Phytostimulation Activity of Methylobacterium dichloromethanicum subsp. dichloromethanicum DM4 and Its groEL2 Gene Knockout Mutant

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

For the first time, the genome of the dichloromethane destructor Methylobacterium dichloromethanicum subsp. dichloromethanicum DM4 was analyzed for the presence of genetic determinants indicating its potential as a plant growth stimulator, and the ability of this strain and its groEL2 gene mutant for the to improve plant growth was determined. The genome of strain DM4 contains genes involved in the biosynthesis of phytohormones (indolyl-3-acetic acid and cytokinins), siderophores, carotenoids, poly-β-hydroxybutyrate, hydrolytic enzymes, as well as enzymes involved in the degradation of D-cysteine, protection from UV-damage and phosphate solubilization. Inoculation of lettuce sprouts by strain DM4 had a positive effect on plant growth and development, and increased adaptive defense and resistance to short-term temperature stress in plant growth experiments. Comparative analysis of the production of auxins, siderophores, hydrolytic enzymes, D-cysteine desulfohydrase activity, and the ability to solubilize insoluble phosphates in strains DM4 and DM4 ΔgroEL2 showed that disruption of the groEL2 gene led to a decrease in the synthesis of indole derivatives and phosphate solubilizing ability in the mutant strain. Assessment of the impact of inoculation of lettuce plants by these strains also demonstrated a decrease in the phytostimulation potential of DM4 ΔgroEL2 compared to the original strain. The data obtained indicate that the chaperonin GroEL2 in M. dichloromethanicum subsp. dichloromethanicum DM4 indirectly affects its phytostimulation activity.

Full Text

Аэробные метилотрофные бактерии — группа прокариот, использующих метан и его окисленные и замещенные производные в качестве источников углерода и энергии. Уникальный метаболизм метилотрофов, дающий им возможность минерализовать такие токсиканты, как метанол, формальдегид, метилированные амины, метилсернистые соединения и галометаны, а также повсеместное распространение в природе этих микроорганизмов зачастую требуют от них способности выживать в неблагоприятных и даже экстремальных условиях [1–4]. Известно, что метилотрофы эволюционно приспособились с высокой плотностью колонизировать филло- и ризосферу растений, поскольку образование растениями различных С1-соединений (метанол, метиламин и др.) создает предпосылки прочной метаболической взаимосвязи между ними [5, 6]. Для наиболее полно изученных в этом плане представителей розовоокрашенных факультативных метилотрофных бактерий (РОФМ) из родов Methylobacterium и Methylorubrum показано, что они являются типичными обитателями филлосферы и обладают рядом свойств, позволяющих стимулировать рост и развитие растений (фосфатсолюбилизация, синтез индолпроизводных, сидерофоров, гидролитических ферментов и др.) [7–9]. Однако, несмотря на то, что метилотрофные организмы используют токсичные субстраты и способны адаптироваться к неблагоприятным условиям на поверхности растений, в почвах и воде, они остаются практически не изученными с точки зрения функций основных клеточных шаперонов. Между тем, последние могут не только служить белками “домашнего хозяйства”, но и специализироваться на фолдинге уникальных ферментов, обеспечивая гибкость метаболизма своих хозяев.

Одной из наиболее важных групп таких шаперонинов являются белки теплового шока GroEL (Cpn60, Hsp60) и GroES (Cpn10, Hsp10). Они играют решающую роль в сворачивании полипептидов, склонных к агрегации и/или предназначенных для транспорта через мембрану, но также предотвращают летальную неспецифическую ассоциацию белков в стрессовых условиях [10–12]. Подобная работа белков стресс-ответа, очевидно, должна являться и фундаментальной частью симбиотического процесса, поскольку способствует адаптации бактерий, попадающих на поверхность растений, к неблагоприятным условиям на/в клетках или тканях растения-хозяина. Так, например, для ряда ризобий (Sinorhizobium meliloti, Rhizobium leguminosarum и Bradyrhizobium japonicum) было показано, что отдельные паралоги их множественных 60-кДа шаперонинов GroEL важны для симбиоза этих бактерий с бобовыми растениями и специфических стрессовых реакций [10, 13, 14]. Проведенный ранее анализ геномных последовательностей всех известных видов РОФМ родов Methylobacterium и Methylorubrum также выявил наличие множественных паралогов генов groEL у половины из них и позволил выделить три типичных для этих метилотрофов группы сходства кодируемых шаперонинов GroEL (GroEL1, GroEL2 и GroEL3). В результате, было предположено, что группа GroEL1, объединяет необходимые для жизнедеятельности клеток белки “домашнего хозяйства”, тогда как две других состоят из добавочных шаперонинов, отличающихся механизмами регуляции их синтеза и, возможно, функциями [15].

Первым представителем РОФМ, использованным для проверки вышеуказанной гипотезы посредством сайт-направленного мутагенеза, стал Methylobacterium dichloromethanicum subsp. dichloromethanicum (базоним M. dichloromethanicum) DM4. Этот штамм, выделенный из осадка промышленных сточных вод, является деструктором токсичного растворителя дихлорметана (ДХМ) и способен использовать это соединение в качестве единственного источника углерода и энергии [16]. Из двух присутствующих в геноме штамма DM4 гомологичных генов groEL, лишь один (groEL1) оказался жизненно важным для клеток метилотрофа, и его мутация была летальна. Напротив, нокаут-мутант DM4 ΔgroEL2 был жизнеспособен, но отличался от штамма дикого типа повышенной чувствительностью к кислотному, солевому стрессу и высушиванию, а также существенно сниженной скоростью роста с токсикантом ДХМ [17]. Таким образом, синтез добавочного шаперонина группы GroEL2, присутствующего у деструктора M. dichloromethanicum subsp. dichloromethanicum DM4, по-видимому, способствовал более эффективному ответу его клеток на стрессы, связанные с дегалогенированием ДХМ. Тем не менее, способность к минерализации ДХМ, отличающая штамм DM4 от других близкородственных метилотрофов, несомненно, является лишь одним из его свойств, на которые может оказывать влияние шаперонин GroEL2. Поскольку филогенетически M. dichloromethanicum subsp. dichloromethanicum DM4 кластеризуется совместно с представителями рода Methylorubrum и имеет высокий уровень сходства с широко распространенными фитосимбионтами M. extorquens [15, 18], было сделано предположение, что он также обладает механизмами адаптации к жизни с растениями и стимуляции их роста и развития. Цель настоящей работы — оценка генетического потенциала M. dichloromethanicum subsp. dichloromethanicum DM4 для стимуляции роста растений, а также сравнительный анализ фитостимулирующей активности исходного штамма DM4 и его производного, лишенного гена groEL2.

