Identification of the Causal Agent of Downy Mildew of Plasmopara viticola Grapes by Quantitative PCR

Full Text

Plasmopara viticola (P. viticola, Berk. & M.A. Curtis; Berl. & De Toni) ‒ облигатный патогенный оомицет, вызывающий ложную мучнистую росу винограда, является одним из наиболее опасных патогенов для виноградарства во всем мире [1]. P. viticola поражает молодые, зеленые листья и плодовые ткани винограда, вызывая серьезные потери урожая (40–90%) за короткие промежутки времени [2]. Этот патоген винограда способен пройти множество циклов заражения растения за один сезон роста при благоприятных погодных условиях, таких как высокое количество осадков и умеренные температуры. В результате высокой скорости спорообразования патогена, эпидемии ложной мучнистой росы, распространяющиеся на большие территории виноградников, могут начаться из спорадических очагов инфекции. Следовательно, специфическое выявление P. viticola очень важно для прогнозирования заболевания и борьбы с ним.

К традиционным методам обнаружения ооспор P. viticola в листьях винограда относятся прямые микроскопические наблюдения листьев [3–6], и косвенная оценка с использованием биоанализа “плавающего диска листа винограда” (“floating grape leaf disc”), где фрагменты листьев, содержащие ооспоры, погружают в воду в присутствии не зараженных плавающих листовых дисков, таким образом зооспоры, происходящие из ооспор, вызывают инфекцию у здоровых листовых дисков, тяжесть которой пропорциональна количеству ооспор [7].

Традиционные методы оценки не позволяют количественно определить P. viticola в инфицированных образцах, особенно в образцах с низкой концентрацией патогена. В настоящее время существуют новые более эффективные подходы к идентификации оомицета P. viticola в тканях винограда: 1) спектрофотометрический метод для определения жизнеспособности спорангиев и зооспор оомицета P. viticola [8]; 2) нецелевой метаболомный подход (высокочувствительные методы на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии с применением масс-спектометрии, ВЭЖХ-МС), при котором происходит идентификация плазмоспецифичных липидных производных [9]; 3) молекулярные методы с высокой специфичностью и чувствительностью для количественного определения патогена, такие как количественная ПЦР с детекцией результатов в реальном времени (ПЦР РВ) [10–12] и метод петлевой изотермической амплификации (ПИА, или Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP) [13]. Вальсеси с соавт. [11] разработали мультиплексный метод ПЦР РВ с использованием флуоресцентных зондов типа TaqMan для относительного количественного определения ДНК P. viticola непосредственно из листьев Vitis vinifera, где использовали праймеры, подобранные к участку последовательности внутреннего транскрибируемого спейсера 1 (ITS1) — 5.8S рДНК. Позднее, в работе Аммур с соавт. [10] использовали аналогичный анализ для количественного определения количества ДНК P. viticola в зараженных, стареющих листьях. Идентификация ложной мучнистой росы при помощи метода ПИА была разработана на основе последовательности ITS1 P. viticola, этот анализ обладал высокой чувствительностью и был способен обнаружить присутствие менее 33 фг геномной ДНК P. viticola на 25 мкл реакции в течение 30 мин [13]. Таким образом, все представленные методы в основном использовались для обнаружения P. viticola в листьях с симптомами ложной мучнистой росы, и не использовались для обнаружения P. viticola в бессимптомных листьях винограда.

Стоит отметить, что скорость проявления симптомов ложной мучнистой росы у внешне здоровых листьев после заражения P. viticola до сих пор неизвестна. Раннее определение патогена P. viticola у визуально здоровых растений винограда позволит своевременно применять методы борьбы с ложной мучнистой росой, что, безусловно, является ключевыми фактором для снижения риска потери урожая, а также ограничит обработку фунгицидами здоровых виноградных лоз, что в целом позволит снизить экологическую нагрузку сельского хозяйства на природную среду.

Цель данного исследования ‒ разработка наиболее эффективной пары праймеров для молекулярно-количественного определения P. viticola во внешне здоровых, без проявлений симптомов ложной мучнистой росы, образцах винограда при помощи метода ПЦР РВ на основе флуоресцентного красителя SYBR Green I.

МЕТОДИКА

Растительный материал и условия поверхностной стерилизации. В июле 2022 года всего было собрано 19 образцов винограда (табл. 1). Все образцы, за исключением M-dm, выглядели здоровыми, без симптомов ложной мучнистой росы. С каждого растения мы отбирали минимум по 2 молодых побега и 2 листа.

