Влияние ДНК-связывающих белков на ферментативную активность терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы в системах с гомополимерными субстратами

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Проведено исследование влияния ДНК-связывающих белков EcSSB и Sso7d, стабилизирующих одноцепочечную и двуцепочечную ДНК соответственно, на активность терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (TdT) in vitro. В качестве субстрата использовали гомополимеры Tn, не склонные к образованию вторичных структур. Внесение в реакционную смесь EcSSB приводило к существенному повышению активности TdT и смещению спектра образующихся продуктов в сторону более протяженных олигонуклеотидов, а максимальный эффект наблюдался в близком к эквимолярному стехиометрическом соотношении (EcSSB)4:TdT в присутствии катионов Mn2+. Присутствие Sso7d в реакционной смеси приводило к небольшому (до 15٪) снижению активности TdT для субстратов T5 и T15 и более выраженному для T35 (до 30٪). При этом катионы Co2+ снижали ингибирующий эффект Sso7d. Продемонстрированное в данной работе влияние ДНК-связывающих белков на активность TdT, а также установленные закономерности, могут найти применение как в белковой инженерии при создании гибридных мультидоменных белков на основе TdT, так и при разработке новых принципов ферментативного de novo синтеза ДНК.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

А. Б. Саченко

Институт биоорганической химии Национальной Академии наук Беларуси

Email: yantsevich@iboch.by
Белоруссия, Минск, 220141

В. В. Щур

Институт биоорганической химии Национальной Академии наук Беларуси

Email: yantsevich@iboch.by
Белоруссия, Минск, 220141

С. А. Усанов

Институт биоорганической химии Национальной Академии наук Беларуси

Email: yantsevich@iboch.by
Белоруссия, Минск, 220141

А. В. Янцевич

Институт биоорганической химии Национальной Академии наук Беларуси

Автор, ответственный за переписку.
Email: yantsevich@iboch.by
Белоруссия, Минск, 220141

Список литературы

  1. Hoose A., Vellacott R., Storch M., Freemont P.S., Ryadnov M.G. // Nat. Rev. Chem. 2023. V. 7. P. 144–161.
  2. Stemmer W.P., Crameri A., Ha K.D., Brennan T.M., Heyneker H.L. // Gene. 1995. V. 164. P. 49–53.
  3. Ma S., Saaem I., Tian J. // Trends Biotechnol. 2012. V. 30. P. 147–154.
  4. Kosuri S., Church G.M. // Nat. Meth. 2014. V. 11. P. 499–507.
  5. Grosse F., Manns A. // Meth. Mol. Biol. 1993. V. 16. P. 95–105.
  6. Bollum F.J. // J. Biol. Chem. 1960. V. 235. P. 2399–2403.
  7. Church G.M., Gao Y., Kosuri S. // Science. 2012. V. 337. P. 1628. https://doi.org/10.1126/science.1226355
  8. Verardo D., Adelizzi B., Rodriguez-Pinzon D.A., Moghaddam N., Thomee E., Loman T. et al. // Science. Adv. 2023. V. 9. P. eadi0263. https://doi.org/10.1126/sciadv.adi0263
  9. Deibel M.R., Jr., Coleman M.S. // J. Biol. Chem. 1980. V. 255. P. 4206–4212.
  10. Sachanka A.B., Trawkina M., Shchur V.V., Usanov S.A., Yantsevich A.V. // Proc. Nat. Acad. Sci. Bel. Chem. Ser. 2023. V. 55. P. 225–233.
  11. Steitz T.A., Steitz J.A. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 6498–6502.
  12. Barthel S., Palluk S., Hillson N.J., Keasling J.D., Arlow D.H. // Genes. 2020. V. 11. https://doi.org/10.3390/genes11010102
  13. Wang Y., Prosen D.E., Mei L., Sullivan J.C., Finney M., Vander Horn P.B. // Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. P. 1197–1207.
  14. Dolgova A.S., Stukolova O.A. // 3 Biotech. 2017. V. 7. P. 128. https://doi.org/10.1007/s13205-017-0745-2
  15. Baumann H., Knapp S., Lundbäck T., Ladenstein R., Härd T. //Nat. Mol. Biol. 1994. V. 1. P. 808–819.
  16. Shehi E., Serina S., Fumagalli G., Vanoni M., Consonni R., Zetta L. et al // FEBS Lett. 2001. V. 497. P. 131–136.
  17. Guagliardi A., Napoli A., Rossi M., Ciaramella M. // J. Mol. Biol. 1997. V. 267. P. 841–848.
  18. McAfee J.G., Edmondson S.P., Datta P.K., Shriver J.W., Gupta R. // Biochem. 1995. V. 34. P. 10063–10077.
  19. Bujalowski W., Overman L.B., Lohman T.M. // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 4629–4640.
  20. Bochkarev A., Bochkareva E., Frappier L., Edwards A.M. // EMBO J. 1999. V. 18. P. 4498–4504.
  21. Chédin F., Seitz E.M., Kowalczykowski S.C. // Trends Biochem. Sci. 1998. V. 23. P. 273–277.
  22. Schwarz K., Hansen-Hagge T., Bartram C. // Nucleic Acids res. 1990. V. 18. P. 1079. https://doi.org/10.1093/nar/18.4.1079
  23. Ronaghi M. // Anal. Biochem. 2000. V. 286. P. 282–288.
  24. Yantsevich A.V., Shchur V.V., Usanov S.A. // SLAS tech. 2019. V. 24. № 6. P. 556–568. https://doi.org/10.1177/2472630319850534
  25. Yantsevich A.V., Dzichenka Y.V., Ivanchik A.V., Shapiro M.A., Trawkina M., Shkel T.V., et al.. // Prikl. Biokhim. Mikrobiol. 2017. V. 53. № 2. P. 173–187.
  26. Shlyakhtenko L.S., Lushnikov A.Y., Miyagi A., Lyubchenko Y.L. // Biochem. 2012. V. 51. P. 1500–1509.
  27. Kuffel A., Gray A., Daeid N.N. // Int. J. Leg. Med. 2021. V. 135. P. 63–72.
  28. Johns D., Richard Morgan A. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1976. V. 72. P. 840–849.
  29. Kato K.I., Goncalves J.M., Houts G.E., Bollum F.J. // J. Biol. Chem. 1967. V. 242. P. 2780–2789.
  30. Flamme M., Hanlon S., Iding H., Puentener K., Sladojevich F., Hollenstein M. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2021. V. 48. P. 128242. https://doi.org/10.1016/j.bmcl.2021.128242
  31. Aleksandra A.K., Timofey E.T., Irina V.A., Nadezhda A.T., Olga S.F., Nikita A.K. // Life Sci. All. 2022. V. 5. P. e202201428. https://doi.org/10.26508/lsa.202201428
  32. Kuznetsov S.V., Kozlov A.G., Lohman T.M., Ansari A. // J. Mol. Biol. 2006. V. 359. P. 55–65.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Результаты ПААГ-электрофореза в денатурирующих условиях образцов выделенных рекомбинантных белков TdT (дорожка 1), Sso7d (дорожка 2) и EcSSB (дорожка 3); М – стандарт молекулярных масс белков 10–250 кДа.

