Эффект интенсификации цикла трикарбоновых кислот на биосинтез адипиновой кислоты штаммами Escherichia coli по обращенному β-окислению жирных кислот

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

С использованием в качестве базового ранее сконструированного адипат-секретирующего штамма Escherichia coli MG1655 lacIQ, ∆ackA-pta, ∆poxB, ∆ldhA, ∆adhE, PL-SDφ10-atoB, Ptrc-ideal-4-SDφ10-fadB, ∆fadE, PL-SDφ10-tesB, ∆yciA, Ptrc-ideal-4-SDφ10-fabI, PL-SDφ10-paaJ, ∆aceBAK, ∆glcB получены штаммы-производные, способные к повышенному синтезу целевого соединения из глюкозы по обращенному пути β-окисления жирных кислот. Такой эффект достигнут при интенсификации в клетках цикла трикарбоновых кислот. Прекращение множественных обращений цикла за счет инактивации в штамме сукцинатдегидрогеназы не оказывало выраженного влияния на формирование рекомбинантом адипиновой кислоты. При интенсификации цикла за счет усиления анаплеротического формирования щавелевоуксусной кислоты из фосфоенолпирувата, в результате повышения экспрессии нативного гена ppc, синтез адипиновой кислоты возрастал в 1.2 раза до ~390 мкМ. Обеспечение возможности формирования щавелевоуксусной кислоты из пировиноградной, при введении в штамм активности гетерологичной пируваткарбоксилазы Bacillus subtilis, приводило к интенсификации цикла в 1.5 раз и сопровождалось ростом секреции адипиновой кислоты до ~496 мкМ. Последующая инактивация в штамме генов sdhAB повышала секрецию целевого соединения лишь незначительно и титр адипиновой кислоты достигал ~520 мкМ. Полученные данные указывали на прямую зависимость эффективности синтеза адипиновой кислоты сконструированными рекомбинантами от степени интенсификации в них цикла трикарбоновых кислот.

Полный текст

Адипиновая кислота – это алифатическая дикарбоновая кислота, которая может быть удобным предшественником в последующем синтезе широкого спектра производных с высокой добавленной стоимостью, таких как смазочные материалы, пластификаторы, фармацевтические субстанции и компоненты искусственных волокон [1]. В настоящее время большая часть адипиновой кислоты производится нефтехимическим синтезом с использованием бензола в качестве предшественника [2]. Тем не менее, адипиновая кислота может быть получена из возобновляемого сырья рядом биотехнологических способов, представляющих экологически оправданную альтернативу традиционному методу.

Один из первых предложенных методов биотехнологической конверсии растительного сырья в адипиновую кислоту предполагал первичное получение из возобновляемых источников углерода cis, cis-муконовой кислоты с последующим образованием из нее целевого продукта в результате каталитического гидрирования [3]. Возможность эффективной микробиологической конверсии глюкозы и глицерина в cis, cis-муконовую кислоту была продемонстрирована с использованием ряда направленно сконструированных штаммов Eschericha coli и Saccharomyces cerevisiae [4–7]. Кроме того, сообщалось об успешном формировании адипиновой кислоты из соответствующего предшественника в результате биокаталитического гидрирования [8].

Альтернативой двухстадийному методу синтеза адипиновой кислоты, включающему как биосинтетическую, так и каталитическую стадии, является прямой босинтетический способ микробиологического синтеза этого дикарбоксилата, основанный на принципе обратимости биохимических реакций β-окисления, таких как реакции деградации фенилацетата или деградации жирных кислот. Формирование адипиновой кислоты из консервативных для биотехнологически значимых микроорганизмов метаболитов-предшественников, согласно данному подходу, предполагает первичную конденсацию ацетил-КоА и сукцинил-КоА, с последующим превращением 3-оксоадипил-КоА в 3-гидроксиадипил-КоА, затем в 2,3-дидегидроадипил-КоА и, в итоге, в адипил-КоА. Гидролиз тиоэфирной связи последнего КоА-производного, ведущий к получению целевого соединения, может катализироваться тиоэстеразами, обладающими необходимой субстратной специфичностью.