МЕТОДИКА

Объекты исследования и условия культивирования. В работе использовали штамм M. dichloromethanicum subsp. dichloromethanicum DM4 (VKM B-2191 = DSM 6343) [16] и ранее полученный на его основе нокаут-мутант DM4 ∆groEL2 [16]. Штаммы выращивали и поддерживали на минеральной среде ММ с метанолом (0.5%, об./об.), как описано ранее [19]. Для вегетационных опытов использовали суспензии клеток, выращенных до конца экспоненциальной фазы роста (ОП600 = 1.6–1.8).

Анализ генома. Для анализа генома штамма M. dichloromethanicum subsp. dichloromethanicum DM4 использовали последовательность, доступную в базе данных NCBI GenBank — GCA_000083545.1. Функциональную аннотацию и поиск генов проводили с помощью сервисов RAST (https://rast.nmpdr.org/) и KEGG (https://www.kegg.jp/blastkoala/) с последующей проверкой и коррекцией аннотации вручную в результате сравнения предсказанных генов с базами данных NCBI [20–22].

Анализ продукции индолпроизводных. Штаммы выращивали на модифицированной среде К1 (г/л): KH2PO4 — 2.0, KNO3 — 1.0, MgSO4·7H2O — 0.025, NaCl — 0.5, FeSO4·7H2O — 0.002, L-триптофан — 0.2, рН 7.2, при температуре 29°С, 180 об./мин в течение 3 сут. Образование индолпроизводных в культуральной жидкости анализировали, как описано ранее [23], с помощью реактива Сальковского [24]. Измерения проводили при длине волны 530 нм. Калибровочные кривые строили со стандартными растворами индолил-3-уксусной кислоты (“Sigma”, США).

Анализ продукции сидерофоров. Для количественного определения сидерофоров штаммы выращивали на модифицированной среде К без источника Fe3+ (г/л): KH2PO4 — 2.0, (NH4)2SO4 — 2.0, NaCl — 0.5, MgSO4·7H2O — 0.1, pH 7.2, при температуре 29°С, 180 об./мин до ОП600 1.5. Содержание сидерофоров в культуральной жидкости определяли с помощью универсального метода с использованием CAS-реактива [25]. Бесклеточный супернатант смешивали в соотношении 1 : 1 (об./об.) с CAS-реактивом, инкубировали 20 мин, оптическую плотность измеряли при длине волны 630 нм (AS). Контролем служила исходная минеральная среда, смешанная с реактивом CAS (AК). Содержание сидерофоров (%) определяли по формуле [(AК — AS)/AК] × 100 [26].

Определение фосфатсолюбилизирующей способности. Штаммы выращивали на модифицированной среде ММ с метанолом (0.5%, об./об.), содержащей нерастворимый Ca3(PO4)2 в качестве единственного источника фосфора (г/л): Ca3(PO4)2 — 5.0, (NH4)2SO4 — 0.2; MgSO4·7H2O — 0.1, рН 7.2, а также микроэлементы (мг/л): Ca(NO3)2 — 25, FeSO4·7H2O — 0.1, MnSO4·5H2O — 0.1, Na2MoO4·2H2O — 0.025, H3BO3 — 0.01, CuCl2·2H2O — 0.025, ZnSO4 — 0.03, Na3VO4·12H2O — 0.03, CoCl2·6H2O — 0.02, NiCl2·6H2O — 0.009, при температуре 29°С, 180 об./мин в течение 5 сут. Концентрацию растворимых форм фосфора определяли в культуральной жидкости с помощью фосфорномолибденового реактива, согласно ранее описанному методу [7]. Измерения проводили при длине волны 614 нм. Калибровочную кривую строили со стандартными растворами KH2PO4. Оптическую плотность культур, выращенных с трикальцийфосфатом (ТКФ), измеряли при длине волны 600 нм, предварительно разбавляя аликвоту образцов в соотношении 1 : 1 (об./об.) 1 н HCl и измеряя ее относительно холостой пробы, приготовленной аналогичным способом, как описано ранее [27, 28].

Определение активности гидролитических ферментов (целлюлазы, протеазы, амилазы). Для оценки целлюлазной, протеазной и амилазной, активностей штаммы выращивали в течение 5 сут при 29°С на агаризованной среде ММ, как описано ранее [29].

Определение активности D-цистеиндесульфогидразы. Активность фермента [КФ 4.4.1.15] определяли в бесклеточных экстрактах исследуемых штаммов спектрофотометрическим методом по включению продуцируемого сероводорода в метиленовый синий [30]. Реакцию проводили в 1 мл 50 мМ буфера Tris-HCl, pH 8.0, содержащего 50 мкл бесклеточного экстракта, начинали добавлением 20 мкл 50 мМ D-цистеина. После инкубации в течение 10 мин при 30°C, реакцию останавливали добавлением 100 мкл 30 мМ раствора FeCl3 в 1.2 М HCl и 100 мкл 20 мМ раствора N,N-диметил-p-фенилендиаминдигидрохлорида в 7.2 М HCl. Образование метиленового синего регистрировали при 670 нм.

Инокуляция растений и изучение ростостимулирующей активности. Семена салата (Lactuca sativa L.) поверхностно стерилизовали в 5 %-ном растворе гипохлорита натрия, трижды отмывали стерильной дистиллированной водой, высевали в пластиковые лотки для рассады (объем 50 мл) на предварительно простерилизованный (112°С, 30 мин) питательный грунт. На 2 сут на ростки наносили суспензию клеток штаммов DM4 и DM4 ΔgroEL2 (104–105 КОЕ/мл) из расчета 100 мкл на росток, в качестве контроля ростки обрабатывали стерильной средой ММ. Растения выращивали при температуре 23–25°С и 16-часовом световом периоде в течение 3 недель. Массу ростков и корней определяли после высушивания растений при 90°С до постоянного веса. Фотосинтетические пигменты экстрагировали из листьев 96%-ным этиловым спиртом [31], оптическую плотность экстрактов измеряли при 665, 649 и 440.5 нм, концентрацию пигментов (мг/г сырой массы) — хлорофилла a, b и каротиноидов, рассчитывали, как описано ранее [32]. Для определения удельной плотности листа (УПЛ) из листьев вырезали высечки площадью 1 см2 и высушивали их до постоянного веса при температуре 90°С. УПЛ определяли, как отношение единицы массы листа к единице площади (мг/мм2) [33].