Скачать (104KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Результаты электрофореза кольцевой плазмидной ДНК (5994 п.о.) в 1% агарозном геле без Sso7d (дорожка 1), в присутствии Sso7d (дорожка 2). М – стандарт линейной ДНК (а); количество гомополимерных 15-мерных олигонуклеотидов различной природы (нмоль), связавшихся с EcSSB (10 нмоль), иммобилизованном на Ni2+-NTA-агарозе (б).

Скачать (64KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Зависимость активности TdT от длины олигонуклеотидного субстрата в серии гомополимеров Tn.

Скачать (70KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Хроматограммы продуктов элонгации субстратов различной длины (T5–Т50) с участием TdT (конц. ТТР 200 мкМ, время реакции 30 мин): время удерживания, соответствующее субстратам: Т5 – 5.6 мин; Т15 – 12.4 мин; Т25 – 15.2; Т30 – 16.5 мин; Т45 – 18.1 мин; Т50 – 22.2 мин.

Скачать (94KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Влияние катионов Me2+ на ферментативную активность TdT.

Скачать (75KB)
Метаданные
7. Рис. 6. Зависимость суммарной площади хроматографических пиков продуктов (S) от количества присоединенных TdT нуклеотидов к субстратам T5 и T15 в реакционной смеси, содержащей: 40 нМ TdT, 0.2 мМ TTP, 5 мM AcOK, 2 мM AcOTрис (pH 7.9), 1 мM AcOMg, 0.25 мМ Me2+ (обозначено на легенде для T15), 0.4 мкМ олигонуклеотида (а) и реакционной смеси, дополнительно содержащей 2 мкМ EcSSB (б).

Скачать (259KB)
Метаданные
8. Рис. 7. Хроматограммы продуктов реакции при различных стехиометрических соотношениях EcSSB/TdT (субстрат T5, tR 5.6 мин, а) и EcSSB/TdT (субстрат T15, tR 12.4 мин, б); контроль: 0.2 мМ TTP, 5 мM AcOK, 2 мM AcOTрис (pH 7.9), 1 мM AcOMg и 0.4 мкМ олигонуклеотида Т5.

Скачать (371KB)
Метаданные
9. Рис. 8. Влияние EcSSB на активность TdT для субстратов различной длины (EcSSB/TdT 5 : 1).

Скачать (95KB)
Метаданные
10. Рис. 9. Влияние белка EcSSB на ферментативную активность TdT в присутствии Me2+: контроль: 40 нМ TdT, 0.2 мМ TTP, 5 мM AcOK, 2 мM AcOTрис (pH 7.9), 1 мM AcOMg, 0.4 мкМ олигонуклеотида Т15 и 2 мкМ EcSSB.

Скачать (78KB)
Метаданные
11. Рис. 10. Хроматограммы продуктов элонгации T15 (tR 12.4 мин), отражающие влияние катионов Me2+ и EcSSB: контроль: 40 нМ TdT, 0.2 мМ TTP, 5 мM AcOK, 2 мM AcOTрис (pH 7.9), 1 мM AcOMg, 0.25 мМ Me2+, 0.4 мкМ Т15 и 2 мкМ EcSSB.

Скачать (206KB)
Метаданные
12. Рис. 11. Влияние Sso7d на активность TdT в реакции элонгации T5, T15, T35 в различных условиях. Отражено влияние катионов Zn2+ и Co2+ на элонгацию T15.

Скачать (118KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».