L. acidophilus, L. casei, L. bulgaricus, Streptococcus sp. из коллекции лаборатории выживаемости микроорганизмов Института микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН. Культуры для инокуляции выращивали на стерильном обезжиренном молоке в течение 7–24 ч при 37°C и вносили в среду в соотношении 0.3–0.5% (об./об.) до достижения начального титра клеток 10⁴ КОЕ/мл. В контрольных экспериментах вместо экстракта из шрота использовали обычное стерильное молоко. Сквашивание экстрактов и молока осуществляли в статических условиях (без перемешивания) при 37°C в течение 7–24 ч.

Массу сухих веществ в образцах, полученных при сквашивании экстракта из шрота, цельного молока, а также муки тыквенных семян, определяли гравиметрически с высушиванием при 105°C до постоянного веса. Общее содержание белка определяли методом Лоури или по сумме аминокислот. Содержание лактозы определяли методом, основанным на ферментативном гидролизе и колориметрическом определении продуктов его расщепления [19]. Содержание пищевых волокон (г/100 г) определяли гравиметрическим методом после их осаждения в этаноле и высушивании [20].

Образцы продуктов сквашивания для последующего анализа высушивали на лиофильной установке FreeZone (“Labconco”, США) на базе ЦКП “Коллекция UNIQEM” в вакууме при –80^оС. Аминокислотный состав определяли с использованием жидкостного хроматографа фирмы “Hitachi” (Япония) в стандартном режиме анализа белковых гидролизатов с сульфированным сополимером стирола с дивинилбензолом и ступенчатым градиентом натрий-цитратного буферного раствора с возрастающим значением рН и молярности. Липиды из лиофилизированных образцов экстрагировали смесью хлороформ: солянокислый метанол (2: 1) (Methanolic-HCl 0.5, н “Supelco”, Германия), по методу Фолча. Жирнокислотный состав липидов исследовали на хроматографе c масс-детектором Simadzu GCMS‐QP2010 Ultra (“Shimadzu”, Япония). Исследования аминокислотного состава и профиля жирных кислот осуществляли на базе ЦКП “Промышленные биотехнологии” ФИЦ Биотехнологии РАН и НИИ Физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского МГУ. Базовые эксперименты проводили в трехкратной повторности.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

По результатам посевов 7 образцов башкирского кумыса на MRS и сусло-агар установлена его высокая общая обсемененность бактериями (5.0 ± 0.7) × 10⁸ КОЕ/мл и дрожжами (1.5 ± 0.7) × 10⁷ КОЕ/мл, что соответствовало показателям численности микроорганизмов в кумысе из других регионов [15]. Доля МКБ в исследуемом кумысе варьировала от 46 до 68%, а средняя численность – от 2.3 × 10⁸ КОЕ/мл до – 3.4 × 10⁸ КОЕ/мл, что выявлено по тесту на сбраживание стерильного молока. Путем многократных (3–5 раз) пассажей на MRS-агаре было отобрано 50 чистых изолятов МКБ, которые инокулировали в стерильное молоко и адаптировали к новому субстрату – экстракту из шрота тыквенных семян. Все выделенные из кумыса изоляты были способны сквашивать экстракты с разной скоростью при 37°C в течение 7–24 ч. По наилучшим показателям скорости роста и органолептическим свойствам полученных продуктов было отобрано три новых штамма, которые депонированы в коллекцию UNIQEM под номерами UQM 41618, UQM 41619, UQM 41620.

Отобранные МКБ были представлены палочковидными неспорообразующими неподвижными одиночными или собранными в цепочки клетками и росли при 27–37°C с образованием белого осадка в жидких средах. По результатам молекулярно-генетической _{идентификации} путем анализа фрагмента гена 16S рРНК была установлена принадлежность штаммов к роду Lacticaseibacillus, недавно выведенному из р. Lactobacillus и валидно описанному [21]. Штаммы оказались наиболее близкими к L. rhamnosus и L. casei, судя по показателям сходства их последовательностей на 99.93 и 99.65% с известными депонированными последовательностями NR_113332.1 и NR_041893.1 соответственно. По результатам филогенетического анализа установлено высокое родство штаммов UQM 41618, UQM 41619 и UQM 41620 между собой и с типовым штаммом Lacticaseibacillus rhamnosus (рис. 1). Важной особенностью выделенных штаммов Lacticaseibacillus была толерантность к изменениям рН среды с верхним пределом до 9.5. Оптимальный диапазон рН для роста лактобацилл находится в пределах 5.5–6.2 [22], толерантность к повышению щелочности среды известна, а верхний предел рН варьировал у разных видов Lactobacillus и даже штаммов [23]. Таким образом, из кумыса были выделены новые изоляты молочнокислых бактерий, потенциал использования которых рассмотрен ниже.