Определение активности антиоксидантных ферментов и содержания малонового диальдегида (МДА). Для определения устойчивости к температурному стрессу 3-недельные растения подвергали тепловому шоку при температуре 40°С в течение 1 ч, контролем служили растения, не подвергавшиеся стрессу. Растительные экстракты для определения активности ферментов готовили, как описано ранее [32]. Активность каталазы [КФ 1.11.1.6] определяли по изменению концентрации Н2О2 при длине волны 240 нм после добавления исследуемого образца, как описано ранее [34]. Активность пероксидазы [КФ 1.11.1.7] определяли по скорости развития окраски в индикаторной реакции разложения Н2О2 при длине волны 460 нм, как описано ранее [34]. Удельную активность ферментов рассчитывали на мг белка, содержание которого в исследуемых образцах определяли по методу Брэдфорда [35]. Уровень перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали по образованию при нагревании окрашенного комплекса между МДА и тиобарбитуровой кислотой [36]. Концентрацию МДА определяли при длине волны 532 нм с использованием коэффициента молярной экстинкции 155 мМ–1·см–1, предварительно вычитая величину неспецифической экстинкции при 600 нм.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью программы SigmaPlot 12.5 (Systat Software Inc, San Jose, CA, USA). Все эксперименты проводили в трех биологических и, по меньшей мере, трех аналитических повторностях. В таблицах и графиках показаны средние значения и их стандартные отклонения. Разные буквы указывают на достоверные различия между вариантами (р < 0.05). Достоверность различий определяли посредством однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA), используя метод Холма-Сидака для попарного множественного сравнения.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ генома и генетический потенциал штамма DM4 как стимулятора роста растений. Ранее проведенный анализ полной последовательности генома M. dichloromethanicum subsp. dichloromethanicum DM4 [37] был посвящен поиску и описанию генов, определяющих его физиологическую адаптацию к метилотрофному образу жизни. В настоящей работе нами проведен поиск генетических детерминант для выявления потенциальной способности штамма DM4 к колонизации и стимуляции роста растений. С помощью сервиса KEGG BlastKOALA выявлено, что из аннотированных 6164 кодирующих белки последовательностей 2483 (40.3% от общего числа) связаны с известными бактериальными метаболическими путями (рис. 1а). Основные пути включали следующие метаболические функции: процессы, связанные с обработкой генетической информации (20.7%), сигналинг и клеточные процессы (10.47%), процессы, связанные с обработкой информации из окружающей среды (10.43%), метаболизм углеводов (9.34%), энергетический метаболизм (7.29%), метаболизм кофакторов, витаминов (5.84%) и аминокислот (4.99%). Согласно данным сервиса RAST, в геноме также выявлено 6164 кодирующих белки последовательностей, из которых 1835 (29.8% от общего числа) отнесены к 321 метаболической подсистеме — группам белков, обеспечивающих реализацию определенных биологических процессов в клетке. Так большинство генов были вовлечены в метаболизм аминокислот и их производных (247), метаболизм углеводов (215), белковый обмен (204), синтез кофакторов (включая витамины, пигменты, простетические группы) (161), дыхание (135), моторику и хемотаксис (89), синтез жирных кислот, липидов, изопреноидов (73), реакцию на стресс (68) и мембранный транспорт (58) (рис. 1б). Следовательно, штамм DM4, способен использовать доступные в среде обитания ресурсы углеводов и аминокислот, большинство его белок-кодирующих генов участвуют в процессах взаимодействия с окружающей средой, включая обработку и передачу сигналов извне, а способность к адгезии, моторике и хемотаксису, наряду с устойчивостью к стрессовым факторам, свидетельствует о его высокой адаптивности к условиям окружающей среды.

 

Рис. 1. Распределение категорий подсистем клеточного метаболизма M. dichloromethanicum subsp. dichloromethanicum DM4 на основе результатов функциональной аннотации согласно базам данных KEGG BlastKOALA (а) и RAST (б).

 

Как известно, РОФМ, обнаруживаемые в филлосфере и ризосфере различных растений, способны улучшать их рост за счет синтеза различных биоактивных соединений [6]. В частности, многие метилотрофы синтезируют индолпроизводные (фитогормоны ауксины), которые активируют рост, корнеобразование и формирование проводящих тканей растений [6]. Обнаружено, что штамм DM4 обладает генами ключевых ферментов пути синтеза индолов через продукцию триптофана — антранилатсинтазы, антранилатфосфорибозилтранферазы, индол-3-глицерофосфатсинтазы и триптофансинтазы (α и β-субъединиц) (табл. 1). Кроме того, у него присутствует ген, кодирующий индолилпируватдекарбоксилазу (ipdC) — ключевой фермент синтеза индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) посредством индолилпируватного пути. Наличие в геноме штамма DM4 гена miaA, кодирующего изопентенилтрансферазу, указывает на возможность функционирования в его клетках изопентениладенин-зависимого пути синтеза еще одного класса фитогормонов — цитокининов. В кооперации с ауксинами эти соединения участвуют в стимуляции роста и делении клеток растений, фотосинтетических процессах и реакции на стрессы [38]. В результате геномного анализа не обнаружены гены синтеза дезаминазы 1-аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты (acdS), снижающей концентрацию гормона старения растений этилена. Тем не менее, найден ген D-цистеиндесульфогидразы (dcyD), участвующей в формировании ассоциации бактерий с растениями посредством катализа образования сероводорода, обладающего фунгицидным действием и участвующего в стимуляции роста, развития растений и в их защите от различных видов стресса [39]. Помимо этого, в геноме штамма DM4 выявлены гены гидролитических ферментов, способствующие растворению компонентов клеточной стенки растений и, тем самым, облегчающих проникновение бактерий и колонизацию хозяина [40], — эндоглюканазы, β-глюкозидазы, амилазы, эндо- и аминопептидаз (табл. 1). Кроме того, исследуемый метилотроф, вероятно, способен к растворению неорганических фосфатов за счет продукции органической кислоты — формиата, образующегося в процессе окисления метанола и других С1-соединений [7, 37], и обладает генами ряда фосфатаз (табл. 1), участвующих в минерализации органических соединений фосфора. Также обнаружен кластер генов, вовлеченных в синтез сидерофоров — низкомолекулярных метаболитов-хелаторов, специфически связывающих ионы Fe3+. И те, и другие играют важную роль в повышении доступности связанных ионов и обеспечивают преимущество для выживания и развития микроорганизмов, в том числе при колонизации растений [41, 42]. Для защиты клеток от ультрафиолетового излучения у розовоокрашенного штамма DM4 присутствуют гены синтеза каротиноидов (crtB, crtF, crtE/I и crtC) и эндонуклеазы репарации повреждений, вызываемых УФ (табл. 1). Наконец, благодаря наличию генов биосинтеза полигидроксибутирата (ПГБ) (phaAB, phaR, phaC), он может накапливать указанный биополимер в качестве внутриклеточного запасного источника углерода и энергии, а затем расходовать его при неблагоприятных условиях.

