Biologically Active Quinolinone Alkaloid from Marine Fungus Penicillium polonicum KMM 4719

Full Text

Вторичные метаболиты морских микроскопических грибов, ассоциированных с голотуриями, в настоящее время изучены слабо. Так, Чен с соавт. [1] показали, что к настоящему времени из различных голотурий были выделены микроскопические грибы 29 родов, относящихся к 24 семействам, большинство из которых принадлежат к семейству Ascomycota, доминирующими родами являются Aspergillus и Penicillium. Всего из этих грибов было выделено 122 низкомолекулярных соединения. Исследования грибов, связанных с голотуриями, сосредоточены в Юго-Восточной Азии и на Дальнем Востоке России [2]. Так, более 30 дитерпеновых гликозидов группы виресценозидов было выделено из культуры гриба Paragliomastix luzulae (ранее определенного как Acremonium striatisporum) KMM 4401, ассоциированного с голотурией Eupentacta fraudatrix, собранной в Японском море [3]. В настоящей работе из гонад голотурии Apostichopus japonicus (дальневосточного трепанга) был выделен гриб, идентифицированный как Penicillium polonicum KMM 4719 на основе молекулярно-генетического анализа. Грибы этого вида являются известными эндофитами, встречающимися повсеместно и вызывающими поражение сельскохозяйственных растений [4]. Из наземных изолятов P. polonicum выделялись пеницилловая кислота, анацин, асптерровая кислота, циклопенины и нефротоксичные гликопептиды [5], нейротоксин веррукозидин [6], β-лактоны и нафтохиноны [7], индольные алкалоиды [8–9] с цитотоксической, антипролиферативной и антифунгальной активностью. Различные изоляты P. polonicum также были выделены из морских местообитаний, в том числе морских донных осадков [10], водорослей Chaetomorpha antennina [11], образца губки Phorbas sp. [12] и даже акульих жабр [12]. Тем не менее, это первое выделение гриба P. polonicum из дальневосточного трепанга Apostichopus japonicus.

Цель настоящей работы ‒ выделение и установление структуры вторичных метаболитов гриба P. polonicum KMM 4719 и исследование их биологической активности.

МЕТОДИКА

Штамм гриба. Штамм гриба P. polonicum KMM 4719 был выделен из гонад дальневосточного трепанга Apostichopus japonicus, собранного в бухте Троица (залив Петра Великого, Японское море, Россия). Для получения грибных изолятов образец голотурии промывали три раза в стерильной морской воде, после чего стерильными инструментами препарировали гонады. Кусочки гонад помещали на поверхность агаризованной среды Чапека в стерильные чашки Петри [13]. Чашки инкубировали при комнатной температуре. Колонии грибов по мере появления выделяли в чистую культуру на скошенную агаризованную среду Чапека, где в дальнейшем и поддерживали. Для подавления бактериального роста при выделении грибов из образца голотурии в среду добавляли антибиотики пенициллин (500 тыс. ед./л) и стрептомицин (0.5 г/л).

Штамм хранится в Коллекции морских микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН (Россия) под номером КММ 4719.