 

Таблица 1. Образцы винограда, собранные в июле 2022 года

№	Сокращение	Местоположение
Vitis amurensis
1	Gh	Теплица ФНЦ Биоразнообразия ДВО РАН, г. Владивосток
2	M	Плодовый питомник “Макаревич”, г. Уссурийск
3	M-dm	V. amurensis с видимыми симптомами P. viticola, “Макаревич”, г. Уссурийск
4	S-Va	Ботанический сад, г. Южно-Сахалинск
5	P-1	Пригород г. Владивостока
6	P-2	Пригород г. Владивостока
7	P-3	о. Русский, г. Владивосток
8	P-4	о. Рикорда, юг Приморского края
9	P-5	с. Ивановка, Приморский край
10	P-6	Верхне-Уссурийская научно-исследовательская станция ФНЦ Биоразнообразия ДВО РАН
11	Kh-1	с. Литовко, юг Хабаровского края
12	Kh-2	Силинский лес, юг Хабаровского края
Vitis coignetiae
13	S-1	Ботанический сад, г. Южно-Сахалинск
14	S-2	г. Холмск, о. Сахалин
15	S-3	г. Невельск, о. Сахалин
Сорта винограда из плодового питомника “Макаревич”
16	Ad	V. vinifera × V. amurensis cv. Адель (гибрид No. 82-41 F³)
17	Muk	Vitis riparia × V. vinifera cv. Мукузани (происхождение неизвестно)
Сорта винограда из коммерческого виноградника “PRIM ORGANICA”
18	Alfa	Vitis labrusca × V. riparia cv. Альфа,
19	Pr-St	Vitis Elmer Swenson 2-7-13 cv. Прэйри Стар

 

Образцы винограда (листья и стебли) промывали под проточной водой с мылом (“Альтсепт М”, Россия). В асептических условиях взвешивали 0.2 г ткани каждого образца винограда. Затем образцы промывали в 70%-ном спирте в течение 2 мин, 1 мин в 10%-ном растворе пероксида водорода и стерильной водой 5 раз.

Выделение ДНК, подготовка библиотеки и секвенирование Illumina MiSeq. ДНК была выделена из 0.2 г поверхностно-стерилизованных образцов винограда, с использованием метода ЦTAБ-спин, как описано ранее [14]. Для высокопроизводительного секвенирования с использованием технологии Illumina первая техническая повторность образцов ДНК была отправлена в коммерческую организацию “Синтол” (Россия), как описано ранее [15], вторую техническую повторность образцов использовали для ПЦР РВ. Для определения качества и количества ДНК ее анализировали с помощью прибора Nanodrop-1000 (“Nanodrop”, США) и квантового флуорометра Quantus (“Promega”, США). Библиотеки были тщательно подготовлены к секвенированию в точном соответствии с протоколом, изложенным в руководстве “Подготовка библиотеки для метагеномного секвенирования 16S” (часть № 15,044,223 Rev. B; Illumina, США). Праймеры ITS1f (5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3') и ITS2 (5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3') были использованы для амплификации участков рДНК ITS1 грибов и грибоподобных организмов во всех образцах. Реагенты Nextera® XT Index Kit (“Illumina”, США) использовались для индексации ампликонов. Библиотечный пул подвергся секвенированию на платформе Illumina MiSeq с использованием набора реагентов MiSeq Reagent Kit v2 (“Illumina”, США). Считывание последовательностей ампликонов проводилось с обоих концов по 250 п.н.

Данные высокопроизводительного секвенирования были успешно депонированы в базу данных Национального центра биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information, NCBI, США) под регистрационными номерами PRJNA980748 и PRJNA998468 и в базе данных лаборатории биотехнологии Федерального научного центра биоразнообразия наземной биоты Восточной Азии, ДВО РАН, Россия (https://biosoil.ru/downloads/biotech/Metagenoms/) [15].

Предварительную обработку полученных данных и таксономическую идентификацию последовательностей ITS1 проводили, как описано в Нитяговский с соавт. [15].

