Конструирование вариантов рекомбинантного эндолизина LysSi3 для повышения его антибактериальной активности

Полный текст

Перспективным направлением разработки средств профилактики и лечения устойчивых к действию антибиотиков бактериальных инфекций является терапия препаратами на основе литических ферментов бактериофагов – эндолизинов. За счет действия на консервативные структуры клеток риск быстрого развития бактериальной устойчивости к таким препаратам минимален. Широкий спектр действия эндолизинов, выделенных из бактериофагов грамотрицательных бактерий, позволяет использовать такие препараты при лечении системных инфекций различной этиологии, а их способность действовать в отношении бактериальных пленок открывает широкие возможности применения для профилактики и лечения раневых инфекций [1].

Относительно небольшое количество проектов, связанное с использованием рекомбинантных лизинов против грамотрицательных бактерий, обусловлено трудностью преодоления внешней мембраны этих патогенов, что отложило развитие данного направления на несколько лет по сравнению с эндолизинами против грамположительных бактерий. Для повышения пермеабилизующей способности лизинов предложены различные подходы, например, комбинирование эндолизинов с агентами, повышающими проницаемость мембран, таких как ЭДТА и органические кислоты [2].

Другим подходом является получение гибридных молекул лизинов с последовательностями, обеспечивающими активный транспорт лизинов через белковые каналы, пронизывающие мембраны грамотрицательных бактерий. Например, был получен гибридный лизин PyS2-GN4, включающий фрагмент бактериоцина синегнойной палочки PyS2, позволявшего ферменту связываться с поверхностным рецептором бактерий и транслоцироваться через наружную мембрану [3]. Кроме того, известен пример химерной молекулы лизин-колицин А, способной пересекать внешнюю мембрану Escherichia coli с помощью поверхностного рецептора BtuB и порообразующего канала OmpF [4].

Однако наиболее универсальным считается применение методов модификации белка антимикробными пептидами пермеабилизующего действия (АМП). Такой инженерный подход позволил решить проблему проницаемости и значительно расширить спектр действия препаратов на основе ферментов для борьбы с критически важными возбудителями, такими как Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, E. coli и Klebsiella pneumoniae [5, 6]. Модификации нативных полипептидов эндолизинов путем введения в последовательность рекомбинантного белка АМП позволяет такой гибридной молекуле эффективно проникать через наружную мембрану бактериальной клетки к своей мишени – пептидогликану и разрушать его. Пермеабилизующие пептиды неспецифично взаимодействуют с гидрофобными или ионными связями ЛПС наружных мембран и таким образом дестабилизируют мембрану и приводят к ее локальным нарушениям [7]. Спектр известных противомикробных пептидов крайне широк и включает группы, различающиеся по структуре и свойствам [5]. В качестве пептидов используют такие как антимикробный пептид SMAP-29 [8], цекропин A [9], пептид PCNP [10], последовательности, насыщенные гидрофобными аминокислотами [11], и другие. Они значительно различаются по свойствам и спектру действия, но системного исследования влияния модификаций пептидами на свойства гибридных молекул не проводилось. Тем не менее, простая гибридизация АМП на N- или C-конце лизина не всегда приводит к созданию высокоактивного фермента. Для получения вариантов адекватно действующих при низких концентрациях необходимо перебрать широкий спектр комбинаций функциональных доменов, возможность включения линкеров и др.

Цель работы – получение новых бактериолитических ферментов, обладающих высокой активностью в отношении грамотрицательных бактерий, на основе рекомбинантных эндолизинов, модифицированных противомикробными пептидами различных групп, а также исследование влияния вводимых пептидов на in vitro свойства получаемых ферментов.

МЕТОДИКА

Бактериальные штаммы и условия культивирования. В работе были использованы штаммы E. coli для рекомбинантной экспрессии белков, а также клинический изолят A. baumannii, выделенный из мокроты пациента, для исследования свойств ферментов (коллекция лаборатории трансляционной биомедицины НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи). Была проведена оценка устойчивости изолята A. baumannii к противомикробным препаратам по минимальным ингибирующим концентрациям препаратов (МИК) методом серийных микроразведений. Показано, что изолят обладал устойчивостью к ампициллину и хлорамфениколу. Все культуры хранили при –80°C, культивировали в соответствующей среде при 37°C при перемешивании 250 об./мин в течение ночи перед проведением анализов.