Синтез адипиновой кислоты из глюкозы по обращенному пути деградации фенилацетата был успешно продемонстрирован [9–12] при оверэкспрессии в клетках E. coli как нативных генов paa-оперона, обеспечивающих формирование 2,3-дидегидроадипил-КоА, так и вспомогательных генов гетерологичных ферментов, ответственных за конверсию 2,3-дидегидроадипил-КоА в адипил-КоА и гидролиз его тиофирной связи. Также, при усилении в E. coli экспрессии нативных генов 3-оксоацил-КоА-тиолазы (КФ 2.3.1.174), бифункциональной (S)-3-гидроксиацил-КоА-дегидрогеназы/еноил-КоА-редуктазы (КФ 1.1.1.35/КФ 4.2.1.17), еноил-ацилпереносящий белок (АПБ)-редуктазы/ацил-КоА-дегидрогеназы (КФ 1.3.1.9) и тиоэстеразы II (КФ 3.1.2.20) недавно был показан синтез адипиновой кислоты из глюкозы в результате функционального обращения β-окисления жирных кислот (БОЖК) [13].

Эффективность протекания всей последовательности реакций обращенного β-окисления напрямую зависит от эффективности первичной конденсации ацетил-КоА и сукцинил-КоА. В данной связи, были предприняты попытки улучшения биосинтетических характеристик адипат-секретирующих рекомбинантов за счет повышения внутриклеточной доступности сукцинил-КоА.

Поскольку этот метаболит является интермедиатом цикла трикарбоновых кислот (ЦТК), подходы к повышению его внутриклеточной доступности для реакций обращенного β-окисления включали, в первую очередь, предотвращение утилизации сформированного сукцинил-КоА в последующих реакциях цикла за счет инактивации сукцинатдегидрогеназы (КФ 1.3.5.1) [10] или сукцинил-КоА-синтетазы (КФ 6.2.1.5) [14]. Альтернативный подход заключался в инактивации глиоксилатного шунта [13], расходующего непрямой предшественник сукцинил-КоА, изоцитрат, и активирующегося при интенсивном формировании в клетке ацетил-КоА [15]. Вместе с тем, внутриклеточная доступность сукцинил-КоА для реакций биосинтеза адипиновой кислоты может быть повышена не только за счет “сбережения” соответствующего тиоэфира, но и в результате усиления его образования, при интенсификации ЦТК.

Цель работы – оценка влияния интенсификации ЦТК на биосинтез адипиновой кислоты рекомбинантными штаммами E. coli, способными к формированию целевого соединения по обращенному β-окислению жирных кислот.

МЕТОДИКА

Реактивы. В работе использовали Taq ДНК-полимеразу и дезоксинуклеозидтрифосфаты “Thermo Scientific” (Литва). Компоненты питательных сред, соли и другие реактивы были производства “Panreac” (Испания) и “Sigma” (США).

Бактериальные штаммы, плазмиды и среды. Штамм E. coli K-12 MG1655 (ВКПМ B-6195) и ранее сконструированный штамм E. coli BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fabI PL-paaJ ∆aceBAK ∆glcB [13], обозначенный как AdiBOX1.0, с измененной регуляцией экспрессии генов, кодирующих ключевые ферменты аэробного β-окисления жирных кислот, еноилАПБ-редуктазу, 3-оксоацил-КоА-тиолазу и тиоэстеразу II, а также лишенный путей смешанно-кислотного брожения, глиоксилатного шунта и активности неспецифичной тиоэстеразы YciA, были использованы в качестве исходных для конструирования всех полученных в работе рекомбинантов. Использованные в работе бактериальные штаммы и плазмиды представлены в табл. 1. Для культивирования бактерий применяли богатую среду LB и минимальную среду М9 [16] c добавлением при необходимости ампициллина (100 мкг/мл) или хлорамфеникола (30 мкг/мл).

 

Таблица 1. Штаммы и плазмиды, сконструированные и использованные в работе

Объект

Генотип

Ссылка

Штамм

MG1655

Штамм E. coli дикого типа (ВКПМ B-6195)

ВКПМ

AdiBOX 1.0

E. coli MG1655 lacIQ, ∆ackA-pta, ∆poxB, ∆ldhA, ∆adhE, PL-SDj10-atoB, Ptrc-ideal-4-SDj10-fadB, ∆fadE, PL-SDj10-tesB, ∆yciA, Ptrc-ideal-4-SDj10-fabI, PL-SDj10-paaJ, ∆aceBAK, ∆glcB

[13]

AdiBOX 1.0 ΔsdhAB

E. coli MG1655 lacIQ, ∆ackA-pta, ∆poxB, ∆ldhA, ∆adhE, PL-SDj10-atoB, Ptrc-ideal-4-SDj10-fadB, ∆fadE, PL-SDj10-tesB, ∆yciA, Ptrc-ideal-4-SDj10-fabI, PL-SDj10-paaJ, ∆aceBAK, ∆glcB, ∆sdhAB

