Динамика уровней шаперонов HSP70 цитоплазмы и HSP70B хлоропластов при тепловом стрессе отличается у трех видов тыквы с разной устойчивостью к стрессам

Полный текст

Растения постоянно подвергаются воздействию различных видов биотических и абиотических стрессов, негативно влияющих на их рост, развитие и продуктивность. Первая линия защиты клеток, подвергшихся воздействию стрессовых условий представлена шаперонной системой. Белки теплового шока (HSP), обладающие шаперонной активностью, являются высоко консервативными и в зависимости от молекулярной массы их разделяют на семейства, которые включают HSP100, HSP90, HSP70, HSP60 и малые HSP [1, 2].

Среди семейств белков теплового шока доминирующую роль играют плейотропные белки – шапероны HSP70, выполняющие разнообразные функции в клетке [3–5]. Шапероны HSP70 участвуют в фолдинге белков, повышении активности антиоксидантной системы, транслокации белков через мембраны, удалении поврежденных белков, предотвращении денатурации белков и др. HSP70 обнаружены практически во всех клеточных компартментах (ядре, цитоплазме, эндоплазматическом ретикулуме, хлоропластах и митохондриях) [3, 4, 6].

Благодаря шаперонной активности, белки теплового шока являются универсальными цитопротекторами. Обладая такими разнообразными функциями, шапероны HSP70s играют важную роль при различных стрессах, что является ключевым фактором для роста и развития растений. Поэтому это семейство генов является отличным кандидатом для повышения устойчивости к множественным стрессам [7].

Показана жизненно важная роль шаперонов HSP70 в реакциях как на абиотические, так и на биотические стрессы [8]. Недавно появились сообщения о более высоком уровне экспрессии HSP70 у устойчивых к болезням сортов? подсолнечника, по сравнению с восприимчивыми растениями [9]. Повышенные уровни HSP70 связаны с устойчивостью к засухе у риса [10], Arabidopsis [11], табака [12] сахарного тростника [13] и хризантемы [14].

Способность ослаблять повреждающие эффекты и сохранять клеточный гомеостаз растений, подвергающихся различным неблагоприятным воздействиям, делает некоторые HSP особенно привлекательными для повышения устойчивости к множественным или даже комбинированным стрессам. Использование методов генетической инженерии и геномного редактирования позволяет использовать гены белков HSP для повышения устойчивости растений к стрессовым условиям. Так, cверхэкспрессия цитоплазматических генов HSP70-1 HSP70-2 перца Capsicum annuum в трансгенных клетках Arabidopsis привела к повышенной термотолерантности у Arabidopsis [15]. Эти результаты иллюстрируют важность и значение изучения HSP для практического использования. Однако необходимы дальнейшие исследования, которые позволят оценить функции HSP для создания желаемых признаков у конкретных культур. Механизм ответа клеток растений на тепловой стресс представляет собой сложную систему, и явное участие HSP70 в механизме термотолерантности нуждается в дальнейшем изучении.

Тыква – это широко культивируемая по всему миру овощная культура. Культура богата витаминами, минералами и антиоксидантами [16], имеет высокую пищевую и лекарственную ценность, а ее семена являются хорошим источником для получения масла [17]. Сравнительного изучения шаперонов HSP70 цитоплазмы и HSP70B хлоропластов у трех видов тыквы, преимущественно возделываемых в России, не проводилось.

В связи с угрозой глобального потепления и изменения климата проводятся опыты по созданию трансгенных растений, устойчивых к тепловому стрессу и повышенной температуре для выращивания. По-видимому, положительных результатов в этом направлении можно достичь, создавая растения с повышенной экспрессией генов белков теплового шока [18].