Дизайн праймеров и количественный ПЦР с детекцией результатов в реальном времени (ПЦР РВ). Для количественного анализа присутствия P. viticola в собранных образцах были разработаны шесть специфических пар праймеров в соответствии с биоинформатическим анализом и литературными данными. Дизайн праймеров выполняли с использованием инструмента Primer-BLAST [16] со следующими параметрами: длина ампликона 70–180 п.н., температура плавления (Tm) 59–62°C, содержание GC 50–60%, нацелены только на последовательности P. viticola. Были использованы три специфические пары праймеров PvITS1_1-real-s/a, PvITS1_2-real-s/a (разработанные в этой статье) и Giop [10], предназначенные для амплификации ITS1 P. viticola (ГенБанк: ON183972.1); две специфические пары праймеров PvCox1_1-real-s/a, PvCox1_2-real-s/a для амплификации участка ДНК субъединицы цитохром С оксидазы I (Cox1) (ГенБанк: NC_045922.1, область от 12520 п.н. до 13998 п.н.); две специфические пары праймеров PvCox2_1-real-s/a и PvCox2_2-real-s/a для субъединицы цитохром С оксидазы II (Cox2) (ГенБанк: KP684906.1). Для детекции P. viticola был использован метод ПЦР РВ с генами ITS1, Cox1 и Cox2 в качестве целевых. Благодаря этим уникальным последовательностям ДНК была достигнута необходимая точность определения P. viticola [17, 18]. Праймеры, используемые для ПЦР РВ представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Праймеры, используемые для ПЦР РВ для диагностики P. viticola в образцах винограда

Праймер	Последовательность праймера	Участок гена (№ в ГенБанке	Длина ампли-кона, п.н.	Tm, *°C	GC**, %	Ссылка
PvITS1_1-real-s	5'-GGCGGTTGCAGCTAATGGAT-3'	ITS1 (ON183972.1)	120	61.1	55	Данная статья
PvITS1_1-real-a	5'-AGCGAAGACTTTCGTCCTCACA-3'			61.9	50
PvITS1_2-real-s	5'-CCACGTGAACCGTTTCAACCA-3'	ITS1 (ON183972.1)	83	61.6	52.4	Данная статья
PvITS1_2-real-a	5'-CCATTAGCTGCAACCGCCAA-3'			61.6	55
Giop-F	5′-TCCTGCAATTCGCATTACGT-3'	ITS1 (ON183972.1)	208	63.4	45	[10]
Giop-R	5'-GGTTGCAGCTAATGGATTCCTA-3'			63.3	45.5
PvCox1_1-real-s	5'-ACCTGTTCTAGCCGGTGCTATT-3'	Cox1 (NC_045922.1 12520-13998)	90	61.5	50	Данная статья
PvCox1_1-real-a	5'-ACCGGATCACCACCTCCAGA-3'			62.5	60
PvCox1_2-real-s	5'-GCGTGCTCCGGGTTTAAGTT-3'	Cox1 (NC_045922.1 12520-13998)	105	61.2	55	Данная статья
PvCox1_2-real-a	5'-ATAGCACCGGCTAGAACAGG-3'			59.3	55
PvCox2_1-real-s	5'-TGGTTCCGGAAAGTGATTTAGCA-3'	Cox2 (KP684906.1)	178	60.5	43.5	Данная статья
PvCox2_12-real-a	5'-TGATTTAAGCGGCCCGGACA-3'			62.2	55
PvCox2_2-real-s	5'-CAGATGTTTTACACTCATGGGCGA-3'	Cox2 (KP684906.1)	73	61.4	45.8	Данная статья
PvCox2_12-real-a	5'-TGATTTAAGCGGCCCGGACA-3'			62.2	55

* Tm — температура плавления праймеров; GC — процентное содержание гуанина (G) и цитозина (C) в праймере.

 

ПЦР РВ проводили с использованием дополнительных образцов ДНК (второй технической повторности), которые были извлечены ранее из тех же растений в то же время, но не отправлены для высокопроизводительного секвенирования (1–5 образцов для каждого растения винограда). ДНК амплифицировали в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 1× Taq буфер с 2.5 мМ MgCl₂, 250 мкМ дНТФ, 0.25 мкМ каждого из праймеров, 1× SybrGreen I, 1 ед. активности Taq ДНК полимеразы, 1 мкл ДНК. Реактивы для ПЦР РВ использовали от “Евроген” (Россия). Синтез геноспецифических праймеров заказывали в “Евроген” (Россия). Амплификацию проводили при следующих условиях: 2 мин при 95°C, затем 50 циклов 95°C 10 с и 62°C 25 с.