Данная работа

AdiBOX 1.0 PL-ppc

E. coli MG1655 lacIQ, ∆ackA-pta, ∆poxB, ∆ldhA, ∆adhE, PL-SDj10-atoB, Ptrc-ideal-4-SDj10-fadB, ∆fadE, PL-SDj10-tesB, ∆yciA, Ptrc-ideal-4-SDj10-fabI, PL-SDj10-paaJ, ∆aceBAK, ∆glcB, PL-SDj10-ppc

Данная работа

AdiBOX 1.0 PL-pycA

E. coli MG1655 lacIQ, ∆ackA-pta, ∆ldhA, ∆adhE, PL-SDj10-atoB, Ptrc-ideal-4-SDj10-fadB, ∆fadE, PL-SDj10-tesB, ∆yciA, Ptrc-ideal-4-SDj10-fabI, PL-SDj10-paaJ, ∆aceBAK, ∆glcB, poxB:: PL- pycABs

Данная работа

AdiBOX 1.0 PL-pycA ΔsdhAB

E. coli MG1655 lacIQ, ∆ackA-pta, ∆ldhA, ∆adhE, PL-SDj10-atoB, Ptrc-ideal-4-SDj10-fadB, ∆fadE, PL-SDj10-tesB, ∆yciA, Ptrc-ideal-4-SDj10-fabI, PL-SDj10-paaJ, ∆aceBAK, ∆glcB, poxB:: PL- pycABs, ∆sdhAB

Данная работа

Плазмида

pMWts-Int/Xis

pSC101-ts, bla, PR-λxis-int, cIts857

[21]

 

Конструирование штаммов. Целевые генетические модификации были индивидуально введены в хромосому штамма E. coli MG1655 с использованием Red-зависимой системы гомологичной рекомбинации фага лямбда по методу описанному ранее [17]. Производные штамма AdiBOX 1.0, несущие соответствующие генетические модификации, были получены с помощью P1-зависимых трансдукций [16]. В случае инактивации генов sdhAB, замены природной регуляторной области гена ppc искусственным генетическим элементом PL-SDφ10 и интеграции на место гена poxB гена pycA B. subtilis под контролем промотора PL фага лямбда, использовали ранее полученные препараты P1-трансдуцирющих фагов, содержащие соответствующие маркированные модификации [18–20]. Удаление маркера, фланкированного att-сайтами фага лямбда, из хромосом целевых штаммов, проводили с использованием плазмиды pMWts-Int/Xis, как описано ранее [21]. Трансформацию штаммов плазмидами осуществляли по стандартной методике.

Культивирование штаммов. Рекомбинантные штаммы выращивали в течение ночи в среде М9, содержащей 2 г/л глюкозы, при 37°C. Для микроаэробного культивирования по 5 мл полученных ночных культур разбавляли в 10 раз, добавляя 45 мл среды М9, содержащей 10 г/л глюкозы, 10 г/л дрожжевого экстракта и 2.5 г/л NaHCO3. Полученные культуры инкубировали в колбах объемом 750 мл, закрытых ватными пробками на роторной качалке при 250 об./мин в течение 8 ч при 37°C. Насыщение среды кислородом оценивали в контрольных колбах с соответствующими культурами при инкубации в присутствии резазурина. Экспрессию генов, находящихся под контролем LacI-зависимого промотора Ptrc-ideal-4, индуцировали спустя 3 ч от начала инкубации, добавляя в среды культивирования изопропил-β-D-тиогалактозид (ИПТГ) до конечной концентрации 1.0 мМ.

Клеточные суспензии центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин и в полученных супернатантах определяли концентрации секретированных метаболитов и остаточной глюкозы. Все эксперименты повторялись не менее трех раз.

Аналитические методы. Концентрации органических кислот в культуральных жидкостях, освобожденных от биомассы центрифугированием, определяли методом ВЭЖХ с использованием системы “Waters” HPLC system (США). Применяли ион-эксклюзионную колонку Rezex ROA-Organic Acid H+ (8%) (“Phenomenex”, США) с детекцией при длине волны 210 нм. В качестве подвижной фазы использовали водный раствор серной кислоты (2.5 мМ) со скоростью потока 0.5 мл/мин. Для измерения концентрации глюкозы, система была укомплектована рефрактивным детектором “Waters” 2414 и колонкой Spherisorb-NH2 (“Waters”, США). Подвижной фазой служила смесь ацетонитрил-вода в соотношении 75 : 25 об./об. при скорости потока 1.0 мл/мин.