Сегодня свойствам и функциям белков теплового шока в живых организмах посвящено большое количество научных работ, проводимых в разных странах мира. Большинство исследований проводится на белках теплового шока цитоплазмы, в то время как белки хлороластов изучены намного меньше. Особый интерес представляет изучение белков HSP70B хлоропластов в связи с их важной ролью в защите фотосинтетического аппарата. Интерес к шаперонам, скорее всего, будет лишь возрастать – настолько необычными, незаменимыми и важными для жизни растений являются, как показывают исследования, эти белки [1, 2]

Цель данной работы – изучить динамику уровней белков теплового шока HSP70 цитоплазмы и HSP70B хлоропластов при тепловом стрессе в клетках трех видов тыквы семейства Cucurbita – C. maxima Duchesne, C. pepo L. и C. moschata Duchesne, различающихся по устойчивости к стрессам окружающей среды.

Методика

Объект исследования. В качестве объектов исследования нами выбраны три наиболее распространённых на территории России вида тыквы – крупноплодная (Cucurbita maxima Duchesne) сорт Мраморная, твердокорая (Cucurbita pepo L.) сорт Кустовая оранжевая и мускатная (Cucurbita moschata Duchesne) и сорт Витаминная. Тыква в качестве объекта исследования была выбрана нами потому, что три указанных выше вида имеют различную устойчивость к неблагоприятным условиям (Круг, 2000). C. maxima и C. pepo характеризуются большей устойчивостью к неблагоприятным условиям, особенно тепловому стрессу, чем C. moschata [19].

Растения выращивали в климатической камере в следующих условиях освещения: 16 ч свет/8 ч ночь при 25°C в дневное время/16°C в ночное. Молодые 14-дневные растения тыквы делили на две группы: 1) растения оставляли в нормальных благоприятных для роста условиях; 2) растения подвергали воздействию теплового стресса – 38°C в течение 2 ч. После обработки листья собирали и использовали для анализа или хранили при –80°C для выделения препаратов.

Выделение белка. Для выделения суммарного белка растения замораживали в жидком азоте и растирали в ступке до консистенции пудры. В микропробирку помещали навеску 0.1 г растительного материала и добавляли 1мл буфера, следующего состава: Трис-HCl – 62.5 мМ, pН 6.8; ДДС-Na – 2.5%; 2-меркаптоэтанол – 5%; глицерин – 10%; PMSF – 10 мМ. Пробирки помещали в кристаллизатор со льдом на 10 мин. Затем пробирки прогревали при температуре 90°C в течение 5 мин и центрифугировали при 18000 g и комнатной температуре в течение 15 мин. Надосадочную жидкость собирали и определяли концентрацию белка по методу Бредфорда [20].

Электрофорез белков в ПААГ. Электрофорез белковых препаратов проводили по методу Леммли [21] в 12.5%-ном ПААГ в присутствии ДДС-Na. На одну дорожку наносили 60 мкг белка. После электрофоретического разделения белков в ПААГ гели окрашивали Кумасси ярко-голубым R-250 (0.2%-ный Кумасси R-250; 40%-ный этанол; 5%-ная уксусная кислота).

Вестерн-блот-гибридизация. Для проведения иммунной реакции с помощью электроблотинга белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Для блокирования неспецифических сайтов связывания белков мембраны с иммобилизованными белками инкубировали в блокирующем буфере: 5%-ное сухое обезжиренное молоко в буфере TBST (50 мМ Трис/HCl, рН 7.5; 200 мМ NaCl; 0.1% Tween-20) в течение 1 ч при 4°C на мини-рокер-шейкере MR-1 (“BioSan”, Латвия). Затем добавляли первичные поликлональные кроличьи антитела к HSP70 цитоплазмы (AS08 371; Agrisera) и HSP70B хлоропластов (любезно предоставленные проф. M. Shroda, TU Kaiserslautern, Германия) в разведении 1: 3000 и 1 : 10000 соответственно и оставляли на ночь на мини-рокер-шейкере при 4°C.

Мембраны промывали 2 раза TBST. Далее мембраны снова помещали в блокирующий буфер и добавляли вторичные антитела (антитела козла к иммуноглобулинам кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена, 1 : 20000, AS09 602; “Agrisera”, Швеция). Прокачивали на шейкере в течение 2 ч при комнатной температуре. Мембраны промывали TBST 2 раза по 2 мин, 3 раза по 5 мин.