Для проведения ПЦР РВ использовали детектирующий амплификатор ДТ Прайм (“НПО ДНК-Технология”, Россия) с программным обеспечением RealTime_PCR v7.3. Для обсчета результатов амплификации использовали режим “количественного анализа со стандартами”. Данный режим анализа позволяет определить количество искомого фрагмента ДНК в образце за счет использования калибровочных образцов (стандарты, разведение ДНК из пробы “Mildew”). При наличии калибровочных образцов программа RealTime_PCR v7.3 автоматически строит калибровочную прямую и определяет концентрацию в анализируемых пробах.

В качестве стандартов была использована ДНК, выделенная из листа винограда V. vinifera с признаками ложной мучнистой росы, которую подтвердили специалисты из ФГБНУ “ФНЦ агробиотехнологий Дальневого Востока им. А.К. Чайки” им. А.К. Чайки (Россия). Этот образец (Mildew) был получен в августе 2023 г. с Дальневосточной опытной станции филиала Института растениеводства им. Вавилова (Россия).

ДНК из образца Mildew была разведена стерильной водой до концентрации 20, 4, 0.8 и 0.16 нг/мкл и использована по 1 мкл на реакцию в качестве калибраторов в ПЦР РВ. Похожим образом проводили ПЦР РВ как с использованием праймеров к участкам последовательностей P. viticola (табл. 2), так и с использованием праймеров к генам “домашнего хозяйства винограда” VaGAPDH и VaActin [19]. Полученные таким образом значения уровня амплификации последовательностей P. viticola делили на значения, полученные для генов VaGAPDH и VaActin из соответствующих проб. Далее данные были представлены в виде среднего ± стандартная ошибка (SE) и обсчитаны с помощью одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим тестом множественного сравнения Tukey HSD, выполненным с использованием R пакета Stats (https://www.r-project.org, дата обращения 6 марта 2024 г.) [20]. Значение p < 0.05 считалось статистически значимым. График корреляции Пирсона между данными ПЦР РВ и метатаксонамического анализа был получен с использованием R пакета ggpubr (дата обращения 6 марта 2024 г.) [21].

Для количественной оценки амплификации изучаемых последовательностей использовали шестнадцать технических повторов (восемь реакций ПЦР РВ, нормализованных к участку гена VaGAPDH и восемь реакций ПЦР РВ к VaActin).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ эффективности применения ПЦР РВ SYBR Green I для диагностики Plasmopara viticola в винограде. На основе литературных данных и с использованием биоинформатического анализа было разработано шесть пар праймеров для детекции P. viticola в образцах винограда. При анализе эффективности ПЦР РВ только три специфические пары праймеров: PvITS1_1-real-s/a, PvITS1_2-real-s/a и PvCox1_1-real-s/a, имели эффективность близкую к 100% (табл. 3).

 

Таблица 3. Эффективность праймеров, используемых для ПЦР РВ для диагностики P. viticola в образцах винограда

Название праймеров	Эффективность ПЦР РВ, %	Ct для I и IV стандартов	Ct для Nc
PvITS1_1-real-s	98 ± 4	15.8–22.8	–
PvITS1_1-real-a
PvITS1_2-real-s	102 ± 6	15.2–22.2	27.8
PvITS1_2-real-a
Giop-F	154 ± 14	35.7–42.8	43.8
Giop-R
PvCox1_1-real-s	107 ± 7	16.8–23.5	33.8
PvCox1_1-real-a
PvCox1_2-real-s	124 ± 11	17.9–24.9	28.6
PvCox1_2-real-a
PvCox2_1-real-s	85 ± 6	23.0–29.7	34.6
PvCox2_12-real-a
PvCox2_2-real-s	112 ± 7	19.2–25.6	33.4
PvCox2_12-real-a

Примечание: Ct — пороговый цикл; стандарты I–IV — серия 5-кратных разведений ДНК (20, 4, 0.8 и 0.16 нг на пробу) из листьев V. vinifera с симптомами ложной мучнистой росы; Nc — отрицательный контроль.