Получение генетических конструкций модифицированных вариантов эндолизинов. Выбор пептидов для модификации эндолизина LysSi3 и поиск последовательностей для создания генно-инженерных конструкций проводили с использованием публичных баз данных Database of Antimicrobial Activity and Structure of Peptides (DBAASP) [12] и Antimicrobial peptide database APD3 (https://aps.unmc.edu).

Для получения ферментов, модифицированных противомикробными пептидами (LysSi3-АМП), была использована генетическая конструкция на основе экспрессионного вектора pET-42b (+), кодирующая последовательность эндолизина LysSi3 (pET42b-LysSi3) [13]. Все нуклеотидные последовательности дополнительной вставки, соответствующей пептидам, были сконструированы из олигонуклеотидных праймеров (“GenTerra”, Россия) длиной до 70 нуклеотидов путём их перекрытия (табл. 1). Полученные ПЦР фрагменты нуклеотидной последовательности эндолизина с АМП и вектора сливали методом Гибсона.

 

Таблица 1. Праймеры, используемые для получения конструкций

№	Название конструкции	Праймер	Последовательность использованных олигонуклеотидных праймеров, 5'–3'
1	Вектор (pET42b-LysSi3)	ACPvecF	CGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCT
		ACPR	AGCCAACTCAGCTTCCTTTCGCTAGGCGACCACAGGTTTGCG
2	pET42b-LysSi3-CeA	CeaR	AATcTTcTTgAACAGcTTCCAcTTCTCGAGCTTTGGGTATACACTGTC
		CeaF	AAGTGGAAGCTGTTCAAGAAGATTTAAGGGAATTAGAAGAATGAGTGTGATCGCTAAAC
3	pET42b LysSi3-HIS5	His5R	CTTCTCGTGGAACTTGCGCTTATAGCCGTGATGGCGTTTCGCGTGGCTATCCTCGAGCTTTGGGTATACACTGTCAAG
		His5F	AGCGCAAGTTCCACGAGAAGCACCATAGCCATCGCGGCTATTAAGGGAATTAGAAGAATGAGTGTGATCGCTAAAC
4	pET42b LysSi3-GG3	GG3R	CGCCTTTCAACCACAACTTACCACCCTTCAGCCACAGTTTGCCCTCGAGCTTTGGGTATACACTGTCAAG
		GG3F	GTGGTAAGTTGTGGTTGAAAGGCGGGAAACTGTGGTTAAAGGGCTAAGGGAATTAGAAGAATGAGTGTGATCGCTAAAC

 

Смесь собранных фрагментов ДНК трансформировали в химически компетентные клетки E. coli Top10 (“Invitrogen”, США) методом теплового шока. Клеточную культуру после трансформации высевали на чашки Петри с агаризованной средой 2YT (состав, г/л: пептон – 16.0; дрожжевой экстракт – 10.0, NaCl – 5.0, агар – 15.0), содержащей селективный антибиотик канамицин. Для выросших колоний проверялось наличие нуклеотидного фрагмента исследуемого эндолизина методом ПЦР. Плазмидную ДНК выделяли из культуры бактерий, выращенных в среде 2YT в течение 18–20 ч, набором Plasmid Miniprep (“Евроген”, Россия), согласно протоколу производителя.

Соответствие последовательности полученных конструкций теоретическим подтверждали секвенированием открытой рамки считывания плазмидной ДНК с эндолизином и АМП-модификациями методом Сэнгера с использованием BigDay™ Terminator V3.1 (“Applied Biosystems”, USA). В качестве олигонуклеотидных праймеров для секвенирования использовали lacOseqF и ACPRseq как универсальные праймеры для кольцевого вектора pET42b и хромопротеина, Si3seqF (5'-CAGACGTAGAATGGAAGCT-3′) и Si3R как специфические, комплементарные нуклеотидной последовательности лизина Si3 (5'-CTCGAGCTTTGGGTATACACTGTCAAGA-3′).