Выделение геномной ДНК и амплификация. Геномную ДНК выделяли из мицелия, выращенного на среде MEA (агар с солодовым экстрактом) [13] при 25°C в течение 7 сут. Для выделения использовали набор MagJET Plant Genomic DNA Kit (“Thermo Fisher Scientific”, США) в соответствии с протоколом производителя. Амплификацию проводили с использованием фермента GoTaq^TM Flexi DNA Polymerase (“Promega”, США). Для амплификации ITS региона использовали праймеры 1400-F (5'-CTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTC-3') [14] и D2CR (5'-CCTTGGTCCGTGTTTCAAGA-3') [15], комплементарные участкам 18S рДНК и 28S рДНК соответственно. Температурно-временной режим ПЦР включал предварительную денатурацию при 95°С в течение 300 с, за которой следовали 35 циклов: 94°С — 20 с; 55°С (отжиг праймеров) — 20 с и 72°С — 90 с. Завершающая элонгация проводилась при 72°C в течение 300 с. Для амплификации частичной последовательности BenA гена использовали стандартные праймеры Bt-2a и Bt-2b [16] и параметры ПЦР, описанные выше, с отжигом праймеров при 60°C. Для амплификации частичной последовательности CaM гена, использовали вырожденные праймеры cal_P/A_F (5'-TCYGAGTACAAGGAGGCSTT-3') и cal_P/A_R (5'-CCRATGGAGGTCATRACGTG-3') [17] и параметры ПЦР, описанные с отжигом праймеров при 65°C. Ампликоны ITS, BenA и CaM очищали набором ExoSAP-IT™ PCR Product Cleanup Reagent (”Thermo Fisher Scientific”, США) в соответствии с протоколом производителя. Секвенирование ампликонов проводили в обоих направлениях с использованием вышеуказанных праймеров на генетическом анализаторе SeqStudio™ Genetic Analyzer (“Thermo Fisher Scientific”, США) с использованием набора реагентов BigDye™ Terminator ver. 3.1 (“Thermo Fisher Scientific”, США). Последовательности генов были депонированы в базу данных NCBI GenBank (http://ncbi.nlm.nih.gov) под регистрационными номерами: OQ344775 для ITS, OQ466620 для BenA и PP616716 для CaM (табл. 1).

 

Таблица 1. Штаммы рода Penicillium, использованные в филогенетическом анализе, и регистрационные номера их генов

Вид	Номер штамма	Регистрационный номер в GenBank
		ITS	BenA	CaM
P. aurantiogriseum	CBS 324.89T	AF033476	MN969372	KU896822
P. cyclopium	CBS 144.45T	JN097811	MN969380	KU896832
P. freii	CBS 476.84T	MN431389	KU896813	KU896836
P. melanoconidium	CBS 115506T	MN431393	MN969387	KU896843
P. neoechinulatum	CBS 169.87T	JN942722	MN969388	KU896844
P. polonicum	CBS 222.28T	AF033475	MN969392	KU896848
P. polonicum	KMM 4719	OQ344775	OQ466620	PP616716
P. tricolor	CBS 635.93T	JN942704	MN969403	KU896852
P. viridicatum	CBS 390.48T	AY373939	MN969406	KU896856
Talaromyces marneffei	CBS 388.87T	JN899344	JX091389	KF741958

 

Филогенетический анализ. Поиск последовательностей ITS, BenA и CaM типовых (ex-type) штаммов проводили в базе данных GenBank с помощью алгоритма BLASTn (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Множественное выравнивание последовательностей ITS (ITS1, 5.8S рДНК, ITS2) BenA и CaM и их филогенетический анализ осуществляли с использованием программного обеспечения MEGA X (версия 11.0.9) [18]. Филогенетическое дерево строили на основе выравненных объединенных последовательностей с помощью метода максимального правдоподобия (Maximum Likelihood, ML) и подобранной оптимальной эволюционной модели Kimura 2-parameter + G + I [19]. Для статистической поддержки использовали бутстреп-тест (1000 реплик). В качестве внешней группы для филогенетического анализа использовали последовательности штамма Talaromyces marneffei CBS 388.87^T (табл. 1).

Культивирование гриба. Гриб культивировали на агаризованной среде Чапека [13] в колбах Ру объемом 1000 мл (250 мл среды × 5 колб) в течение 3 недель при комнатной температуре. В качестве посевного материала использовали суспензию грибных пропагул в концентрации 8 × 10⁴ КОЕ/мл. Для приготовления суспензии использовали стерильную морскую воду. В каждую колбу вносили по 2 мл суспензии стерильной пипеткой и равномерно распределяли по поверхности агаризованной среды.