 

Сравнение данных ПЦР РВ с ранее полученными данными высокопроизводительного секвенирования по относительной представленности P. viticola в образцах винограда. Образцы, собранные с тех же растений, но не отправленные для высокопроизводительного секвенирования, подвергали анализу ПЦР РВ SYBR Green I на наличие патогена с использованием выбранных пар праймеров. Полученные данные ПЦР РВ сравнивали с данными высокопроизводительного секвенирования, полученными ранее [15] (рис. 1). На 3 растениях (P-4, S-1, M-dm) методом ПЦР РВ была выявлена относительно высокая средняя представленность патогена (5.5–61%), сопоставимая с данными, полученными в результате высокопроизводительного секвенирования. Согласно данным ПЦР РВ, относительный уровень количества ампликонов в пробах, где использовалась ДНК винограда с видимыми симптомами ложной мучнистой росы винограда (M-dm), был выше (за исключением PvCox1_1) по сравнению с другими образцами растений без видимых симптомов (рис. 1а). В 15 пробах, где в качестве матрицы была использована ДНК образцов винограда Gh-1, P-1, P-2, P-3, P-5, P-6, Kh-1, Kh-2, S-Va, S-2, S-3, Ad, Muk, Alfa, Pr-St относительный уровень амплификации ампликонов P. viticola с использованием праймеров PvITS1_2-real-s/a и PvCox1_1-real-s/a по данным ПЦР РВ не отличался от отрицательного контроля. Из них у 11 пробах (Gh-1, P-1, P-2, P-3, P-5, P-6, Kh-1, S-Va, S-2, Alfa, Pr-St) уровень амплификации ПЦР РВ соответствовал отсутствию или низкой средней представленности патогена (0–1%) по данным метатаксономического анализа. В 4 пробах (Kh-2, S-3, Ad, Muk) результаты ПЦР РВ не согласовывались с методом высокопроизводительного секвенирования. Эти результаты могли быть связаны с крайне неравномерным распределением патогена внутри растения, поскольку мы провели ПЦР РВ на резервных образцах винограда, которые не были отправлены для высокопроизводительного секвенирования (рис. 1).

 

Рис. 1. Количественное определение амплификации участков последовательностей PvITS1_1, PvITS1_2 и PvCox1_1 в образцах ДНК винограда, выполненное методом ПЦР РВ (а); относительная представленность P. viticola в образцах NGS (б). Происхождение всех проб указано в табл. 1. Nc — реакция ПЦР РВ без ДНК винограда. n.m. — не измерялась. Данные представлены в виде среднего значения ± SE (объединенные данные по образцам листьев и стеблей одного растения). Средние значения на каждой цифре, за которой следует одна и та же буква, не отличались при использовании одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим тестом множественного сравнения Тьюки.

 

Средний уровень амплификации ПЦР РВ с использованием праймеров PvITS1_1-real-s/a, PvITS1_2-real-s/a и PvCox1_1-real-s/a в резервной копии образцов ДНК винограда имел высокую корреляцию со средней относительной представленностью ITS1 P. viticola по данным высокопроизводительного секвенирования (рис. 2). Уровень коэффициента корреляции Пирсона между оценками среднего относительного уровня амплификации по данным ПЦР РВ и средней относительной представленности P. viticola в образцах NGS был самым высоким для амплификации с использованием праймеров PvITS1_2-real-s/a (R = 0.86, p < 0.001) (рис. 2).

 

Рис. 2. Определение коэффициента корреляции Пирсона взаимосвязи между оценками относительного уровня амплификации по данным ПЦР РВ (отн. ед.) и относительной представленностью ампликонов ITS1 P. viticola в образцах NGS: 1, 2. 3 ‒ линии линейной регрессии для ампликонов PvITS1_1, PvITS1_2 и PvCox1_1 соответственно.

 