Идентификацию и количественный анализ масляной и адипиновой кислот в культуральных жидкостях осуществляли методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием, как описано ранее [13]. Использовали газовый хроматограф Agilent 6890N, с автосамплером 7683B и масс-селективным детектором Agilent 5975 MSD, укомплектованный капиллярной колонкой Agilent DB-5MS (“Agilent”, США). В качестве внутренних стандартов использовали валериановую и пимелиновую кислоты. Для ионизации аналитов была использована ионизация электронами (70 eV). Масс-анализатор функционировал в режиме селективного детектирования (145 m/z и 73 m/z для масляной кислоты, 275 m/z и 172 m/z для адипиновой кислоты, 159 m/z для валериановой кислоты, 289 m/z для пимелиновой кислоты).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее сконструированный штамм E. coli MG1655 lacIQ, ∆ackA-pta, ∆poxB, ∆ldhA, ∆adhE, PL-SDj10-atoB, Ptrc-ideal-4-SDj10-fadB, ∆fadE, PL-SDj10-tesB, ∆yciA, Ptrc-ideal-4-SDj10-fabI, PL-SDj10-paaJ [13] был способен к синтезу адипиновой кислоты из глюкозы по обращенному БОЖК при катализе терминальных реакций цикла еноил-АПБ-редуктазой/ацил-КоА-дегидрогеназой FabI, промежуточном образовании 3-гидроксиадипил-КоА и 2,3-дидегидроадипил-КоА бифункциональной (S)-3-гидроксиацил-КоА-дегидрогеназой/еноил-КоАредуктазой FadB и в результате первичной конденсации ацетил-КоА и сукцинил-КоА под действием 3-оксоацил-КоА-тиолазы PaaJ. Инактивация в штамме глиоксилатного шунта способствовала “сбережению” изоцитрата, предшественника сукцинил-КоА, и обеспечивала увеличение продукции адипиновой кислоты штаммом E. coli MG1655 lacIQ, ∆ackA-pta, ∆poxB, ∆ldhA, ∆adhE, PL-SDj10-atoB, Ptrc-ideal-4-SDj10-fadB, ∆fadE, PL-SDj10-tesB, ∆yciA, Ptrc-ideal-4-SDj10-fabI, PL-SDj10-paaJ, ∆aceBAK, ∆glcB (AdiBOX 1.0) в 3.3 раза, с ~101 до ~330 мкМ, за счет повышения относительной внутриклеточной доступности соответствующего КоА-производного для целевых биосинтетических реакций. При этом, значимая секреция штаммом AdiBOX 1.0 уксусной кислоты (табл. 2) свидетельствовала об избыточной генерации в клетках рекомбинанта ацетил-КоА и формировании сукцинил-КоА в количествах, недостаточных для эффективного и полного вовлечения этих тиоэфиров в реакции обращенного БОЖК. Сукцинил-КоА, являясь интермедиатом ЦТК, как формируется, так и потребляется в реакциях соответствующего цикла. Поэтому его сниженная внутриклеточная доступность для конденсации с ацетил-КоА могла быть связана как с пониженной интенсивностью его образования из 2-кетоглутарата под действием 2-кетоглутаратдегидрогеназы (КФ 1.2.1.105), так и с его интенсивной конверсией в янтарную кислоту сукцинил-КоА синтетазой. Для оценки эффективности формирования сукцинил-КоА в реакциях ЦТК, гены sdhAB, кодирующие компоненты сукцинатдегидрогеназного ферментативного комплекса, были инактивированы в штамме AdiBOX 1.0. Количество янтарной кислоты, секретированное соответствующим рекомбинантом в ходе потребления глюкозы, могло служить индикатором максимального уровня формирования в штамме сукцинил-КоА, являющегося прямым предшественником этого легко детектируемого дикарбоксилата. При утилизации углеродного субстрата, штамм AdiBOX 1.0 ΔsdhAB синтезировал янтарную кислоту в количествах, возросших в ~3 раза по сравнению с родительским штаммом, тогда как секреция адипиновой кислоты повышалась лишь незначительно (на ~5%), в первую очередь, по-видимому, за счет некоторого снижения продукции рекомбинантом уксусной кислоты (табл. 2). Приращение в уровне секретированной штаммом янтарной кислоты в 2.2 мМ указывало, в первую очередь, на то количество углерода, которое вовлекалось в родительском штамме в повторные раунды оксидативного ЦТК с формированием СО2 в качестве конечного продукта. В результате, эффект прекращения полноценного функционирования цикла вследствие инактивации в штамме сукцинатдегидрогеназы был, таким образом, незначительным и не оказывал существенного влияния на формирование рекомбинантом основных секретированных метаболитов. Более того, полученные данные свидетельствовали о том, что лишь ~7% потребленной штаммом глюкозы вовлекалось в реакции ЦТК и уровень формирования рекомбинантом сукцинил-КоА мог достигать максимум 3.1 мМ.