Экстракция и выделение. По окончании инкубационного периода мицелий гриба P. polonicum KMM 4719 вместе со средой гомогенизировали и экстрагировали EtOAc (5 л). Полученный экстракт упаривали досуха. Сухой остаток (2.2 г) растворяли в 200 мл смеси H₂O–EtOH (4 : 1) и последовательно экстрагировали н-гексаном (3 × 0.2 л) и затем EtOAc (3 × 0.2 л). Этилацетатный экстракт упаривали досуха (1002.9 мг) и разделяли при помощи колоночной хроматографии на силикагеле (3 × 14 см), элюируя сначала н-гексаном (200 мл), а затем ступенчатым градиентом от 5 до 50% EtOAc в н-гексане. Полученная при этом фракция A, элюированная системой н-гексан–EtOAc (90 : 10, 19.3 мг), была рехроматографирована на колонке с силикагелем (1.5 × 10 см) в системе гексан-EtOAc (90 : 10). В результате было выделено индивидуальное соединение 1.

Условия эксперимента. Спектры ЯМР записывали в CDCl₃ на приборе Bruker Avance III-700 (“Bruker BioSpin GmbH”, Германия). Калибровку спектров ЯМР проводили по остаточным сигналам растворителя. Спектры HRESIMS регистрировали на масс-спектрометре MaХis impact II (“Bruker Daltonics” GmbH, Германия).

Жидкостную колоночную хроматографию низкого давления проводили с использованием силикагеля (50–100 мкм, ООО “Имид”, Россия). Для тонкослойной хроматографии использовали пластины с предварительно нанесенным силикагелем (5–17 мкм, 4.5 см × 6.0 см, ООО “Имид”, Россия) и силикагелем 60 RP-18 F254S (20 см × 20 см, “Merck” KGaA, Германия).

Спектральные данные. 3-O-метилвиридикатин (1) — белый аморфный порошок, C₁₆H₁₃NO₂, m/z: 250.088 [M–H]^– (расч. значение 250.0874 для C₁₆H₁₂NO₂), 274.0839 [M + Na]^– (расч. значение 274.0838 для C₁₆H₁₃NO₂Na). Спектр ЯМР ¹Н (700 МГц, CDCl₃, δ, м.д., J, Гц): 3.80 (3H, с, OMe), 7.12 (1H, т, J = 7.5, H-7), 7.22 (1H, д, J = 8.1, H-6), 7.32 (1H, д, J = 8.1, H-9), 7.36 (2H, д, J = 7.3, H-12, H-16), 7.43 (1H, т, J = 7.5, H-8), 7.48 (1H, т, J = 7.3, H-14), 7.53 (2H, т, J = 7.4, H-13, H-15), 10.54 (1H, с, NH). Спектр ЯМР ¹³C (176 МГц, CDCl₃, δ, м.д.): 160.2 (C-2), 145.4 (C-3), 139.6 (C-4), 135.2 (C-10), 133.5 (C-11), 129.5 (HC-12, HC-16), 129.1 (HC-8), 128.6 (HC-13, HC-15), 128.5 (HC-14), 126.9 (HC-6), 123.0 (HC-7), 121.2 (C-5), 115.5 (HC-9), 60.5 (OMe).

Радикал-связывающая активность. 3-O-метилвиридикатин растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) в концентрации 1 мг/мл. Для определения активности в 96-луночные планшеты добавляли по 120 мкл соединения и 30 мкл раствора 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (ДФПГ) в этаноле (750 мкМ) [20]. Планшеты оставляли на 30 мин в темноте, по истечении времени измеряли оптическое поглощение растворов с помощью планшетного спектрофотометра Multiskan FC (“Thermo Scientific”, США) при λ = 520 нм. В качестве контроля был использован 100%-ный раствор ДМСО. Активность представлена как процент от значения в контроле.