Экспрессия модифицированных белков. Полученные химерные конструкции трансформировали методом теплового шока в экспрессионный лабораторный штамм E. coli Rosetta(DE3) (“Novagen”, Германия), после чего нарабатывали биомассу, содержащую лизины в среде 2YT и селективные антибиотики (канамицин и хлорамфеникол) при индукции 1 мМ ИПТГ в течении 3–4 ч.

Очистка белков. Рекомбинантный эндолизин LysSi3 был получен, как описано ранее [13]. Очистку модифицированных белков проводили с помощью двухстадийной хроматографии лизата клеток-продуцентов с использованием катионообменного сорбента SP-sepharose (“GE Healthcare”, США) и гель-эксклюзионного сорбента Superdex 75pg (“GE Healthcare”, США), проводя элюцию в фосфатно-солевом буфере PBS, рН 7.4 (“VWR”, США). Конечную концентрацию белков определяли путем измерения OD₂₈₀ (Implen NanoPhotometer, “IMPLEN”, Германия) с учетом теоретических коэффициентов поглощения. Чистоту полученных препаратов подтверждали с помощью денатурирующего ПААГ-электрофореза. Все белки лиофилизировали и хранили при –80°С до проведения экспериментов.

Определение противомикробной активности эндолизинов. Для оценки активности белков против бактерий в экспоненциальной фазе роста культуру A. baumannii разбавляли в свежей питательной среде и подращивали при 37°С, 250 об/мин до оптической плотности OD₆₀₀ = 0.6. Для анализа активности ферментов в отношении бактерий в стационарной фазе использовали культуру выращенную в течение 18–20 ч, без подращивания. Далее 1 мл культуры осаждали центрифугированием в течение 5 минут (6000 g) и ресуспендировали осадок в PBS, pH 7.4 до мутности полученной суспензии, соответствующей стандарту мутности МакФарланда 0.5. Бактериальную суспензию разбавляли в 100 раз в буфере 20 мМ Трис-HCl pH 7.5.

Ферменты разводили в 20 мМ Трис-HCl pH 7.5 до концентраций 0.2 мкг/мл, 2.0 мкг/мл или 20.0 мкг/мл. В лунки планшета вносили по 100 мкл суспензии и 100 мкл подготовленных растворов эндолизинов и инкубировали 60 мин при 200 об/мин, 37°С. В качестве отрицательного контроля использовали раствор 20 мМ Трис-HCl, pH 7.5, и 100 мкл суспензии бактерии. Далее, суспензию разводили в 10 раз PBS и наносили по 100 мкл на чашки Петри. Результат оценивали, подсчитывая колониеобразующие единицы (КОЕ) после ночной инкубации в термостате при 37°С. Все эксперименты были проведены в трехкратной повторности.

Определение скорости действия эндолизинов. Для измерения скорости действия анализ проводили, как описано выше при конечной концентрации ферментов 1.0 мкг/мл и времени инкубации с бактериальной культурой 0 (без инкубации), 5, 10, 30, 60 мин.