 

Таблица 2. Концентрации и выходы основных метаболитов, а также концентрации производных обращенного β-окисления жирных кислот, секретированных сконструированными штаммами при микроаэробной утилизации глюкозы*

Штамм

Глюкоза,

мМ

Пировиноградная кислота,

Уксусная кислота,

Янтарная кислота,

Масляная кислота,

Адипиновая кислота,

мМ

моль/моль, %

мМ

моль/моль,

%

мМ

моль/моль,

%

мкМ

мкМ

AdiBOX 1.0

42.0 ± 2.4

22.3 ± 1.0

53.1

13.0 ± 1.1

30.9

0.9 ± 0.1

2.1

134.2 ± 11.8

330.6 ± 32.7

AdiBOX 1.0 ΔsdhAB

41.0 ± 2.1

22.7 ± 1.3

55.4

10.8 ± 0.6

26.3

3.1 ± 0.3

7.6

130.7 ± 11.5

346.0 ± 34.3

AdiBOX 1.0 PL-ppc

42.2 ± 2.3

10.2 ± 0.6

24.1

13.6 ± 1.2

32.2

1.4 ± 0.1

3.3

138.5 ± 12.2

389.3 ± 36.2

AdiBOX 1.0 PL-pycA

41.7 ± 2.0

7.3 ± 0.4

17.5

12.8 ± 0.8

30.7

2.0 ± 0.2

4.8

132.1 ± 11.6

496.1 ± 47.6

AdiBOX 1.0 PL-pycA ΔsdhAB

40.3 ± 2.2

6.2 ± 0.4

15.4

11.3 ± 0.7

28.0

5.9 ± 0.4

14.6

133.6 ± 12.7

520.9 ± 45.8

* Приведены стандартные отклонения для трех независимых экспериментов.

 

Основными метаболитами, секретированными штаммами AdiBOX 1.0 и AdiBOX 1.0 ΔsdhAB, являлись пировиноградная и уксусная кислоты. При этом, соответствующие рекомбинанты конвертировали более половины потребленного углеродного субстрата в пировиноградную кислоту с выходом, составляющим около 55%, тогда как выход секретированной штаммами уксусной кислоты был существенно ниже (табл. 2). Это, с учетом полученных данных о секреции штаммом AdiBOX 1.0 ΔsdhAB янтарной кислоты, указывало на то, что гликолитические предшественники не эффективно вовлекались в ЦТК, в первую очередь, по-видимому, в силу дефицита в клетках рекомбинантов щавелевоуксусной кислоты (ЩУК), образующейся при карбоксилировании трехуглеродных продуктов гликолиза. Таким образом, повышение внутриклеточной доступности сукцинил-КоА для инициации биосинтеза адипиновой кислоты по обращенному БОЖК требовало интенсификации ЦТК. Согласно полученным результатам, соответствующая интенсификация могла быть обеспечена в результате повышения в штаммах активности ферментов, ответственных за формирование ЩУК из трехуглеродных субстратов. В E. coli анаплеротическое образование ЩУК происходит под действием карбоксилирующей фосфоенолпируват фосфоенолпируваткарбоксилазы Ppc (КФ 4.1.1.31). Для повышения внутриклеточной доступности ЩУК для ее конденсации с ацетил-КоА и, соответственно, интенсификации ЦТК, экспрессия гена ppc в штамме AdiBOX 1.0 была усилена.