Антимикробная активность. Дрожжеподобные грибы Candida albicans KMM 455 и бактериальные штаммы Staphylococcus aureus ATCC 21027 и Escherichia coli VKPM (B-7935) (Коллекция морских микроорганизмов, ТИБОХ ДВО РАН) культивировали на агаризованной (16.0 г/л) среде Мюллера-Хинтона в чашках Петри при температуре 37°C в течение 24 ч. Эксперименты проводили на 96-луночных микропланшетах в бульоне Мюллера-Хинтона. В каждую лунку вносили по 90 мкл суспензии бактерий или дрожжеподобных грибов (10⁶ КОЕ/мл). Затем добавляли по 10 мкл соединения, разведенного в концентрациях от 1.5 мкМ (0.4 мкг/мл) до 100.0 мкМ (25.1 мкг/мл) с использованием двукратного разведения (концентрация ДМСО <1%) и инкубировали в течение 18 ч при 37°C. Антимикробную активность оценивали с помощью спектрофотометра Multiskan FS (“Thermo Scientific”, США). В качестве положительного контроля использовали антибиотик гентамицин и противогрибковое средство нитрофунгин в дозе 100 мкМ (17.4 мкг/мл), 1%-ный ДМСО в фосфатно-солевой буфере (PBS) служил отрицательным контролем.

Анализ ингибирования активности уреазы. Ингибирующую активность в отношении уреазы (из Canavalia ensiformis, конечная концентрация 1 ед.) оценивали по выделению аммиака с помощью индофенольного метода. Реакционную смесь, состоящую из 25 мкл раствора фермента и 5 мкл вещества (конечная концентрация 1.5–100.0 мкМ), предварительно инкубировали при 37°C в течение 60 мин в 96-луночных планшетах. Затем в каждую лунку добавляли 55 мкл фосфатного буферного раствора с 100 мкМ мочевины и инкубировали при 37°C в течение 10 мин. Затем в каждую лунку добавляли 45 мкл фенольного реагента (1% фенола и 0.005% нитропруссида натрия) и 70 мкл щелочного реагента (0.5% NaOH и 0.1% активного хлорида NaClO), инкубировали в течение 50 мин при комнатной температуре. Затем измеряли оптическую плотность с помощью микропланшетного ридера MultiskanFS (“Thermo Scientific”) при λ = 630 нм. В качестве положительного контроля использовали ДМСО (5%). В течении эксперимента уровень рН был 7.3–7.5.

Молекулярный докинг. Молекулярный докинг был проведен с помощью онлайн сервера для молекулярного докинга SwissDock (http://old.swissdock.ch/docking) на основе программного обеспечения EADock DSS [21]. Алгоритм докинга включает в себя “слепой” докинг и оценку рассчитанных вариантов связывания с использованием алгоритма CHARMM [22], оценки скоринговой функции с помощью модели сольватациии FACTS (Fast Analytical Continuum Treatment of Solvation) [23] и последующей кластеризации [24].

Для проведения докинга использовали структуру уреазы Canavalia ensiformis [25] (PDB ID 4H9M) из базы данных RCSB Protein Data Bank (https://www.rcsb.org). Подготовку структуры к докингу проводили с помощью пакета DockPrep программы UCSF Chimera 1.16. Структуры лигандов готовили к докингу с помощью программ ChemDraw и Chem3D пакета программ ChemOffice 20.0. Визуализацию и анализ данных молекулярного докинга проводили с помощью UCSF Chimera 1.16.

Клеточные линии и условия культивирования. В работе использовали линии клеток нормальных кардиомиоцитов крысы H9c2 (CRL-1446, ATCC, США) и клеток гепатокарциномы человека HepG2 (HB-8065, ATCC, США). Все клетки инкубировали в увлажненной среде CO₂ (5%) при температуре 37°C в среде DMEM (“BioloT”, Россия), содержащей 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина (“BioloT”, Россия).