Противобиопленочная активность. Штамм A. baumannii, образующий биопленки, культивировали в течение ночи в среде TSB (BD Tryptic Soy Broth). Затем культуры разводили 1 : 50 свежим TSB, вносили по 100 мкл в лунки 96-луночных стерильных полистироловых планшетов для культивирования суспензионных культур (“Eppendorf”, Германия) и инкубировали в течение 48 ч при 37°C, 250 об./мин, чтобы обеспечить формирование биопленки. После инкубации содержимое лунок с планктонными клетками стряхивали, планшет трижды промывали PBS рН 7.4, и сушили на воздухе в течение примерно 10 мин. Затем в лунки добавляли растворы эндолизинов до конечной концентрации 100 мкг/мл или 20 мМ Трис-HCl рН 7.5, в качестве отрицательного контроля и инкубировали при 37°С, 250 об./мин в течение 2 ч. После инкубации лунки дважды промывали 200 мкл PBS pH 7.4, и сушили на воздухе. Промытые биопленки окрашивали 0.1% водным раствором кристаллического фиолетового (“PanReac AppliСhem”, Испания) в течение 20 мин при комнатной температуре с последующим трехкратным промыванием бидистиллированной водой, подсушивали на воздухе и растворяли в 33%-ной уксусной кислоте. Оптическую плотность полученных растворов измеряли при 590 нм (ОD₅₉₀) с помощью прибора для измерения поглощения SPECTROstar NANO (“BMG LABTECH”, Германия). Все эксперименты проводились в трех повторностях.

Цитотоксическое действие. Клетки линий HEK293 и HaCaT (American Type Culture Collection) засевали в 96-луночный планшет (“Eppendorf”, Германия) из расчета 20000 кл./лунку в 100 мкл среды DMEM (“ПанЭко”, Россия) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 мM глутамина (“ПанЭко”, Россия) и смеси антибиотиков пенициллина (50 Ед./мл) и стрептомицина (50 мкг/мл) до конфлюэнтности монослоя 80–90% в течение 24 ч при 37°C, в увлажненной атмосфере с содержанием 5% CO₂. Далее из лунок удаляли среду и вносили 100 мкл растворов эндолизинов в концентрациях от 1000 мкг/мл до 15.6 мкг/мл (2-кратные разведения белков в стерильной базовой среде DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 2 мM глутамина). В качестве контроля выживаемости в лунки вносили 100 мкл базовой среды DMEM. При анализе данных значения в этих лунках принимали за 100% (Ymax). В качестве положительного контроля использовали значения в лунках, содержащих 100 мкл 0.1% Тритон X-100 (“Хеликон”, Россия), при анализе данных их принимали за 0% (Ymin). Каждую концентрацию анализировали в трех повторностях.

Планшеты инкубировали в термостате при 37°C в атмосфере с содержанием 5% CO₂ в течение 24 ч, затем вносили по 100 мкл тетразолиевого красителя MTT (“Диаэм”, Россия) до итоговой концентрации 0.5 мг/мл. Смеси инкубировали в течение еще 4 ч при 37°C в 5%-ном CO₂. После инкубации из лунок планшета удаляли всю жидкость, вносили по 100 мкл DMSO и измеряли оптическую плотность при длине волны 570 нм (OD₅₇₀). Долю живых клеток в каждой лунке для каждой концентрации препарата вычисляли, используя следующую формулу:

ЖС = (Y_об – Y_мин)/(Y_макс – Y_мин) × 100%,

где ЖС – жизнеспособность, % живых клеток;

Y_об – значение OD₅₇₀ для образца в определенной концентрации;

Y_макс – среднее значение OD₅₇₀ в лунках с контролем живых клеток (среда DMEM);

Y_мин – среднее значение OD₅₇₀ в лунках с 0.1% Тритон X-100, контроль мертвых клеток.

Статистическая обработка данных. Результаты были проанализированы и проиллюстрированы с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 10.0. Сравнение проведено с использованием однофакторного дисперсионного анализа с учетом критерия множественных сравнений Тьюки. Данные представлены как средние значения трех независимых экспериментов ± стандартное отклонение, SD.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Инженерия и получение модифицированных эндолизинов. В качестве фермента для модификации был выбран фаговый эндолизин LysSi3, который ранее был охарактеризован [13] как гликозидгидролаза 24 семейства (мурамидаза, GH24) с выраженной антимикробной активностью в отношении бактерий видов P. aeruginosa, A. baumannii, E. coli. При этом, LysSi3 обладал невысокой скоростью противомикробного действия по сравнению с другими эндолизинами, элиминируя 99.9% КОЕ контрольного штамма более, чем за 99 мин. Кроме того, LysSi3 избирательно активен в отношении изолятов K. pneumoniae, Salmonella sp. и Enterobacter sp. [14], а его активность практически полностью ингибируется в присутствии физиологических концентраций соли. Таким образом, не смотря на высокий потенциал действия этого фермента, у него есть ряд недостатков, не позволяющих его рассматривать в качестве действующего вещества противомикробных препаратов.