В результате внесения данной модификации, продукция пировиноградной кислоты соответствующим производным штаммом AdiBOX 1.0 PL-ppc снижалась более чем вдвое, с 22.3 мМ до 10.2 мм, тогда как секреция адипиновой кислоты возрастала в ~1.2 раза, c ~330 мкМ до ~390 мкМ (табл. 2). При этом, уровень формирования штаммом AdiBOX 1.0 PL-ppc уксусной кислоты оставался практически неизменным по сравнению с родительским штаммом AdiBOX 1.0, а секреция янтарной кислоты возрастала в ~1.5 раз (табл. 2). При неизменном уровне формирования штаммом уксусной кислоты, полученные данные указывали на то, что снижение в 2.2 раза секреции рекомбинантом пировиноградной кислоты, являющейся как прямым производным фосфоенолпирувата, так и прямым предшественником ацетил-КоА, могло приводить к интенсификации ЦТК лишь в 1.1 раз. Соответствующая оценка совпадала с ростом синтеза штаммом адипиновой кислоты.

Следует отметить, что в E. coli фосфоенолпируваткарбоксилаза конкурирует за общий субстрат, ФЕП, с гликолитическими пируваткиназами PykA и PykF (КФ 2.7.1.40), синтезирующими из соответствующего предшественника пировиноградную кислоту, необходимую для дальнейшего образования ацетил-КоА. При этом, было показано, что экспрессия в клетках E. coli гена гетерологичной пируваткарбоксилазы (КФ 6.4.1.1), формирующей ЩУК из пировиноградной кислоты, способствует такому перераспределению потоков углерода в метаболическом узле ЩУК – фосфоенолпируват – пировиноградная кислота – ацетил-КоА, который ведет к повышенному формированию рекомбинантами производных ЦТК [19, 20, 22].

При введении в клетки базового штамма гена pycA B. subtilis, кодирующего пируваткарбоксилазу, и его экспрессии под контролем сильного конститутивного промотора PL фага лямбда, секреция пировиноградной кислоты полученным рекомбинантом AdiBOX 1.0 PL-pycA снижалась до 7.3 мМ при выходе 17.5%, что соответствовало падению в 3 раза относительно показателя родительского штамма AdiBOX 1.0 (табл. 2). Как и в случае усиления туннелирования фосфоенолпирувата к ЩУК в штамме AdiBOX 1.0 PL-ppc, выраженное перенаправление пировиноградной кислоты в сторону формирования соответствующего производного в штамме AdiBOX 1.0 PL-pycA не оказывало значимого влияния на формирование рекомбинантом уксусной кислоты. Вместе с тем, синтез адипиновой кислоты штаммом AdiBOX 1.0 PL-pycA возрастал в 1.5 раз до ~ 500 мкМ, на фоне роста секреции янтарной кислоты в 2 раза (табл. 2). По аналогии с оценкой синтеза метаболитов штаммом AdiBOX 1.0 PL-ppc, полученные результаты косвенно свидетельствовали об интенсификации ЦТК в клетках штамма AdiBOX 1.0 PL-pycA в 1.5 раза.

Таким образом, рост биосинтеза адипиновой кислоты из глюкозы по обращенному БОЖК сконструированными штаммами был прямо пропорционален оценочной степени интенсификации в них ЦТК. Вместе с тем, демонстрируемые штаммами AdiBOX 1.0 PL-ppc и AdiBOX 1.0 PL-pycA значения углеродного баланса, рассчитанного как отношение общего количества молей углерода в детектированных продуктах, к количеству молей углерода потребленной глюкозы, составляли лишь 0.25 и 0.22 соответственно. Это могло указывать на более выраженную, нежели рассчитанную на основании изменения секреции пировиноградной кислоты, интенсификацию в рекомбинантах ЦТК, сопровождающуюся значительными потерями углерода в виде СО2 при множественных обращениях цикла. Для проверки этого предположения, в штамме AdiBOX 1.0 PL-pycA была осуществлена инактивация сукцинатдегидрогеназы, позволяющая, как указывалось выше, прямо оценить интенсивность ЦТК в соответствующем производном по уровню секреции им янтарной кислоты.