Клетки рассевали в 96-луночные планшеты в концентрациях 5 × 10³ кл./лунка для линии HepG2 и 3 × 10³ кл./лунка для линии Н9с2 в соответствии с их особенностями в среде объемом 180 мкл. Через 24 ч добавляли вещество 1 в необходимых концентрациях (20 мкл), и инкубировали в течение 24 или 48 ч. Растворитель использовали в качестве контроля. После этого культуральную среду отбирали (180 мкл), добавляли свежую культуральную среду (100 мкл) и раствор 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромида (10 мкл) в концентрации 12 мкМ. Через 4 ч добавляли 10%-ный раствор додецилсульфата натрия (ДДС/HCl, 100 мкл) и через 4–18 ч оценивали оптическую плотность раствора с помощью планшетного спектрофотометра MultiscanFC (“Thermo Scientific”) при длине волны 570 нм. Результаты представляли как долю жизнеспособных клеток (%) по сравнению с контролем.

Инкубирование клеток HepG2 с этиловым спиртом (5% по объему) проводили в течение 1 ч, после чего добавляли 3-О-метилвиридикатин (1). Через 24 ч оценивали жизнеспособность клеток, как описано выше.

Инкубирование клеток H9c2 с хлоридом кобальта (II) в концентрации 500 мкМ проводили в течение 1 ч, после чего добавляли соединение 1. Жизнеспособность клеток оценивали через 48 ч, как описано выше.

Статистическая оценка данных. Все данные были получены в трех независимых повторах, а рассчитанные значения выражали как среднее значение ± стандартная ошибка (SEM). Статистическая достоверность различий оценивалась с помощью t-критерия Стьюдента с использованием SigmaPlot 14.0 (“Systat Software Inc.”, США). Различия считали статистически значимыми при p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Молекулярно-генетическая идентификация штамма морского гриба P. polonicum KMM 4719. Для идентификации и установления таксономического положения штамма KMM 4719 были амплифицированы и секвенированы молекулярные филогенетические маркеры, такие как внутренняя транскрибируемая спейсерная область (ITS), частичные последовательности генов β-тубулина (BenA) и кальмодулина (CaM). Размер амплифицированных фрагментов составил ~1500 п.о. для ITS региона, ~500 п.о. для BenA и ~600 п.о. для CaM. По результатам BLAST-анализа последовательность ITS региона была на 100% идентична последовательности типового (ex-type) штамма P. polonicum CBS 222.28^T, в то время как последовательности генов BenA и CaM были идентичны более чем на 99%. Филогенетическое дерево, построенное на основе объединенных ITS–BenA–CaM последовательностей, показало, что штамм KMM 4719 группируется с P. polonicum CBS 222.28^T (рис. 1).

 

Рис. 1. Филогенетическое дерево, построенное методом ML на основе объединенных последовательностей ITS-BenA-CaM, показывающее филогенетическое положение штамма KMM 4719 среди представителей рода Penicillium секции Fasciculata серии Viridicata. Достоверность дерева оценивали бутстреп-тестом в 1000 реплик, значения (%) которого указаны во внутренних узлах. Шкала показывает количество нуклеотидных замен на сайт.

 

Таким образом, на основе молекулярно-генетического анализа штамм KMM 4719, выделенный из трепанга Apostichopus japonicus, был идентифицирован как P. polonicum.

Мицелиальные грибы рода Penicillium являются постоянными компонентами грибных комплексов морских экосистем, включая глубоководные места обитания. Присутствие видов Penicillium в море было неоднократно показано культуральными методами на агаризованных средах, а также с помощью методов метагеномного анализа [10, 26–28]. Они выделяются из разнообразных субстратов растительного и животного происхождения, а также морских грунтов. Более 60 видов Penicillium, в том числе секции Fasciculata, были включены в список морских грибов ввиду их частой встречаемости в море на разнообразных субстратах [29]. Как и многие виды Penicillium, представители секции Fasciculata характеризуются высокой метаболической активностью и адаптационными возможностями, позволяющие им использовать широкий спектр органических субстратов, встречающихся в море.

Согласно современному представлению о структуре рода Penicillium вид P. polonicum относится к серии Viridicata секции Fasciculata подрода Penicillium. Секция Fasciculata объединяет психротолерантные виды, которые способны развиваться в условиях с низкими показателями активности воды. Серия Viridicata является типичным примером политетической серии, поскольку ни один из метаболитов, продуцируемых грибами из этой серии, не является для них общим.