 

Таблица 1. Гены, связанные со стимуляцией роста растений, в геноме M. dichloromethanicum subsp. dichloromethanicum DM4

Функция

Продукт гена

Ген

Номер локуса в GenBank

Биосинтез индолов

Антранилатсинтаза (I и II компонент) [КФ 4.1.3.27]

trpE, trpG

METD_I5718, METD_I5721

Антранилатфосфорибозилтранфераза [КФ 2.4.2.18]

trpD

METD_I5722

Фосфорибозил-антранилат изомераза [КФ 5.3.1.24]

trpF

METD_I0055

Индол-3-глицерофосфатсинтаза [КФ 4.1.1.48]

trpC

METD_I5723

Триптофансинтаза, α и β-субъединицы [КФ 4.2.1.20]

trpA, trpB

METD_I5482, METD_I0054

Ключевой фермент биосинтеза ИУК

Индолилпируватдекарбоксилаза [КФ 4.1.1.74]

ipdC

METD_I3257

Синтез цитокининов

тРНК-изопентинилтрансфераза [КФ 2.5.1.8]

miaA

METD_I3413

Деградация D-цистеина

D-цистеиндесульфогидраза [КФ 4.4.1.15]

dcyD

METD_I3140

Продукция гидролитических ферментов

Эндоглюканаза (целлюлазная активность) [КФ 3.2.1.4]

celC

METD_I2019

b-глюкозидаза (целлюлазная активность) [КФ 3.2.1.21]

bglX

METD_I3242

Амилаза [КФ 2.4.1.21]

glgA

METD_I2792

Эндопептидаза [КФ 3.4.21]

 

METD_I0058

Аминопептидаза [КФ 3.4.11.9]

 

METD_I5518

Аминопептидаза [КФ 3.4.11.24]

 

METD_I4275

Защита от УФ

Эндонуклеаза репарации повреждений от УФ-изучения

 

METD_I2201

Биосинтез каротиноидов

Гены синтеза каротиноидов

crtB

METD_I3784, METD_I5228

crtF

METD_I3494

crtE/I

METD_I3492, METD_I3783, METD_I4240, METD_I4245

crtC

METD_I3491

Биосинтез ПГБ

Ацетоацетил-КоА трансфераза [КФ 2.3.1.9]

phaA

METD_I4272

Ацетоацетил-КоА редуктаза [КФ 1.1.1.36]

phaB

METD_I4273

Поли-3-гидроксиалканоатсинтаза [КФ 2.3.1.304]

phaC

METD_I3869

Регуляторный белок синтеза ПГБ PhaR

phaR

METD_I4271

Биосинтез сидерофоров

Генный кластер биосинтеза сидерофоров

 

METD_I4717–METD_I4727

Солюбилизация фосфатов

Кислая фосфатаза [КФ 3.1.3.2]

 

METD_I2235

Экзополифосфатаза [КФ 3.6.1.11]

 

METD_I2834

Щелочная фосфатаза [КФ 3.1.3.1]

 

METD_I2865

Неограническая дифосфатаза [КФ 3.6.1.1]

 

METD_I2842

 

Таким образом, результаты проведенного анализа генома показали, что исследуемый метилотроф M. dichloromethanicum subsp. dichloromethanicum DM4 обладает целым комплексом генетических детерминант, определяющих потенциал штамма к стимуляции роста растений и противостоянию неблагоприятным факторам при их колонизации. Для дальнейшей проверки фенотипического выражения кодируемых свойств и оценки возможного влияния на него нарушения синтеза шаперонина GroEL2 была изучена способность клеток исходного и мутантного штаммов к синтезу ауксинов, сидерофоров, D-цистеиндесульфогидразы и гидролитических ферментов, а также их фосфатсолюбилизирующая активность.

Способность к синтезу ауксинов. Сравнительный анализ продукции индолпроизводных штаммами DM4 и DM4 ΔgroEL2 при добавлении в среду предшественника L-триптофана продемонстрировал, что у мутанта по гену groEL2 синтез ауксинов снижался более чем в 2 раза по сравнению со штаммом дикого типа: до 4.17 ± 0.60 мкг/мл культуральной жидкости против 10.46 ± 1.62 мкг/мл (при ОП600 культур 1.0) соответственно. При этом уровень продукции ИУК у исходного штамма DM4 находился в пределах значений, характерных для большинства РОФМ (8–29 мкг/мл) [9].

Способность к синтезу сидерофоров. При культивировании на минеральной среде без источников железа оба исследуемых штамма синтезировали сидерофоры, причем их продукция у нокаут-мутанта DM4 ∆groEL2 достоверно не отличалась от таковой у штамма дикого типа (91.98 ± 0.98 % у мутанта против 93.26 ± 0.36 % у исходного штамма).