Модификация нативных эндолизинов введением дополнительных последовательностей, обладающих противомикробной активностью, например, за счет дестабилизации и пермеабилизации внешней мембраны грамотрицательных бактерий, широко применяется для получения кандидатных средств терапии против инфекций, вызываемых такими патогенами. Использование АMП является универсальной стратегией и основано на их физико-химических свойствах. В основном, для этих целей используют поликатионные, гидрофобные, амфипатические последовательности [11, 15]. Несмотря на то, что существуют высокопроизводительные платформы для создания и предсказания свойств таких генно-инженерных конструкций [16], этот подход к конструированию ферментов все равно остается достаточно трудоемким, и требует большого количества экспериментальной работы на этапах скрининга. С другой стороны, системный анализ влияния пептидов на свойства инженерных эндолизинов отсутствует, а описанные исследования ограничены несколькими примерами гибридизации.

Для получения химерных белков LysSi3-АМП выбирали противомикробные пептиды, относящиеся к различным группам по аминокислотному составу. Помимо этого, для пептидов должна быть показана способность проникать через внешнюю мембрану грамотрицательных бактерий, и отсутствие значимого цитотоксического действия на клетки эукариот. По этим критериям, для исследования были выбраны три пептида Цекропин А (1–8) (DBAASPS_9963), Гистатин 5 (DBAASPR_15) и синтетический пептид GG3 (DBAASPS_8820). Их гибридизовали на С-конце последовательности LysSi3, в результате получая модифицированные ферменты: LysSi3-CeA, LysSi3-HIS5 и LysSi3-GG3.

Цекропин А (CeA) — один из наиболее широко изученных антимикробных пептидов, продуцируемый насекомыми в качестве компонента защитной системы от бактериальных инфекций. В зависимости от соотношения в среде пептид/липид, CeA формирует либо ионные каналы (при низких соотношениях), либо поры, достаточные, чтобы могли проходить различные молекулы (при более высоких соотношениях) [17]. Цекропины и их производные пептиды широко используют для модификации эндолизинов с целью получения ферментов, активных в отношении грамотрицательных бактерий, таких видов как A. baumannii, K. pneumoniae, E. coli и Enterobacter cloacae [18–20].

Гистатины представляют собой семейство небольших катионных пептидов, в составе которых присутствует большое количество основных аминокислот, таких как аргинин, лизин и, главным образом, гистидин [21]. Аминокислотная последовательность гистатина 5 (HIS-5) характеризуется случайной вторичной структурой, представляющей α-спираль с амфипатическими свойствами [22]. Несмотря на то, что гистатин в первую очередь рассматривался как пептид, активный в отношении C. albicans, его фрагмент, включающий аминокислотные остатки с 4 по 16, также проявляет антибактериальную активность в отношении P. aeruginosa, E. coli и S. aureus [23–25]. И хотя механизм действия HIS5 до конца не выяснен, известно, что пептид поглощается клеткой и индуцирует продукцию активных форм кислорода [26].

Глицин-богатый центросимметричный пептид GG3 – синтетически синтезированный пептид, сконструированный таким образом, чтобы обойти естественную иммунную защиту хозяина [27]. Он включает гидрофобные, положительно-заряженные аминокислоты, а также остатки Gly. При этом, GG3 показал селективность в отношении грамотрицательных бактерий, отсутствие серьезной гемолитической активности, а механизм его действия, по всей видимости, включает, помимо увеличения проницаемости бактериальной мембраны за счет формирования пор, также связывание с бактериальной ДНК.

Таким образом, все три пептида, используемые для модификации LysSi3 различались между собой как по физико-химическим свойствам и структуре, так и по механизму взаимодействия с внешними мембранами грамотрицательных бактерий.