Использовали высокочувствительный метод иммунодетекции белков ECL (enhanced chemiluminescence) для определения иммобилизованных антигенов.

Раствор для проявления иммунных комплексов наносили на мембрану и регистрацию хемилюминесцентного сигнала проводили в темноте с помощью рентгеновской пленкой Retina Х-ray. Продолжительность экспозиции составляла 1–3 мин. Рентгеновскую пленку проявляли, обрабатывали в программе ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij). Далее в программе Excel проводили обработку данных и построение диаграмм.

Опыты повторяли по крайней мере три раза на независимо выращенных растениях. Количественный анализ уровня HSP проводили с помощью программы ImageJ, Статистический анализ проводили с помощью t-теста Стьюдента [22], используя Microsoft Office Excel 2003. Различия считали достоверными при р < 0.05.

Результаты и их обсуждение

На рис. 1 представлены результаты изучения действия теплового стресса на белки теплового шока Hsp70 цитоплазмы и Hsp70B хлоропластов у трех видов растений тыквы, отличающихся по устойчивость к неблагоприятным условиям окружающей среды (C. maxima Duchesne ≥ C. pepo L. > C. moschata Duchesne) [19].

 

Рис. 1. Содержание белков Hsp70 цитоплазмы и Hsp70B хлоропластов в растениях тыквы мускатной Cucurbita moschata Duchesne (дорожки 2, 3), твердокорой Cucurbita pepo L. (дорожки 4, 5), крупноплодной Cucurbita maxima Duchesne (дорожки 6, 7) в условиях теплового стресса (+) или без (–): а – электрофореграмма белков, окрашенных Кумасси, белковый маркер (дорожка 1); б – иммуноблотинг с антителами к Hsp70 цитоплазмы; в – иммуноблотинг с антителами к Hsp70B хлоропластов.

 

Установлена взаимосвязь между содержанием белков теплового шока HSP70 цитоплазмы и HSP70В хлоропластов и видовой принадлежностью растений тыквы в условиях теплового стресса. Обнаружено, что по сравнению с нормальными условиями в условиях теплового стресса уровень белков HSP70 цитоплазмы и HSP70B хлоропластов у C. pepo и C. maxima повышен, тогда как уровни этих белков у тыквы C. moschata снижены.

Проведены количественные расчеты относительных уровней HSP у трех видов тыквы в условиях теплового стресса по сравнению с необработанными растениями (рис. 2). При стрессе отмечено значительное повышение уровней белков теплового шока в клетках растений тыквы C. maxima – уровень HSP70 в цитоплазме возрос в 3.6 раза, а уровень HSP70В хлоропластов – в два раза. Тепловой стресс вызывал увеличение в 1.7 раза уровень цитоплазматического шаперона HSP70 в клетках растений тыквы C. pepo, а значимого изменения уровня белка HSP70В не отмечено. Однако в результате действия теплового стресса на растения тыквы C. moschata выявлено уменьшение уровней HSP70 и HSP70В по сравнению с необработанными растениями.

 

Рис. 2. Изменение уровней белков HSP70 цитоплазмы и HSP70В хлоропластов у трех видов тыквы после действия теплового стресса. Уровни белков теплового шока при тепловом стрессе рассчитаны относительно уровня HSP соответствующего вида тыквы в условиях без стресса.

 

Как следует из рис. 2 уровни белков цитоплазмы и хлоропластов изменяются сходным образом у каждого из видов тыквы после действия теплового стресса. Однако у всех изученных видов тыквы уровень белков HSP70 цитоплазмы превышал уровень HSP70B хлоропластов, что, по-видимому, обусловлено в три раза более высоким числом генов HSP70 цитоплазмы (10 генов) по сравнению с HSP70B хлоропластов (3 гена) [23, 24].

Известно, что белки теплового шока способствуют поддержанию гомеостаза в клетках живых организмов, что особенно важно в условиях стресса. На основании этого нами был сделан вывод, что увеличение уровней HSP70 цитоплазмы и HSP70В хлоропластов в клетках растений тыквы C. maxima говорит о ее способности активно противостоять тепловому стрессу и выжить в неблагоприятных условиях. Это согласуется с гипотезой о том, что белки теплового шока семейства HSPs70 являются одними из основных компонентов устойчивости к стрессам [8–10].