Полученный штамм AdiBOX 1.0 PL-pycA ΔsdhAB синтезировал янтарную кислоту из глюкозы с выходом, возросшим до 14.6% и в 1.9 раз превышающим показатель штамма AdiBOX 1.0 ΔsdhAB (табл. 2). Таким образом, экспрессия в штамме AdiBOX 1.0 PL-pycA ΔsdhAB гена пируваткарбоксилазы обеспечивала интенсификацию ЦТК в рекомбинанте в 1.9 раз. Соответствующее значение лишь немного превосходило подобное, ранее рассчитанное на основании изменения секреции пировиноградной кислоты для штамма AdiBOX 1.0 PL-pycA (1.5 раза). Секреция адипиновой кислоты штаммом AdiBOX 1.0 PL-pycA ΔsdhAB ~520 мкМ, также была в 1.5 раза выше аналогичного показателя соответствующего контрольного штамма (табл. 2). Таким образом, эти данные служили четким подтверждением предположения о прямой зависимости роста эффективности биосинтеза адипиновой кислоты из глюкозы по обращенному БОЖК сконструированными штаммами от степени интенсификации в них ЦТК. Вместе с тем, полученные результаты свидетельствовали об общей невысокой эффективности формирования в рекомбинантах сукцинил-КоА в реакциях ЦТК даже после интенсификации цикла. Действительно, лишь ~14% потребленной штаммом AdiBOX 1.0 PL-pycA ΔsdhAB глюкозы было конвертировано в янтарную кислоту, указывая на максимально возможный уровень синтеза рекомбинантом сукцинил-КоА в пределах 6 мМ (табл. 2). Несмотря на то, что в результате инактивации сукцинатдегидрогеназы относительная внутриклеточная доступность сукцинил-КоА для реакций обращенного БОЖК потенциально была повышена в штамме AdiBOX 1.0 PL-pycA ΔsdhAB в ~3 раза по сравнению со штаммом AdiBOX 1.0 PL-pycA (5.9 мМ против 2.0 мМ), синтез адипиновой кислоты соответствующим рекомбинантом увеличивался лишь на 5%. Таким образом, можно было заключить, что поток углерода через реакцию катализируемую 2-кетоглутаратдегидрогеназой, достигнутый в сконструированных штаммах и обеспечивающий формирование сукцинил-КоА в вышеуказанных количествах, был недостаточным для эффективного туннелирования последнего в реакции обращенного БОЖК. В совокупности с полученными результатами, свидетельствующими о позитивном эффекте интенсификации ЦТК на биосинтез целевого соединения, это предполагает необходимость дальнейшей оптимизации функциональности цикла в сконструированных штаммах для повышения эффективности образования ими адипиновой кислоты.

Известно, что активность 2-кетоглутаратдегидрогеназы в E. coli снижена при выращивании клеток в богатых и содержащих глюкозу средах [23], что ограничивает поток углерода к янтарной кислоте через сукцинил-КоА и обуславливает проявление эффекта избыточного метаболизма глутаминовой кислоты (“glutamate overflow”), выражающегося в перенаправлении 2-кетоглутарата из ЦТК в сторону формирования соответствующей аминокислоты [24, 25]. Одним из подходов к преодолению соответствующей лимитации является обеспечение в клетках E. coli функциональности искусственного шунта 2-кетоглутарат – сукцинат-полуальдегид – янтарная кислота, опосредованного действием гетерологичной 2-кетоглутаратдекарбоксилазы (КФ 4.1.1.71) и нативных для данной бактерии сукцинат-полуальдегиддегидрогеназ (КФ 1.2.1.24/1.2.1.7) [19, 20, 22]. При этом, поскольку сукцинил-КоА-синтетаза катализирует обратимую интерконверсию янтарной кислоты и сукцинил-КоА, синтезированная рекомбинантами янтарная кислота может быть превращена в соответствующий тиоэфир, необходимый для биосинтеза тех или иных целевых соединений, при усилении в штаммах экспрессии генов, кодирующих компоненты соответствующего ферментативного комплекса [26, 27]. Соответственно, перенаправление потока углерода от 2-кетоглутарата к сукцинил-КоА через промежуточное образование сукцинат-полуальдегида и янтарной кислоты может рассматриваться в качестве одной из возможных стратегий для дальнейшего улучшения биосинтетических характеристик полученных в работе рекомбинантов.

В итоге, в результате проведенного исследования, сконструированы штаммы E. coli способные к повышенному биосинтезу адипиновой кислоты из глюкозы по обращенному БОЖК. Показано позитивное влияние усиления генерации ЩУК из трехуглеродных предшественников на биосинтез штаммами целевого соединения. Выявлена прямая зависимость между интенсификацией ЦТК и ростом эффективности биосинтеза полученными рекомбинантами адипиновой кислоты. Предложена стратегия дальнейшего улучшения биосинтетических характеристик соответствующих адипат-продуцирующих штаммов.