Фосфатсолюбилизирующая активность. Показано, что оба исследуемых штамма растворяют ТКФ, однако накопление фосфатов в культуральной жидкости штамма дикого типа достигало максимального значения (111.32 ± 3.23 мкг/мл) уже в первые сутки роста, в то время как мутант DM4 ∆groEL2 демонстрировал существенное отставание по этому параметру (97.77 ± 3.10 мкг/мл) (рис. 2а). На 3 сут роста концентрации фосфатов в культуральной жидкости обоих штаммов практически выравнивались, а на 5 сут достигали значений 105.66 ± 3.22 мкг/мл и 105.50 ± 2.87 мкг/мл для исходного и мутантного штаммов соответственно. При этом следует отметить, что накопление биомассы у мутанта DM4 ∆groEL2 на среде с ТКФ в качестве единственного источника фосфора также происходило заметно медленнее, нежели у штамма дикого типа. Так в течение первых 3 сут оптическая плотность клеток мутанта была в 1.4 раза ниже таковой исходного штамма, и достигала близких к ней значений лишь на 4–5 сут роста (рис. 2б). Учитывая, что ранее на обычной среде ММ с растворимым источником фосфора (KH2PO4) динамика роста штамма DM4 ∆groEL2 на метаноле не отличалась от таковой штамма дикого типа [17], такой эффект, по-видимому, свидетельствует о лимитировании роста мутанта недостатком фосфора вследствие его сниженной фосфатсолюбилизирующей активности.

 

Рис. 2. Накопление фосфора в культуральной жидкости (а) и оптическая плотность клеток (б) при культивировании штаммов M. dichloromethanicum subsp. dichloromethanicum DM4 (1) и DM4 ΔgroEL2 (2) на минеральной среде с Са3(РО4)2 в качестве единственного источника фосфора.

 

Активность гидролитических ферментов. Показано, что штамм DM4 и его нокаут-мутант DM4 ∆groEL2 обладали одинаковой амилазной и протеазной активностью. Диаметр зон гало вокруг колоний исходного и мутантного штаммов на среде с крахмалом составлял 10.1 ± 0.08 мм и 10.2 ± 0.10 мм соответственно. Зоны лизиса для штамма дикого типа и штамма, лишенного гена groEL2, при исследовании протеолитической активности достигали 12.1 ± 0.09 мм и 12.0 ± 0.10 мм соответственно. Несмотря на наличие в геноме генов синтеза целлюлазы (табл. 1), целлюлазную активность у указанных штаммов детектировать не удалось.

Активность D-цистеиндесульфогидразы. Обнаружено, что оба исследуемых штамма экспрессируют D-цистеиндесульфогидразу, причем синтезируемый ими фермент обладает строгой стереоспецифичностью к токсичному для бактерий D-цистеину и неактивен с L-цистеином. Показано также, что активность D-цистеиндесульфогидразы у нокаут-мутанта DM4 ∆groEL2 практически не отличалась от таковой штамма дикого типа (2.23 ± 0.16 нмоль·мин–1·мг–1 белка против 2.40 ± 0.18 нмоль·мин–1·мг–1 белка соответственно).

В целом, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что метилотроф M. dichloromethanicum subsp. dichloromethanicum DM4 обладал целым рядом функциональных механизмов, способных участвовать в формировании симбиотических отношений с растениями. Вместе с тем, обнаружено, что среди исследованных параметров нарушение структуры гена groEL2 у штамма DM4 оказывало негативное влияние только на продукцию индолпроизводных и способность к солюбилизации нерастворимых фосфатов. Здесь следует отметить, что основной ауксин — ИУК — является не только фитогормоном, но и важной сигнальной молекулой для самих бактерий, согласующей их поведение и регулирующей экспрессию ряда генов, связанных с центральным метаболизмом [43–46], а также с выживанием в неблагоприятных условиях (высушивание, окислительный, температурный и осмотический стресс) [47–49]. Снижение синтеза ауксинов, выявленное у мутанта DM4 ΔgroEL2 могло быть связано с общим нарушением стресс-ответа. Что же касается отмеченного уменьшения его фосфатсолюбилизирующей способности, оно, вероятно, отражает изменения в регуляции метаболизма и затрагивает продукцию и накопление интермедиатов окисления метанола [7]. Для оценки различий ростостимулирующих свойств исходного и мутантного штаммов были проанализированы эффекты инокуляции ими растений салата.

Влияние инокуляции на рост и морфогенез растений салата в вегетационных опытах. Показано, что растения, инокулированные штаммом дикого типа, превосходили контрольные по длине (на 25.3%) и массе (на 21.8%) корневой системы (табл. 2), тогда как у растений, обработанных клетками мутанта DM4 ∆groEL2, аналогичные показатели были ниже и близки к таковым в контрольном варианте (табл. 2). Помимо этого, выявлено достоверное увеличение высоты и массы надземной части растений, инокулированных штаммами DM4 (на 17.6 и 37.0% соответственно) и DM4 ΔgroEL2 (на 10.7% и 19.3%, соответственно) по сравнению с контрольными. Отмечено также, что первые настоящие листья у инокулированных растений появлялись раньше и были крупнее, чем у контрольных. Оценка удельной плотности листа, являющейся одним из основных функциональных параметров из-за тесной связи с активностью фотосинтеза и скоростью роста растений [50], показала, что у растений, инокулированных исходным и мутантным штаммами, значения УПЛ были незначительно, но все же выше, чем у контрольных (табл. 2). Кроме того, у обработанных метилотрофами растений отмечалась тенденция к увеличению количества листьев в одной розетке по сравнению с контрольными (табл. 2).

 

Таблица 2. Морфометрические показатели, содержание и соотношение фотосинтетических пигментов у растений салата, неинокулированных (контроль, 1) и инокулированных штаммами M. dichloromethanicum subsp. dichloromethanicum DM4 (2) и DM4 ∆groEL2 (3). Достоверные различия (р < 0.05) между вариантами отмечены разными буквами

Вариант

Длина корней, см

Масса корней, мг

Высота ростков, см

Масса ростков, мг

Количество листьев

УПЛ, мг/мм2

ХЛ a, мг/г сырой массы

ХЛ b, мг/г сырой массы

ХЛ (a+b), мг/г сырой массы

Каротиноиды, мг/г сырой массы

1

6.8 ± ± 0.2b

5.5 ± ± 0.6a

10.2 ± ± 0.4b

30.0 ± ± 1.5c

4.9 ± 0.6a

0.013 ± ± 0.001a

0.38 ± ± 0.08b

0.11 ± ± 0.03a

0.49 ± ± 0.11b

0.11 ± 0.02b

2

8.5 ± ± 0.3a

6.7 ± ± 0.4a

12.0 ± ± 0.5a

41.1 ± ± 1.2a

5.5 ± 0.5a

0.015 ± ± 0.001a

0.62 ± ± 0.03a

0.18 ± ± 0.01a

0.81 ± ± 0.05a

0.18 ± 0.01a

3

7.4 ± ± 0.2b

5.7 ± ± 0.4a

11.3 ± ± 0.5ab

35.8 ± ± 1.0b

5.1 ± 0.4a

0.014 ± ± 0.001a

0.49 ± ± 0.06ab

0.15 ± ± 0.02a

0.64 ± ± 0.07ab

0.14 ± 0.02ab

 