Повышение температуры приводило к меньшему повышению уровней белков теплового шока HSP70 в клетках растений тыквы C. pepo, и не вызывало значимого изменения уровня белка HSP70В после воздействия стресса. Это указывает на относительную устойчивость данного вида и увеличение вероятности его гибели при продолжительном действии неблагоприятного фактора по сравнению с C. maxima.

В результате воздействия повышенных температур на растения тыквы вида C. moschata, было выявлено снижение уровней HSP70 и HSP70В по сравнению с необработанными растениями, что указывло не только на низкую способность противостоять стрессу, но и на начавшиеся в клетках деструктивные процессы. Не исключено, что избыточная конститутивная экспрессия генов HSP70 у C. moschata могла также приводить к подавлению синтеза новых HSP или некоторых других белков теплового стресса, как это ранее было показано для клеток экстремальных психрофилов [15].

Определение уровня шаперонов HSP70 цитоплазмы и HSP70В хлоропластов в растениях, не подвергавшихся тепловому стрессу, показало более высокий конститутивный уровень HSP70 у тыкв С. moschata и C. рepo по сравнению C. maxima. Наименьший конститутивный уровень белков теплового шока цитоплазмы HSP70 и хлоропластов HSP70В обнаружен у вида C. maxima и был принят за единицу (рис. 3). Как следует из рисунка конститутивные уровни HSP70 цитоплазмы и HSP70В хлоропластов у тыквы C. moschata в 4.5 и 2 раза выше, а у тыквы C. pepo в 4.3 раза и в 1.5 раза выше по сравнению с тыквой C. maxima соответственно (рис. 3).

 

Рис. 3. Конститутивные уровни белков HSP70 цитоплазмы и HSP70В хлоропластов у трех видов тыквы в условиях без теплового стресса. За 1 ед. принят уровень белков теплового шока HSP70 и HSP70В у растений C. maxima.

 

Анализ полученных данных показал, что существует обратная зависимость между конститутивным уровнем белков теплового шока у растений трех видов тыквы и индуцированным уровнем шаперонов после действия теплового стресса. Таким образом, более высокие конститутивные уровни белков теплового шока в клетках Cucurbita коррелировали с более низкой индукцией HSP70 и HSP70В после воздействия стресса. По-видимому, для устойчивых к тепловому стрессу растений в большей степени важен высокий показатель уровня индукции белков теплового шока, чем более высокий конститутивный уровень шаперонных белков. Предполагают, что высокий конститутивный уровень HSP связан с конститутивно экспрессирующимися HSP70, которые участвуют в поддержании жизненной активности клеток в нормальных условиях, а индуцированные белки HSP это те белки, которые участвуют в защите от окислительного стресса, вызванного тепловым или другими видами стресса [23]. На основании этих результатов можно предположить, что индукция этих белков может рассматриваться как клеточный компенсаторный механизм. Полученные результаты указывают на то, что HSP70 цитоплазмы и HSP70В хлоропластов являются не только защитными белками клетки, но могут служить и маркерами окислительного стресса.

Сходные результаты были получены для клеток зеленых водорослей, выросших в экстремальных условиях Антарктики. В клетках обнаружено повышенное содержание конститутивных HSP70 цитоплазмы [23] и HSP70B хлоропластов [25]. Однако тепловой стресс не вызывал у этих водорослей дальнейшего увеличения содержания белков теплового стресса. По-видимому, клетки теряли способность к дополнительному накоплению HSP или достигнут максимальный уровень этих шаперонов в клетке.

К настоящему времени проведено обширный биоинформатичесий анализ семейств генов HSP в стрессовых условиях, а также при развитии и росте растений. Анализ полностью секвенированных геномов ряда растений позволил обнаружить все предполагаемые гены белков теплового шока, их дублирование и разнообразие, изучить структуру генов – консервативных сайтов, специфических мотивов, интронов, экзонов, сайтов связывания с различными лигандами, а также провести филогенетический анализ и распределение генов HSP на хромосомах [24].