 

Рис. 1. Результаты идентификации штаммов по последовательностям фрагмента гена 16S рРНК.

 

По эффективности сквашивания шрота тыквенных семян новыми штаммами МКБ, а также другими заквасками, установлена необходимость оптимизации первичных стадий получения аналогов молока. Использование в качестве экстрагента воды с близким к нейтральному значением рН, достаточное для получения аналогов молока из цельных семян или орехов [1, 24], оказалось неэффективным для тыквенного шрота: водные экстракты не сквашивались МКБ, что, по-видимому, объяснялось низким выходом белка. Использование щелочной экстракции, как в работах по получению аналогов молока из семян люпина [25], оказалось более эффективным для тыквенного шрота только после подбора оптимальных условий. Так, подщелачивание суспензии муки шрота с исходного значения рН 6.2 до pH 7.5 улучшало сквашиваемость; однако образующийся продукт обладал неудовлетворительными органолептическими признаками. Повышение рН экстрагируемой смеси до 9.0 обеспечивало получение субстрата, эффективно сквашиваемого при 37°C в течение 10 ч новыми штаммами МКБ из кумыса с образованием продукта однородной и плотной консистенции с кисломолочным вкусом и запахом. Использование других штаммов МКБ: L. acidophilus, L. casei, L. bulgaricus, Streptococcus sp., оказалось менее эффективным: сбраживание проходило в течение 24 ч, титр МКБ не превышал 10⁵ КОЕ/мл, а конечный продукт не обладал хорошими качествами. Для улучшения экстракции также были подобраны оптимальные соотношения шрот-экстрагент. Эти и остальные технологические параметры экстракции были ранее описаны в работе [26].

В связи с обсемененностью тыквенных семян бактериями и грибами, судя, например, по средним кумулятивным данным ~ 1.4 × 10⁵ КОЕ/г [27], в схему подготовки субстрата для сквашивания была включена стадия термической обработки, без которой происходила порча конечного продукта. Установлено, что режимы термической обработки при 80–85, 90–95°C в течение 10 мин были недостаточными для уничтожения посторонней микрофлоры; необходимым был более длительный (30 мин) прогрев при 115°C. Таким образом, была подобрана оптимальная схема получения экстракта из тыквенного шрота для эффективного сквашивания, основные элементы которой с учетом модификаций приведены на рис. 2.

 

Рис. 2. Базовая схема получения лактоферментированного напитка на основе шрота тыквенных семян. Разработанные модификации выделены жирным шрифтом.

 

Важным свойством, определившим выбор этого исходного сырья для подготовки пригодного субстрата, было высокое содержание (около 30%) общего белка (рис. 3). По данным, полученным методом Лоури, степень экстракции белка из муки шрота в подобранных оптимальных условиях соответствовала 50%, и его содержание было достаточным для развития МКБ. Штаммы Lacticaseibacillus sp. UQM 41618, UQM 41619 и UQM 41620 эффективно сквашивали экстракт семян тыквенного шрота: численность МКБ возрастала с 10⁴ КОЕ/мл с момента инокуляции до 10⁸ КОЕ/мл после 10 ч инкубации при 37°C в стационарных условиях. Во время роста происходило подкисление среды с 8.5–9.5 до нейтральных рН. Важно отметить, что численность жизнеспособных молочнокислых бактерий в сквашенном продукте сохранялась на стабильном уровне (10⁸ КОЕ/мл) при хранении в течение 1 месяца при 4°C. В образующихся продуктах сквашивания происходило увеличение доли водорастворимых белков в 1.7 раза и снижение в 1.3 доли щелочерастворимых белков. Кроме того повышалась доля незаменимых аминокислот и ценных ненасыщенных жирных кислот (ННЖК) по сравнению с исходным шротом семян (табл. 1, рис. 3). Таким образом, экстракт из шрота тыквенных семян может быть походящим субстратом для сквашивания новыми отобранными штаммами МКБ. Из анализа работ по получению кисломолочных продуктов из растительного сырья, тыквенный шрот пока использовали лишь в качестве компонента смеси с верблюжьим молоком [28].