В настоящее время серия Viridicata включает 8 видов — P. polonicum, P. freii, P. neoechinulatum, P. viridicatum, P. aurantiogriseum, P. cyclopium, P. tricolor и P. melanoconidium, которые в наземной среде чаще всего ассоциированы с хранящимися зерновыми культурами [30]. В морской среде обитания представители серии Viridicata встречаются в грунтах, ассоциированных с растительными и животными гидробионтами [31–33]. В частности, вид P. polonicum был обнаружен в образцах глубоководного грунта, а также доминировал в пробах грунта, воды и различных макроорганизмов, собранных вдоль побережья Корейского полуострова [10, 34].

Выделение и установление строения вторичного метаболита. В результате хроматографического разделения этилацетатного экстракта культуры гриба P. polonicum было выделено индивидуальное соединение 1. Структура выделенного соединения 1 (рис. 2) была установлена с помощью данных ЯМР и МС, как 3-O-метилвиридикатин (1). Спектральные характеристики полностью соответствовали литературным данным для 3-O-метилвиридикатина, выделенного из экстракта гриба OS-F67406 [35].

 

Рис. 2. Структурная формула 3-O-метилвиридикатина (1).

 

Исследование антимикробной активности. 3-O-Метилвиридикатин в концентрации 100 мкМ (25.1 мкг/мл) не влиял на рост грамположительных бактерий Staphylococcus aureus и грамотрицательных бактерий Escherichia coli, но подавлял рост дрожжеподобных грибов Candida albicans на 23.2%. Ранее 3-О-метилвиридикатин показал антимикробную активность в отношении S. aureus ATCC 6538 с МИК 17.9 мкМ (4.5 мкг/мл), измеренной с помощью реактива МТТ [36]. К таким значительным расхождениям в результатах могло привести как использование разных методов оценки активности, так и разная чувствительность использованных штаммов S. aureus.

Одним из факторов вирулентности микроорганизмов является фермент уреаза (EC 3.5.1.5, urea amidohydrolase) — никель (Ni²⁺)-зависимая гидролаза, обеспечивающая гидролиз мочевины, до NH₃ и CO₂. В связи с ее ролью в жизнедеятельности микробных патогенов было изучено влияние 3-О-метилвиридикатина на уреазную активность.

3-O-Метилвиридикатин в бесклеточном тесте ингибировал активность фермента уреазы на 50% (ИК₅₀) в концентрации 97.3 мкМ. Для детализации взаимодействия 3-O-метилвиридикатина с уреазой был проведен молекулярный докинг. В базе данных PDB имеет ограниченное количество структур уреазы, которая является довольно консервативной для растений, грибов и бактерий, поэтому для докинга была выбрана структура уреазы Canavalia ensiformis (PDB ID 4H9M). Для сравнения также был проведен докинг уреазы с тиомочевиной.

Активный центр уреазы C. ensiformis расположен в C-концевом (αβ)8 TIM бочкообразном домене (402–701 и 762–840), соединенном с β-доменом (286–401 и 702–761), который, в свою очередь, соединен с αβ-доменом (135–285) и N-концевым αβ-доменом (1–134), вместе образующими две “ручки”. Каталитический двуникелевый центр содержит два иона никеля, один из которых связан с His519, His545, и Lys490, а другой с His407, His409, Asp633 и также Lys490. Также в формировании активного центра принимают участие His492, Asp494, Cys592, His593, Arg609, Asp633 и Ala636 [25].

Согласно проведенным расчетам (табл. 2), тиомочевина в активном центре образует шесть водородных связей с His492, Ala440, Asp633, Asp633 и Gly550, а также гидрофобные взаимодействия с Gly550, Ala440 и Ala636, что соответствует известным литературным данным [37]. Визуализация комплекса приведена на рис. 3.