Одной из важнейших характеристик фотосинтетического аппарата является содержание основных фотосинтетических пигментов (хлорофиллов a, b и каротиноидов). Количество пигментов в растительных организмах варьирует в широких пределах, отражает их реакцию и степень адаптации на любые изменения во внешней среде [51]. Обнаружено, что инокуляция исследуемыми метилотрофами растений салата приводила к увеличению содержания в их листьях фотосинтетических пигментов (табл. 2). Суммарное содержание хлорофиллов (ХЛ, a+b) и каротиноидов в листьях салата, инокулированного как исходным, так и мутантным штаммами, были почти в 1.6 и 1.3 раза соответственно выше, чем в контроле. Эти данные свидетельствуют о более интенсивной работе фотосинтетического аппарата и увеличении продуктивности растений, инокулированных исследуемыми штаммами. При этом содержание основных пигментов в листьях и продуктивность (масса ростков и корней) салата, инокулированного штаммом дикого типа, были выше, чем у инокулированного мутантным штаммом (табл. 2). Поскольку урожайность тесно связана с фотосинтетической активностью, вполне закономерно, что растения, обработанные исходным штаммом, обладали более высокими морфометрическими показателями по сравнению с обработанными штаммом DM4 ∆groEL2 (табл. 2). Таким образом, мутация по гену groEL2 заметно снижала ростостимулирующую активность метилотрофа M. dichloromethanicum subsp. dichloromethanicum DM4.

Влияние инокуляции на активность антиоксидантных ферментов и уровень МДА в условиях температурного стресса. Как известно, защитная реакция растений на окислительный стресс обеспечивается многоступенчатой системой антиоксидантной защиты [52, 53]. Показано, что кратковременный температурный стресс приводил к усилению перекисного окисления липидов у растений салата и формированию ответных антиоксидантных реакций. Так активность каталазы максимально возрастала после теплового шока у контрольных растений (на 85%), тогда как у растений, инокулированных штаммами DM4 и DM4 ΔgroEL2, она повышалась на 40.5 и 20.5% соответственно (рис. 3а). При этом активность пероксидазы в тканях растений после стресса увеличивалась в 1.5–1.6 раза во всех вариантах без достоверных различий между ними (рис. 3б). Степень повреждения мембран при стрессовом воздействии оценивали по уровню перекисного окисления липидов (ПОЛ). Маркером уровня окислительного стресса в растительной клетке служила интенсивность образования МДА, являющегося конечным продуктом ПОЛ [52]. В результате обнаружено, что по сравнению с показателями, полученными в нормальных условиях, при стрессе содержание МДА достоверно повышалось в тканях как контрольных растений салата, так и инокулированных штаммами DM4 и DM4 ΔgroEL2 (на 41–63%) (рис. 3в). Отмечено также, что уровень МДА в контрольном варианте был выше, чем в растениях, обработанных штаммами DM4 и DM4 ΔgroEL2, как до (в 1.5–1.6 раза), так и после стресса (в 1.6 и 1.3 раза соответственно). Полученные результаты свидетельствуют о более высоком содержании активных форм кислорода (АФК) (гидроксильный и супероксид-радикалы, пероксид водорода и др.) в клетках контрольных растений и согласуются с существенным повышением у них активности каталазы, которая работает при высоких концентрациях АФК, в отличие от пероксидазы, которая функционирует при относительно низком их содержании [54]. При этом более высокая устойчивость системы антиоксидантной защиты инокулированных растений, подвергнутых “шоковому” воздействию, позволяет предположить, что растение может лучше приспосабливаться к кратковременному стрессу и легче его переносить вместе с клетками метилотрофов. Тем не менее, нами было также обнаружено, что инокуляция растений салата штаммом DM4 дикого типа приводила к меньшему повреждению клеточных структур при тепловом стрессе (более чем на 20%), нежели обработка лишенным гена groEL2 производным (рис. 2в). Этот эффект дополнительно подтвердил предположение о важной роли шаперонина GroEL2 в формировании стресс-ответа и согласуется с ранее описанной [17] повышенной чувствительностью нокаут-мутанта DM4 ΔgroEL2 к целому ряду неблагоприятных факторов.

 

Рис. 3. Активности ферментов антиоксидантной защиты — каталазы (а) и пероксидазы (б), а также концентрация эндогенного МДА (в) у растений салата, инокулированных штаммами M. dichloromethanicum subsp. dichloromethanicum DM4 и DM4 ΔgroEL2 и неинокулированных (контроль), в нормальных условиях (1) и после воздействия температурного стресса (2). Достоверные различия (р < 0.05) между вариантами отмечены разными буквами.

 

В настоящей работе проведен анализ генома метилотрофа M. dichloromethanicum subsp. dichloromethanicum DM4 на наличие генетических детерминант, указывающих на его потенциал как стимулятора роста растений. Для данного штамма и его нокаут-мутанта по гену groEL2 выявлен ряд механизмов, способствующих улучшению роста растений. Так, инокуляция растений салата штаммом DM4 стимулировала рост и развитие побегов, формирование корневой системы, положительно влияла на работу фотосинтетического аппарата, а также повышала адаптивную защиту и устойчивость к кратковременному температурному стрессу в вегетационных опытах. Вместе с тем, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что нарушение структуры гена groEL2 у штамма DM4 оказывало негативное влияние на потенциал этого организма как стимулятора роста и развития растений, снижая у него продукцию ауксинов и способность к солюбилизации нерастворимых фосфатов. Однако, поскольку основной ауксин, ИУК, является важной сигнальной молекулой самих бактерий, вовлеченной в регуляцию экспрессии генов, связанных с выживанием в неблагоприятных условиях, снижение его синтеза, вероятнее всего, указывало на общее нарушение у мутанта DM4 ΔgroEL2 стресс-ответа. Несмотря на заметно меньший стимулирующий эффект, оказываемый на растения штаммом, лишенным гена groEL2, по сравнению с исходным, участие шаперонина GroEL2 в фитостимулирующих процессах у M. dichloromethanicum subsp. dichloromethanicum DM4, по-видимому, является опосредованным и обусловлено, главным образом, его ролью в стресс-ответе. Дальнейшие исследования функций белков GroEL различных групп сходства у штаммов РОФМ, выделенных из техногенных и природных местообитаний, могут прояснить их значение для метилотрофных стимуляторов роста растений и деструкторов С1-соединений и выявить новые мишени для их генетической инженерии с целью использования в агробиотехнологии и биоремедиации.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 23-24-00377, https://rscf.ru/project/23-24-00377/).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