Все белки были получены в экспрессионной системе E. coli. Индукцию проводили при OD₆₀₀ 0.5–0.7 оптических ед. При этом, по сравнению с LysSi3, для модифицированных противомикробными пептидами белков наблюдалось замедление роста и накопления биомассы. А у штаммов, продуцирующих LysSi3-GG3 и LysSi3-CeA, спустя 3 ч индукции начинался лизис культуры и снижение оптической плотности (рис. 1а), вероятно, из-за накопления высокой концентрации эндолизинов в клетках продуцента и их токсичности.

 

Рис. 1. Кривые роста и накопления биомассы (а) и электрофорез в ПААГ очищенных белков (б): 1 – LysSi3, 2 – LysSi3-CeA, 3 – LysSi3-HIS5, 4 – LysSi3-GG3. IND – диапазон оптической плотности культуры, при которой вносили ИПТГ для индукции экспрессии белков.

 

Несмотря на это, выход белков после двухстадийной хроматографической очистки растворимой фракции составил 10.0; 3.18; 1.34 мг/г биомассы для LysSi3-CeA, LysSi3-HIS5 и LysSi3-GG3 соответственно, а препараты достигали высокой степени очистки (рис. 1б).

Таким образом, возможность получения белков в выбранной системе экспрессии подтверждено экспериментально, а получаемые количества достаточны для определения основных свойств.

Влияние модификаций на противомикробные свойства LysSi3. В ходе работы нами были оценены такие параметры антимикробной активности полученных ферментов, как эффективные концентрации эндолизинов, скорость действия в отношении модельного штамма A. baumannii, активность в отношении бактерий, находящихся в стационарной фазе роста, а также в составе биопленок.

В сравнении с нативным LysSi3 все модифицированные ферменты были более активными и в минимальной измеренной концентрации 0.1 мкг/мл активность составила 55.6, 88.8 и 98.3% для LysSi3-CeA, LysSi3-HIS5 и LysSi3-GG3 соответственно (рис. 2а). Активность LysSi3 в этой концентрации не превышала 20%. Также значительно возросла скорость действия эндолизинов, содержащих дополнительные пептиды, и при концентрации 1.0 мкг/мл LysSi3-CeA, LysSi3-HIS5 и LysSi3-GG3 потребовалось 11.8, 4.6 и 4.5 мин на элиминацию 90% бактерий, в то время как для LysSi3 это время составило 51 мин (рис. 2в). Помимо этого, эндолизины были активнее в отношении бактериальных клеток в стационарной фазе роста, причем LysSi3-HIS5 и LysSi3-GG3 полностью элиминировали бактерии в образцах (рис. 2б). Известно, что лизины обычно менее активны в отношении бактерий, находящихся в стационарной фазе и характеризующихся более устойчивой к внешним воздействиям клеточной стенкой по сравнению с экспоненциально растущими бактериальными клетками [28], что может ограничивать их применение в реальных условиях. В связи с этим, модификации, позволяющие добиться противомикробной активности, независимо от метаболического статуса клетки является большим преимуществом.

 

Рис. 2. Зависимость противомикробной активности (а) от концентрации LysSi3 и его модифицированных вариантов (I – 0.1 мкг/мл, II – 1.0 мкг/мл, III – 10.0 мкг/мл), активность в отношении бактерий в экспоненциальной (I) и стационарной (II) фазах роста штамма A. baumannii в концентрации 1.0 мкг/мл (б), скорость противомикробного действия (в), окрашивание массы сформированной бактериальной пленки A. baumannii кристаллическим фиолетовым после инкубации с ферментами (г), показаны значения оптической плотности для трех технических повторов. Для а–г: 1 – LysSi3, 2 – LysSi3-CeA, 3 – LysSi3-HIS5, 4 – LysSi3-GG3, К – контроль роста.