 

Таблица 2. Расчетные данные комплексов 3-O-метилвиридикатина и тиомочевины с уреазой

Лиганд	∆G, ккал/моль	FF score, ккал/моль	Водородные связи, длина Å	Гидрофобные взаимодействия
Тиомочевина	–6.419	–3873.224	His492…S, 2.715 Ala440…H, 2.976 H…Asp633, 2.506 Ala636…N, 3.514 H…Asp633, 2.151 H…Gly550, 1.903	Gly550, Ala440, Ala636
3-O-Mетилвиридикатин	–6.924	–3753.446	Lys709…O, 2.449	Leu77, Lys709, Gly396
	–7.008	–3754.145	нет	Leu77, Ile133, Lys709, Gly135, Gly396, Ile137
	–6.559	–3748.669	H…Asp295, 2.308 Asn836…O, 2.388 Arg132…O, 2.436 Asn131…O, 2.573	Thr830, Val831

 

Рис. 3. Рассчитанный комплекс уреазы (PDB ID 4H9M) и тиомочевины. Зелеными линииями показаны водородные связи, желтыми гидрофобные взаимодействия между лигандом и мишенью: (а) общий вид, (б) увеличенное изображение.

 

Уреаза является одним из вирулентных факторов для бактерий Helicobacter pylori, Yersinia enterocolitica и Staphylococcus aureus [38], a также для грибов [39], в том числе грибных патогенов Cryptococcus neoformans [40] и Aspergillus fumigatus [41]. В то же время гемиасковые грибы, такие как Candida albicans и Saccharomyces cerevisiae, утилизируют мочевину с помощью биотин-зависимой амидолиазы Dur1,2 [42], в связи с чем нет оснований считать, что подавление роста Candida albicans под действием 3-O-метилвиридикатина (1) связано с его влиянием на активность уреазы. При этом, вероятно, ингибирование активности уреазы может, в том числе, обуславливать влияние 3-O-метилвиридикатина на фитопатогенные грибы Alternaria alternata и A. brassicae, описанное ранее [43].

Способность ингибировать активность уреазы была показана для природных и синтетических соединений, относящихся к 20 различным классам [44], однако только ацетогидроксамовая кислота нашла практическое применение в качестве лекарственного средства “Lithostat” при инфекции Helicobacter pilori [45]. В связи с этим обнаруженная способность 3-O-метилвиридикатина ингибировать активность этого фермента открывает перспективы для его дальнейшего исследования.

Цитотоксическая и цитопротекторная активность. Также было оценено влияние 3-O-метилвиридикатина на клетки млекопитающих. Это соединение в концентрации 100 мкМ уменьшало жизнеспособность клеток гепатокарциномы человека линии HepG2 на 48.9% по сравнению с необработанными клетками и жизнеспособность нормальных кардиомиоцитов крысы линии Н9с2 — на 56.3% по сравнению с контролем. Рассчитанная ИК₅₀ для кардиомиоцитов составила 89.1 мкМ. Для исследования гепатопротекторного и кардиопротекторного действия 3-O-метилвиридикатин использовался в концентрации 10 мкМ, при которой он не оказывал токсического действия на жизнеспособность клеток.

Для моделирования in vitro алкогольного поражения печени клетки гепатокарциномы линии HepG2 подвергали действию 5%-ного этанола в течение 1 ч, после чего добавляли 3-O-метилвиридикатин, и жизнеспособность клеток оценивали через 24 ч. Под действием этанола жизнеспособность клеток HepG2 снижалась на 46.9 ± 5.3%, и соединение 1 не оказало на них какого-либо заметного влияния.

Для моделирования in vitro хронической гипоксии кардиомиоциты Н9с2 подвергали действию хлорида кобальта (II) в концентрации 500 мкМ, и через 1 ч к ним добавляли 3-O-метилвиридикатин. Жизнеспособность клеток оценивали через 48 ч. Инкубирование кардиомиоцитов Н9с2 с CoCl₂ приводило к уменьшению их жизнеспособности на 45.9%. Под действием соединения 1 наблюдалось увеличение жизнеспособности обработанных клеток на 20.1% (рис. 4). При этом ДФПГ радикал-связывающая активность в бесклеточном тесте для соединения 1 была незначительной.