Специфическое выявление фитопатогенов сельскохозяйственных культур очень важно для прогнозирования очагов заболевания и борьбы с ними. В статье предложен более чувствительный и дешевый метод диагностики с использованием ПЦР РВ на основе флуоресцентного красителя SYBR Green I, а также разработано 6 пар праймеров ПЦР РВ (табл. 2). Согласно результатам эффективности ПЦР РВ, наиболее эффективными праймерами были PvITS1_1-real-s/a, PvITS1_2-real-s/a и PvCox1_1-real-s/a (табл. 3). Кроме того, коэффициент корреляции Пирсона был самым высоким, когда использовались праймеры PvITS1_2-real-s/a (рис. 2). Таким образом, данные ПЦР РВ подтвердили результаты высокопроизводительного секвенирования, где наибольшая представленность P. viticola, в дополнение к образцам винограда с видимыми симптомами ложной мучнистой росы, была обнаружена в образцах винограда, собранные на о. Рикорд и в ботаническом саду на о. Сахалин (рис. 1). Кроме того, был проведен анализ стоимости детекции P. viticola в образцах винограда с помощью ПЦР РВ, метагеномного анализа и ПИА. Учитывая затраты на необходимые расходные материалы, приобретенные на российском рынке, предполагаемые затраты на анализ одного образца винограда с использованием ПЦР РВ составили 500 рублей, в то время как использование высокопроизводительного секвенирования на базе Illumina составило 6000 рублей. Ранее сообщалось, что стоимость метода ПИА составляло примерно 650 рублей за один образец [22]. Следовательно, разработанные праймеры для ранней детекции P. viticola представляют весьма выгодную альтернативу методам NGS и ПИА.

Разработанный в этом исследовании количественный метод, основанный на ПЦР РВ модификации SYBR Green I, имеет также большие преимущества по сравнению с традиционными визуальными анализами и анализами in vitro, требующими относительно много времени, но позволяют быстро с высокой точностью определить количество патогена в винограде. Применение метода ранней диагностики P. viticola на виноградниках Дальнего востока России, где относительно высокая влажность и умеренные температуры создают благоприятные условия для размножения данного оомицета [23], может позволить детектировать данный патоген до появления первых симптомов, что в целом снизит серьезность эпидемии в период вегетации. Предложенный метод целесообразно применять за пару недель до потенциальной вспышки милдью и, в первую очередь, анализировать подверженные ложной мучнистой росе сорта винограда. Для более точной диагностики рекомендуется использовать 2 листа и 2 молодых побега винограда на одну виноградную лозу, чтобы исключить неравномерное распределение патогена внутри растения. Более того, мы столкнулись с тем, что многие зараженные растения, не имели симптомов поражения милдью. Также симптомы ложной мучнистой росы схожи с другими болезнями винограда, например оидиумом, но эти болезни требуют разных методов лечения. Кроме того, информация об отсутствии P. viticola у бессимптомных растений позволит избежать дополнительной превентивной обработки химическими реагентами, что также благоприятно скажется на качестве урожая и будет экономически оправдано.

Таким образом, применение разработанного метода ранней детекции P. viticola на основе ПЦР РВ может предоставить полезную информацию для руководства по применению фунгицидов и потенциально повысить эффективность борьбы с ложной мучнистой росой на виноградниках.

* * *

В работе разработан относительно дешевый и эффективный метод ранней диагностики возбудителя ложной мучнистой росы винограда P. viticola на основе количественного метода ПЦР РВ модификации SYBR Green I. Эффективность данного метода подтверждена полученными ранее данными высокопроизводительного секвенирования по технологии Illumina, где была обнаружена линейная зависимость корреляции полученных данных. Применение данного метода может быть полезно в качестве диагностического инструмента для выявления P. viticola и борьбы с ложной мучнистой росой на коммерческих виноградниках.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 22-74-10001, https://rscf.ru/project/22-74-10001.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

В данной работе отсутствуют исследования человека или животных.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы данной работы заявляют, что у них нет конфликта интересов

About the authors

N. N. Nityagovsky

Federal Scientific Center of the Biodiversity, Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences, Laboratory of Biotechnology

Email: aleynova@biosoil.ru
Russian Federation, Vladivostok, 690022

A. A. Dneprovskaya

Federal Scientific Center of the Biodiversity, Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences, Laboratory of Biotechnology; Far Eastern Federal University, Institute of the World Ocean

Email: aleynova@biosoil.ru
Russian Federation, Vladivostok, 690022; Vladivostok, 690922

A. A. Ananev

Federal Scientific Center of the Biodiversity, Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences, Laboratory of Biotechnology

Email: aleynova@biosoil.ru
Russian Federation, Vladivostok, 690022

K. V. Kiselev

Federal Scientific Center of the Biodiversity, Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences, Laboratory of Biotechnology

Email: aleynova@biosoil.ru
Russian Federation, Vladivostok, 690022

О. А. Aleynova

Federal Scientific Center of the Biodiversity, Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences, Laboratory of Biotechnology

Author for correspondence.
Email: aleynova@biosoil.ru
Russian Federation, Vladivostok, 690022

References

Supplementary files