В данной работе отсутствуют исследования человека или животных.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы данной работы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

×

About the authors

N. V. Agafonova

Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences, Federal Research Center Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: nadyagafonova@gmail.com
Russian Federation, Pushchino, 142290

G. A. Ekimova

Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences, Federal Research Center Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences

Email: nadyagafonova@gmail.com
Russian Federation, Pushchino, 142290

Y. E. Firsova

Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences, Federal Research Center Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences

Email: nadyagafonova@gmail.com
Russian Federation, Pushchino, 142290

M. L. Torgonskaya

Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences, Federal Research Center Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences

Email: nadyagafonova@gmail.com
Russian Federation, Pushchino, 142290

References

  1. Trotsenko Y.A., Khmelenina V.N. // Microbiology (Moscow). 2002. V. 71. P. 123–132. https://doi.org/10.1023/A:1015183832622
  2. Vuilleumier S. // Biotechnology for the Environment: Strategy and Fundamentals. / Eds. S. N. Agathos, W. Reineke.: Springer Dordrecht , 2002. P. 105–130. https://doi.org/10.1007/978-94-010-0357-5_7
  3. Torgonskaya M.L., Doronina N.V., Hourcade E., Trotsenko Y.A., Vuilleumier S. // J. Basic Microbiol. 2011. V. 51. P. 296–303. https://doi.org/10.1002/jobm.201000280
  4. Vorholt J.A. // Nat. Rev. Microbiol. 2012. V. 10. P. 828–840. https://doi.org/10.1038/nrmicro2910
  5. Fall R., Benson A.A. // Trends Plant Sci. 1996. V. 1. № 9. P. 296–301. https://doi.org/10.1016/S1360-1385(96)88175-0
  6. Федоров Д.Н., Доронина Н.В., Троценко Ю.А. // Микробиология. 2011. Т. 80. № 4. С. 435–446.
  7. Агафонова Н.В., Капаруллина Е.Н., Доронина Н.В., Троценко Ю.А. // Микробиология. 2014. Т. 83. № 1. С. 28–32. https://doi: 10.7868/S0026365614010029
  8. Kwak M.J., Jeong H., Madhaiyan M., Lee Y., Sa T.M., Oh T.K., Kim J.F. // PloS ONE. 2014. V. 9. P. e106704. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0106704
  9. Alessa O., Ogura Y., Fujitani Y., Takami H., Hayashi T., Sahin N., Tani A. // Front Microbiol. 2021. V. 12. P. 740610. https://doi.org/10.3389/fmicb.2021.740610
  10. Kumar C.M., Mande S.C., Mahajan G. // Cell Stress Chaperones. 2015. V. 20. № 4. P. 555–574. https://doi.org/10.1007/s12192-015-0598-8
  11. Hayer-Hartl M., Bracher A., Hartl F.U. // Trends Biochem. Sci. 2016. V. 41. P. 62–76. https://doi.org/10.1016/j.tibs.2015.07.009
  12. Mizobata T., Kawata Y. // Biophys. Rev. 2018. V. 10. P. 631–640. https://doi.org/10.1007/s12551-017-0332-0
  13. Fischer H.M., Schneider K., Babst M., Hennecke H. // Arch. Microbiol. 1999. V. 171. P. 279–289. https://doi.org/10.1007/s002030050711
  14. Bittner A.N., Foltz A., Oke V. // J. Bacteriol. 2007. V. 189. P. 1884–1889. https://doi.org/10.1128/jb.01542-06
  15. Torgonskaya M. L., Firsova Y.E., Ekimova G.A., Grouzdev D.S., Agafonova N.V. // Microbiology (Moscow). 2024. V. 93. P. 14–27. https://doi.org/10.1134/S0026261723601768
  16. Doronina N.V, Trotsenko Y.A., Tourova T.P., Kuznetsov B.B., Leisinger T. // Syst. Appl. Microbiol. 2000. V. 23. P. 210–218. https://doi.org/10.1016/S0723-2020(00)80007-7
  17. Firsova Y.E., Torgonskaya M.L. // Antonie van Leeuwenhoek. 2020. V. 113. P. 101–116. https://doi.org/10.1007/s10482-019-01320-5
  18. Green P.N., Ardley J.K. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2018. V. 68. P. 2727–2748. https://doi.org/10.1099/ijsem.0.002856
  19. Firsova Y.E., Torgonskaya M.L., Trotsenko Y.A. // Microbiology (Moscow). 2015. V. 84. P. 796–803. https://doi.org/10.1134/S002626171506003X
  20. Aziz R.K., Bartels D., Best A.A., De Jongh M., Disz T., Edwards R.A. et al. // BMC genomics. 2008. V. 9. P. 1–15. https://doi.org/10.1186/1471-2164-9-75
  21. Tatusova T., DiCuccio M., Badretdin A., Chetvernin V., Nawrocki E.P. // Nucleic Acids Res. 2016. V. 44. P. 6614–6624. https://doi.org/10.1093/nar/gkw569
  22. Kanehisa M., Sato Y., Kawashima M., Furumichi M., Tanabe M. // Nucleic Acids Res. 2016. V. 44. P. D457–D462. https://doi.org/10.1093/nar/gkv1070
  23. Капаруллина Е.Н., Доронина Н.В., Мустахимов И.И., Агафонова Н.В., Троценко Ю.А. // Микробиология. 2017. Т. 86. № 1. С. 107–113. https://doi.org/10.7868/S0026365617010086
  24. Gordon S.A., Weber R.P. // Plant Physiol. 1951. V. 26. № 1. P. 192–195. https://doi.org/10.1104/pp.26.1.192
  25. Schwyn B., Neilands J.B. // Anal. Biochem. 1987. V. 160. № 1. P. 47–56. https://doi.org/10.1016/0003-2697(87)90612-9
  26. Wang S., Wang J., Zhou Y., Huang Y., Tang X. // Curr. Microbiol. 2022. V. 79. № 2. P. 66. https://doi.org/10.1007/s00284-021-02755-8
  27. Rodríguez H., Gonzalez T., Selman G. // J. Biotechnol. 2000. V. 84 (2). P. 155–161. https://doi.org/10.1016/S0168-1656(00)00347-3
  28. Son H.J., Park G.T., Cha M.S., Heo M.S. // Bioresour. Technol. 2006. V. 97. № 2. P. 204–210. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2005.02.021