 

При оценке противобиопленочных свойств модифицированных белков оказалось, что нативный фермент, напротив, был наиболее активен, снижая массу бактериальной пленки в 2.5 раза относительно контроля (рис. 2г). Для модифицированных белков снижение составило 2.0; 1.4; 1.6 раз. Эти результаты могут быть, в частности, связаны с агрегацией молекул модифицированных белков за счет заряженных частей глобулы, и их взаимодействия с матриксом бактериальных пленок или полистирольной поверхностью планшета, что затрудняло действие ферментов в отношении сформированных бактериальных пленок. Так, например, при исследовании противобиопленочной активности бактериоцина лизостафина, в среду добавляют инертный белок (БСА), поскольку он предотвращает такое “налипание” [29]. Действительно способность модифицированных ферментов разрушать сформированные биопленки соотносится с общим зарядом исследованных модифицированных белков (табл. 2), тем не менее, природа снижения активности модифицированных ферментов в отношении биопленок требует дополнительных исследований.

 

Таблица 2. Характеристики модифицированных лизинов и пептидов, использованных в работе

Фермент	LysSi3	LysSi3-CeA	LysSi3-HIS5	LysSi3-GG3
Пептид для модификации	–	Cecropin A (1–8)	Histatin 5	GG3
Последовательность АМП	–	KWKLFKKI	DSHAKRHHGYKRKF HEKHHSHRGY	GKLWLKGGKLWL KGGKLWLKG
ID в базе dbaasp	–	DBAASPS_9963	DBAASPR_15	DBAASPS_8820
Источник АМП	–	Hyalophora cecropia	Homo sapiens	Синтетический
Заряд белка*, pH 7.5	4.4	7.7	9.3	9.7
Молмасса белка*, кДа	18.5	18.5	20.5	19.8
pI белка*	9.05	9.47	9.51	9.59
Коэфф. экстинкции при 280 нм*, (мг/мл)–1см–1	1.0289	1.3379	1.0575	1.827
Характеристика АМП	–	Lys-насыщенный, альфа-спираль	Histatins, His- насыщенный, альфа-спираль	Gly-насыщенный, центросимметричный пептид
Предполагаемый механизм действия	Гидролиз пептидогликана (ПГ) по β-1,4-гликозидной связи	Гидролиз ПГ + OMP (ковровая модель, ионные каналы)	Гидролиз ПГ + OMP (пептид-фосфолипидные взаимодействия)	Гидролиз ПГ + OMP (модель тороидальной поры), связывание с ДНК
Мишень	ПГ	ПГ, липидный бислой	ПГ, липидный бислой	ПГ, липидный бислой, ДНК/РНК
Ссылки	[13]	[18]	[25, 32]	[27]

* Расчетное значение (https://protcalc.sourceforge.net);

** OMP – пермеабилизация внешней мембраны.

 

Таким образом, все генно-инженерные белки, полученные в ходе исследования, характеризовались более высокой противомикробной активностью, по сравнению с нативной мурамидазой LysSi3, и обладали более высокой скоростью действия на планктонные клетки. При этом, повышение противомикробной активности происходит в ряду LysSi3 < LysSi3-CeA < LysSi3-HIS5 < LysSi3-GG3 и коррелирует с расчётным общим зарядом белка, который при pH 7.5 составляет 4.4; 7.7; 9.3 и 9.7 соответственно.

Цитотоксические свойства модифицированных ферментов. Несмотря на хорошие противомикробные свойства, дальнейшее применение литических ферментов, проявляющих высокую цитотоксическую активность, может быть ограничено. Это же относится и к противомикробным пептидам, активность которых часто является неспецифичной, в результате чего они способны поражать и эукариотические клетки [30, 31].

Чтобы исследовать цитотоксические свойства полученных белков, мы оценили выживаемость клеток почки эмбриона человека HEK293 (рис. 3а) и кератиноцитов HaCaT (рис. 3б) in vitro при концентрациях белков от 15.6 до 1000 мкг/мл.

 

Рис. 3. Влияние различных концентраций модифицированных ферментов на жизнеспособность клеток почки эмбриона человека HEK293 (а) и кератиноцитов HaCaT (б): 1 – LysSi3, 2 – LysSi3-CeA, 3 – LysSi3-HIS5, 4 – LysSi3-GG3.