 

Рис. 3. Состав шрота семян тыквы (1), продукта сквашивания шрота тыквенных семян (2) и кисломолочного продукта (3).

 

Таблица 1_. Аминокислотный состав белка и жирнокислотный состав липидов муки из шрота тыквенных семян, продукта сквашивания экстрактов шрота и стерилизованного молока выделенными штаммами МКБ (г/100 г)

Компоненты	Мука шрота	Продукт из экстракта шрота	Продукт из молока
Аминокислоты
Аспарагиновая кислота	2.96	3.8847	1.997
Треонин*	0.998	1.2066	0.371
Серин	1.673	2.5253	0.186
Глицин	6.188	8.9396	5.512
Пролин	1.316	1.609	2.549
Глутаминовая кислота	1.843	2.5498	0.557
Аланин	1.485	2.3934	0.908
Цистеин	0.332	0.2332	0.243
Валин*	1.579	2.1538	1.762
Метионин*	0.603	0.5759	0.66
Изолейцин*	1.281	1.4658	1.592
Лейцин*	2.419	3.0945	2.578
Тирозин	1.093	1.6608	1.271
Фенилаланин*	1.733	2.0485	1.271
Лизин*	1.236	1.5921	2.087
Гистидин	0.78	0.9823	0.714
Аргинин	5.353	6.8827	0.953
Насыщенные жирные кислоты
Капроновая кислота	0.0	0.0	2.5
Каприловая кислота	0.0	0.0	1.6
Каприновая кислота	0.0	0.0	3.2
Масляная кислота	0.0	0.0	4.7
Миристиновая кислота	0.18	0.24	10.28
Пальмитиновая кислота	17.20	17.50	30.3
Стеариновая кислота	9.05	7.92	13.5
Маргариновая кислота	0.18	0.17	0.0
Ненасыщенные жирные кислоты
Линолевая кислота*	40.53	53.04	3.5
Олеиновая кислота	30.78	19.54	25.5
Пальмитолеиновая кислота	0.21	0.17	1.5
Петрозелиновая кислота	1.87	1.42	0.0

* Незаменимые компоненты.

 

Выявлены следующие преимущества нового сквашенного продукта на основе тыквенного шрота по сравнению с кисломолочным продуктом, полученным с использованием тех же штаммов МКБ. Новый продукт характеризовался повышенным содержанием белка (в 1.7 раз) и ценных пищевых компонентов, особенно ряда незаменимых аминокислот и полиненасыщенной линолевой кислоты.

Другими важными свойствами нового продукта было высокое соотношение ННЖК/НЖК, отсутствие лактозы и холестерина (что неудивительно с учетом состава исходного сырья), наличие пищевых волокон (рис. 3, табл. 1) и хорошие вкусовые качества. Результаты проведенных анализов общего состава шрота тыквенных семян и суммарного содержания полиненасыщенных жирных кислот (рис. 3, табл. 1) соответствуют литературным данным [29]. По вышеперечисленным свойствам полученный лактоферментированный напиток может быть привлекателен для определенных групп населения. Таким образом, на примере шрота тыквенных семян разработан оригинальный подход к валоризации массового пищевого отхода маслоэкстракционной промышленности и разработана простая и эффективная схема получения экстракта, пригодного для сквашивания, и получения аналогов кисломолочных продуктов с полезными свойствами. Полученные результаты свидетельствуют о высоком адаптационном потенциале новых штаммов лактобацилл к новым ростовым условиям и флуктуациям рН и способности сохранять выживаемость при хранении.

About the authors

A. V. Sinelnikov

Peoples’ Friendship University of Russia (RUDN University); Vinogradsky Institute of Microbiology, Federal Research Center of Biotechnology of Russian Academy of Sciencies

Author for correspondence.
Email: sinelnikov11@ya.ru
Russian Federation, Moscow; Moscow

T. V. Kolganova

Scriabin Institute of Bioengineering, Federal Research Center of Biotechnology of Russian Academy of Sciencies

Email: sinelnikov11@ya.ru
Russian Federation, Moscow

R. V. Ulanova

Vinogradsky Institute of Microbiology, Federal Research Center of Biotechnology of Russian Academy of Sciencies

Email: sinelnikov11@ya.ru
Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files