 

Рис. 4. Рассчитанный комплекс уреазы (PDB ID 4H9M) и 3-O-метилвиридикатина (1). Зелеными обозначены водородные связи: (а) комплекс 3-О-метилвиридикатина с аминокислотными остатками β домена уреазы (ΔG = = –6.924 ккал/моль), (б) комплекс 3-О-метилвиридикатина, расположенный между N-концевым αβ и C-концевым (αβ)8 TIM доменами (ΔG = –6.559 ккал/моль).

 

Ранее 3-O-метилвиридикатин, выделенный из морского штамма Aspergillus versicolor Y31-2, не проявлял активности в отношении клеток линии MCF-7, SMMC-7721, HEK293, A549 и T-47D [46]. При этом он ингибировал продукцию фактора некроза опухоли α (TNF-α) [35], в том числе ЛПС-индуцированную, в клетках линии THP-1 и PBMCs в концентрации 10 мкМ [47]. Однако механизм ингибирования не был изучен и остается неясным.

При моделировании хронической гипоксии с помощью CoCl₂ в нейрональных клетках и кардиомиоцитах обнаруживаются эффекты, схожие с наблюдаемыми при низком содержании кислорода: окислительный стресс, активация NF-kB зависимого пути воспаления, что приводит к увеличению продукции TNF-α и других цитокинов, апоптоз и, в результате, гибель клеток [47]. Обнаруженное кардиопротекторное действие 3-O-метилвиридикатина в in vitro модели может быть обусловлено его противовоспалительной активностью.

Таким образом, впервые было показано, что метаболит гриба P. polonicum KMM 4719 3-O-метилвиридикатин способен ингибировать активность фермента уреазы, а также проявлять кардиопротективное действие в модели хронической гипоксии.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Исследование поддержано грантом Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках Федеральной научно-технической программы развития генетических технологий на 2019–2027 годы (соглашение № 075–15-2021-1052).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

В данной работе отсутствуют исследования с участием человека или животных.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы данной работы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

About the authors

S. S. Starnovskaya

G.B. Elyakov Paсific Institute of Bioorganic Chemistry, Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: starnovskaya_ss@piboc.dvo.ru
Russian Federation, Vladivostok, 690022

N. N. Kirichuk

G.B. Elyakov Paсific Institute of Bioorganic Chemistry, Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: starnovskaya_ss@piboc.dvo.ru
Russian Federation, Vladivostok, 690022

V. E. Chausova

G.B. Elyakov Paсific Institute of Bioorganic Chemistry, Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: starnovskaya_ss@piboc.dvo.ru
Russian Federation, Vladivostok, 690022

U. V. Khudyakova

G.B. Elyakov Paсific Institute of Bioorganic Chemistry, Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: starnovskaya_ss@piboc.dvo.ru
Russian Federation, Vladivostok, 690022

E. A. Chingizova

G.B. Elyakov Paсific Institute of Bioorganic Chemistry, Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: starnovskaya_ss@piboc.dvo.ru
Russian Federation, Vladivostok, 690022

A. R. Chingizov

G.B. Elyakov Paсific Institute of Bioorganic Chemistry, Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: starnovskaya_ss@piboc.dvo.ru
Russian Federation, Vladivostok, 690022

A. N. Yurchenko

G.B. Elyakov Paсific Institute of Bioorganic Chemistry, Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: starnovskaya_ss@piboc.dvo.ru
Russian Federation, Vladivostok, 690022

E. A. Yurchenko

G.B. Elyakov Paсific Institute of Bioorganic Chemistry, Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: starnovskaya_ss@piboc.dvo.ru
Russian Federation, Vladivostok, 690022

References

Supplementary files