 

В концентрациях до 500 мкг/мл включительно значимого снижения выживаемости обеих линий не наблюдалось, выживаемость составляла не менее 75–80%. При увеличении концентрации эндолизинов до 1000 мкг/мл отмечено снижение количества жизнеспособных клеток, однако, степень влияния белков зависела от клеточной линии. При исследовании кератиноцитов было показано, что их цитотоксические свойства близки для всех исследуемых белков и выживаемость клеток для всех препаратов составляла ~ 70% (за исключением LysSi3-HIS5, где выживаемость HaCaT была 55%). В случае линии HEK293 эндолизины по-разному влияли на клетки. Так, в присутствии немодифицированного LysSi3, жизнеспособность клеток относительно контроля составляла 130–150% со снижением до 120% при 1000 мкг/мл, в то время как в присутствии модифицированных белков этот показатель составлял 80–120%, а ниже всего выживаемость была в присутствии LysSi3-GG3 (65–85% во всем диапазоне концентраций белка).

In vitro тесты показали, что значительного снижения выживаемости клеток эукариот в присутствии эндолизинов (как нативного, так и модифицированных) не происходило, а, следовательно, ферменты обладали специфическим и избирательным действием в отношении клеточных мембран бактерий. Такие ферменты могут рассматриваться в качестве объектов дальнейшей разработки противомикробных препаратов.

Как нативные лизины, так и противомикробные пептиды, несмотря на свою высокую активность, обладают рядом недостатков, которые возможно преодолеть при их гибридизации в единую молекулу. Добавление к лизину АМП повышало активность ферментов в отношении грамотрицательных бактерий за счет дополнительной пермеабилизации мембраны бактериальной клетки. При этом, гибридная молекула становилась более устойчивой к действию протеолитических ферментов, по сравнению с АМП, которые подвержены значительной протеолитической деградации, что сокращает период их полувыведения in vivo. Также, гибридизация повышает селективность действия пептидов, снижая их цитотоксическую и гемолитическую активность. Таким образом, анализ различных комбинаций эндолизин-АМП позволяет не только получать эффективные и стабильные молекулы с заданными свойствами, но и выявлять закономерности модификации, что может послужить для направленного получения молекул с заданными свойствами под конкретные задачи.

Исследования показали, что эффективные концентрации и скорость действия LysSi3 повышалась после введения дополнительных функциональных последовательностей, при этом, отмечалась корреляция с увеличением общего заряда белка. Кроме того, это приводит к повышению его активности в отношении бактерий в стационарной фазе роста, которые менее чувствительны к действию эндолизинов [28]. С другой стороны, снижение противобиопленочной активности модифицированных ферментов, несмотря на повышение скорости и эффективности действия на планктонные клетки, показало, что выбор модификации фермента должен быть основан не только на оценке противомикробной активности, но и подразумевает необходимость комплексного анализа с использованием нескольких параметров.

ФИНАНСИРОВАНИЕ. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 23-74-10027, https://rscf.ru/project/23-74-10027/.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ. Настоящая работа выполнена без привлечения людей или животных в качестве объектов исследований.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

Н. П. Антонова

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Email: d.v.vasina@gmail.com
Россия, Москва, 123098

И. В. Григорьев

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Email: d.v.vasina@gmail.com
Россия, Москва, 123098

А. М. Лендел

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Email: d.v.vasina@gmail.com
Россия, Москва, 123098

О. В. Усачева

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Email: d.v.vasina@gmail.com
Россия, Москва, 123098

А. А. Климова

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Email: d.v.vasina@gmail.com
Россия, Москва, 123098

Е. В. Усачев

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Email: d.v.vasina@gmail.com
Россия, Москва, 123098

В. А. Гущин

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи Минздрава России; Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет)

Email: d.v.vasina@gmail.com
Россия, Москва, 123098; Москва, 119048

Д. В. Васина

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: d.v.vasina@gmail.com
Россия, Москва, 123098

Список литературы

Дополнительные файлы