Большинство фундаментальных исследований HSP выполнено на модельном растении A. thaliana [26]. К настоящему времени проведена также характеристика представителей всех семейства HSP у таких видов, как A. thaliana [26], тополь (P. trichocarpa) [27], щетинник (Setaria italica) [28], салат латук (Lactuca sativa) [29], пшеница (Triticum aestivum) [30, 31] и рис (O. sativa) [32] (табл. 1).

 

Таблица 1. Число генов HSP в геноме некоторых видов высших растений

Вид (плоидность)	sHSP	HSP60	HSP70	HSP90	HSP100	Ссылка
Arabidopsis thaliana (2n)	19	18	18	7	7	[26]
Lactuca sativa (2n)	32	22	64	7	7	[29]
Oriza sativa (2n)	29	20	27	8	9	[32]
Populus trichocarpa (2n)	37	28	20	10	5	[27]
Setaria italic (2n)	37	20	27	9	20	[28]
Triticum aestivum (6n)	169	95	114	18	84	[30, 31]
Cucurbita moschata (2n)	–	–	21	–	–	[24]
Capsicum annuum (2n)	–	–	21	–	–	[15]

 

Как следует из табл. 1 наибольшее число представителей HSP выявлено у семейств белков теплового шока – sHSP, HSP60 и HSP70. Недавно был проведен биоинформатическй анализ семейства генов HSP70 тыквы C. moschata, включая филогенетические взаимоотношения, мотивы и структурный анализ генов, дупликацию генов и анализ промоторов. Геномный анализ выявил у C. moschata 21 ген HSP70, которые были разделены на пять групп на основании структурного анализа (от A до E). Предсказана субклеточная локализация представителей семейства HSP70 у C. mocshata. Предположено, что белки в цитоплазме локализованы – 10 HSP70, в хлоропластах – 3, митохондриях – 2, ядре – 2 и эндоплазматическом ретикулуме – 4.

У тыквы обнаружено сходное число генов HSP70 с перцем, тополем и представителями Arabidopsis в отличие от других изученных видов растений (табл. 1). Однако салат-латук, рис, щетинник и пшеница содержали существенно больше генов HSP70 – 64, 27, 27 и 114 соответственно. Разное количество генов одного и того же семейства HSP у разных видов может быть связано с размером генома или эволюционным разнообразием [24]. Показано, что HSP70 локализованные в одном и том же компартменте клетки имеют сходные свойства или функции. Эти белки имеют большое сходство с точки зрения мотивов, количества интронов/экзонов и локализации в соответствующих клеточные компартментах. По-видимому, дупликация генов оказывает решающее влияние на увеличение представителей семейств генов HSP в геноме и на эволюцию генома растений [33]. Предполагают, что увеличение числа генов HSP70 происходило в основном за счет сегментарной, а не тандемной дупликации [24].

Показано, что между двумя видами растений, относящихся к одному семейству (как например огурец и тыква) больше ортологичных генов HSP70, чем между тыквой и Arabidopsis. Однако при этом обнаружено пять общих генов (CmoCh08G006500.1, CmoCh03G004440.1, CmoCh07G010280.1, CmoCh02G009230.1 и CmoCh15G013530.1) между этими тремя видами, что может указывать на консервативную функцию этих генов у разных видов растений [24]. По-видимому, эти пять консервативных генов могут выполнять важные функции в клетке и участвовать в формировании устойчивости растений к стрессам.

Обнаружено, что действие двух близких стрессов засуха и тепловой стресс (чаще всего оба стресса действуют одновременно) индуцирует сходные профили транскрипции гена HSP70. Анализ профилей транскрипции генов HSP растений показал значительное перекрытие между профилями ответа на тепловой стресс и засуху, что указывает на тесное взаимодействие участвующих сигнальных путей в клетке [34]. В клетках C. moschata обнаружено всего 10 генов HSP70 цитоплазмы из них в условиях засухи существенно индуцировалось два гена HSP70 цитоплазмы (CmoCh07G010280.1 и CmoCh10G004900.1). По-видимому, эти индуцируемые гены важны для устойчивости и к тепловому стрессу. Эти два гена похожи по структуре и обеспечивают высокий уровень экспрессии генов этих белков. С помощью транскрипционного анализа показано, что 13 генов из 21 генов HSP70 не изменяют активности в ответ на действие засухи.