  29. Jiang L., Seo J., Peng Y., Jeon D., Park S.J., Kim C.Y. et al. // AMB Express. 2023. V. 13. P. 9. https://doi.org/10.1186/s13568-023-01514-1
  30. Siegel M. // Anal. Biochem. 1965. V. 11. P. 126-132. https://doi.org/10.1016/0003-2697(65)90051-5
  31. Wintermans J.F.G.M., De Mots A. // Biochim. Biophys. Acta. 1965. V. 109. P. 448–453.
  32. Агафонова Н.В., Доронина Н.В., Троценко Ю.А. // Прикл. биохимия и микробиология. 2016. Т. 52. №. 2. С. 210–216. https://doi.org/10.7868/S0555109916020021
  33. Чернядьев И.И. // Прикл. биохимия и микробиология. 2001. Т. 37. С. 466–471.
  34. Pine L., Hoffman P.S., Malcolm G.B., Benson R.F., Keen M.G. // J. Clinic. Microbiol. 1984. V. 20. P. 421–429. https://doi.org/10.1128/jcm.20.3.421-429.1984
  35. Bradford M.M. // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248–254. https://doi.org/10.1016/0003-2697(76)90527-3
  36. Costa H., Gallego S.M., Tomaro M.L. // Plant Sci. 2002. V. 162. P. 939–945. https://doi.org/10.1016/S0168-9452(02)00051-1
  37. Vuilleumier S., Chistoserdova L., Lee M.C., Bringel F., Lajus A. et al. // PLoS ONE. 2009. V. 4. P. e5584. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005584
  38. Frébort I., Kowalska M., Hluska T., Frébortová J., Galuszka P. // J. Exp. Bot. 2011. V. 62. P. 2431–2452. https://doi.org/10.1093/jxb/err004
  39. Arif Y., Hayat S., Yusuf M., Bajguz A. // Plant Physiol. Biochem. 2021. V. 158. P. 372–384. https://doi.org/10.1016/j.plaphy.2020.11.045
  40. Jha P., Panwar J., Jha P.N. // J. Environ. Sustain. 2018. V. 1. P. 25–38. https://doi.org/10.1007/s42398-018-0011-5
  41. Verma V.C., Singh S.K., Prakash S. // J. Basic Microbiol. 2011. V. 51. P. 550–556. https://doi.org/10.1002/jobm.201000155
  42. Ghavami N., Alikhani H.A., Pourbabaei A.A., Besharati H. // J. Plant Nutr. 2017. V. 40. № 5. P. 736–746. https://doi.org/10.1080/01904167.2016.1262409
  43. Bianco C., Imperlini E., Defez R. // Plant Signal Behav. 2009. V. 4. P. 763–765. https://doi.org/10.1093/jxb/erp140
  44. Spaepen S., Das F., Luyten E., Michiels J., Vanderleyden J. // FEMS Microbiol. Lett. 2009. V. 291. P. 195–200. https://doi.org/10.1111/ j.1574-6968.2008.01453.x
  45. Федоров Д.Н., Бут С.Ю., Доронина Н.В., Троценко Ю.А. // Микробиология. 2009. Т. 78. № 6. С. 844–846.
  46. Patten C.L., Blakney A.J.C., Coulson T.J.D. // Crit. Rev. Microbiol. 2013. V. 39. P. 395–415. https://doi.org/10.3109/1040841X.2012.716819
  47. Lin H.R., Shu H.Y., Lin G.H. // Microbiol. Res. 2018. V. 216. P. 30–39. https://doi.org/org/10.1016/j.micres.2018.08.004
  48. Duca D.R., Glick B.R // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2020. V. 104. P. 8607–8619. https://doi.org/10.1007/s00253-020-10869-5
  49. Kunkel B.N., Johnson J.M.B. // Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2021. V. 13. P. a040022. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a040022
  50. Ivanova L.A., Zolotareva N.V., Ronzhina D.A., Podgaevskaya E.N., Migalina S.V., Ivanov L.A. // Flora. 2018. V. 239. P. 11–19. https://doi.org/10.1016/j.flora.2017.11.005
  51. Esteban R., Barrutia O., Artetxe U., Fernández‐Marín B., Hernández A., García‐Plazaola J.I. // New Phytologist. 2015. V. 206. P. 268–280. https://doi.org/10.1111/nph.13186
  52. Mittler R. // Trends Plant Sci. 2002. V. 7. P. 405–410. https://doi.org/10.1016/S1360-1385(02)02312-9
  53. Нарайкина Н.В., Синькевич М.С., Дерябин А.Н., Трунова Т.И. // Физиология растений. 2018. Т. 65. № 5. С. 340–347. https://doi.org/10.1134/S0015330318050226
  54. Кошкин Е.И. Физиология устойчивости сельскохозяйственных культур. М.: Дрофа, 2010. 638 с.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. Distribution of categories of subsystems of cellular metabolism of M. dichloromethanicum subsp. dichloromethanicum DM4 based on the results of functional annotation according to the KEGG BlastKOALA (a) and RAST (b) databases.

Download (883KB)
Indexing metadata
3. 2. Phosphorus accumulation in the culture fluid (a) and optical density of cells (b) during cultivation of M. dichloromethanicum subsp. dichloromethanicum DM4 (1) and DM4 ΔgroEL2 (2) on a mineral medium with Ca3(PO4)2 as the only source of phosphorus.

Download (134KB)
Indexing metadata
4. 3. The activity of antioxidant protection enzymes catalase (a) and peroxidase (b), as well as the concentration of endogenous MDA (c) in lettuce plants inoculated with strains of M. dichloromethanicum subsp. dichloromethanicum DM4 and DM4 ΔgroEL2 and uninoculated (control), under normal conditions (1) and after exposure to temperature stress (2). Significant differences (p < 0.05) between the variants are marked with different letters.

Download (246KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2025 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных

 

Используя сайт https://journals.rcsi.science, я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных») даю согласие на обработку персональных данных на этом сайте (текст Согласия) и на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика» (текст Согласия).