У высших растений в отличие от водорослей обнаруживается избыточное число генов HSP70. Полагают, что эти гены образовались в результате дупликации. Функции этих избыточных генов HSP70 еще предстоит изучить. Растения, как организмы, которые не способны передвигаться и избегать стрессов, обладают развитыми механизмами защиты для выживания или адаптации к стрессовым условиям. Например, эволюционный анализ показал, что растения имеют в 3–4 раза больше генов белков, стрессового ответа, например, таких как белки теплового шока, чем другие организмы, в результате дупликации всего генома [24].

Биоинформатический анализ промоторной области показал присутствие различных цис-регуляторных элементов в (up-stream) области перед генами HSP70 цитоплазмы, таких как элементы, реагирующие на стресс и гормоны. Все это указывает на потенциальную роль генов этого семейства в устойчивости к стрессовым воздействиям [24]. Необходимо дальнейшее изучение функций этих идентифицированных HSP70 белков.

В различных компартментах хлоропласта обнаружены три белка Hsp70. В строме хлоропластов выявлены два Hsp70, участвующих в сворачивании денатурированных белков. Помимо роли Hsp70 стромы хлоропластов в рефолдинге денатурированных белков у них обнаружена узкоспециализированная активность по защите фотосистемы II (ФСII) от светового стресса [35]. Предполагают, что один из белков стромы – HSP70B может защищать ФСII от необратимого фотоповреждения или стабилизировать фотоповрежденную ФСII. По-видимому, HSP70B участвует также в биогенезе/поддержание тилакоидных мембран [35]. Третий белок Hsp70 с молекулярной массой 75 кДа., обнаруженный в хлоропластах, локализован с внутренней стороны оболочки хлоропласта. По нашим данным именно белок HSP70B хлоропластов индуцируется тепловым стрессом и может служить индикатором окислительного стресса [2, 35].

Разнообразная роль представителей семейства HSP70 в условиях засухи дает информацию для дальнейшего изучения функций представителей этого жизненно важного семейства, особенно в стрессовых условиях. Основываясь на полученных нами данных и биоинформатическом анализе можно заключить, что два белка HSP70 цитоплазмы и белок HSP70B хлоропластов Cucurbita представляют наибольший интерес для практических целей и согласуются с ранее опубликованными данными о ключевой функции HSP70 в реакциях на стрессовые условия [24]. Это необходимая информация, как для селекции, так и для интродукции – введении в культуру растений как в пределах ареала, так и в новых областях, где эти виды не встречались.

В условиях засухи и состоянии теплового шока растения могут оказаться очень часто поэтому, данное исследование может быть использовано для разработки новых стратегий и инструментов повышения устойчивости к стрессу с помощью генетических манипуляций. Полученные результаты позволят глубже понять молекулярные механизмы, лежащие в основе стрессовых ответов фотосинтезирующих клеток, а также может иметь практическое значение.

ФИНАНСИРОВАНИЕ. Исследование выполнено при поддержке Российского научного фонда (грант № 23 24 00486).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ. Настоящая работа выполнена без привлечения людей или животных в качестве объектов исследований.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

Н. Д. Муртазина

Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” Российской академии наук

Email: nyurina@inbi.ras.ru

Институт биохимии им. А.Н. Баха

Россия, Москва, 119071

Л. С. Шарапова

Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” Российской академии наук

Email: nyurina@inbi.ras.ru

Институт биохимии им. А.Н. Баха

Россия, Москва, 119071

Н. П. Юрина

Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: nyurina@inbi.ras.ru

Институт биохимии им. А.Н. Баха

Россия, Москва, 119071

Список литературы

Дополнительные файлы