×

Об авторах

А. Ю. Гулевич

Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: andrey.gulevich@gmail.com
Россия, Москва

А. Ю. Скороходова

Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” Российской академии наук

Email: andrey.gulevich@gmail.com.ru
Россия, Москва

В. Г. Дебабов

Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” Российской академии наук

Email: andrey.gulevich@gmail.com.ru
Россия, Москва

Список литературы

  1. Lang M., Li H. // ChemSusChem. 2022. V. 15. № 1. e202101531. https://doi.org/10.1002/cssc.202101531
  2. Skoog E., Shin J.H., Saez-Jimenez V., Mapelli V., Olsson L. // Biotechnol. Adv. 2018. V. 36. № 8. P. 2248–2263.
  3. Thomas J.M., Raja R., Johnson B.F., O’Connell T.J., Sankar G., Khimyak T. // Chem. Commun. 2003. V. 21 № 10. P. 1126–1127.
  4. Lin Y., Sun X., Yuan Q., Yan Y. // Metab. Eng. 2014. V. 23. P. 62–69.
  5. Zhang H., Li Z., Pereira B., Stephanopoulos G. // Microb. Cell. Factories. 2015. V. 14. № 1. https://doi.org/10.1186/s12934-015-0319-0
  6. Weber C., Brueckner C., Weinreb S., Lehr C., Essl C., Boles E. // Appl. Environ. Microbiol. 2012. V. 78. P. 8421–8430.
  7. Curran K.A., Leavitt J.M., Karim A.S., Alper H.S. // Metab. Eng. 2013. V. 15. P. 55–66.
  8. Raj K., Partow S., Correia K., Khusnutdinova A.N., Yakunin A.F., Mahadevan R. // Metab. Eng. Commun. 2018. V. 6. P. 28–32.
  9. Kallscheuer T., Gätgens J., Lübcke M., Pietruszka J., Bott M., Polen T. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2017. V. 101. № 6. P. 2371–2382.
  10. Yu J. L., Xia X.X., Zhong J.J., Qian Z.G. // Biotechnol. Bioeng. 2014. V. 111. № 12. P. 2580–2586.
  11. Babu T., Yun E.J., Kim S., Kim D.H., Liu K.H., Kim S. R., Kim K. H. //Proc. Bioch. 2015. V. 50. № 12. P. 2066–2071.
  12. Cheong S., Clomburg J.M., Gonzalez R. // Nat. Biotechnol. 2016. V. 34. № 5. P. 556–561.
  13. Гулевич А.Ю., Скороходова А.Ю., Дебабов В.Г. // Прикл. биохимия и микробиология. 2023. Т. 59. № 3. С. 235–243.
  14. Zhao M., Huang D., Zhang X., Koffas M.A.G., Zhou J., Deng Y. // Metab. Eng. 2018. V. 47. P. 254–262.
  15. Skorokhodova A.Y., Gulevich A.Y., Morzhakova A.A., Shakulov R.S., Debabov V.G. // Biotechnol. Lett. 2013. V. 35. № 4. P. 577–583.
  16. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. // Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2 nd Ed., N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989. 1659 р.
  17. Datsenko K.A., Wanner B.L. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. № 12. Р. 6640–6645.
  18. Скороходова А.Ю., Стасенко А.А., Гулевич А.Ю., Дебабов В.Г. // Прикл. биохимия и микробиология. 2018. Т. 54. № 3. С. 244–252.
  19. Скороходова А.Ю., Гулевич А.Ю., Дебабов В.Г. // Прикл. биохимия и микробиология. 2023. Т. 59. № 6. https://doi.org/10.31857/S0555109923060168
  20. Skorokhodova A.Y., Gulevich A.Y., Debabov V.G. // Biotechnol. Rep. 2022. V. 33. e00703. https://doi.org/10.1016/j.btre.2022.e00703
  21. Гулевич А.Ю., Скороходова А.Ю., Ермишев В.Ю., Крылов А. А., Минаева Н. И., Полонская З. М. и др. // Молекулярная биология. 2009. Т. 43. № 3. С. 547–557.
  22. Skorokhodova A.Y., Stasenko A.A., Krasilnikova N.V., Gulevich A. Y., Debabov V. G. // Fermentation. 2022. V. 8. № 12. 738. https://doi.org/10.3390/fermentation8120738
  23. Park S.J., Chao G., Gunsalus R.P. // J. Bacteriol. 1997. V. 179. № 13. P. 4138–4142.
  24. Chang D.E., Shin S., Rhee J.S., Pan J.G. // J. Bacteriol. 1999. V. 181. № 21. P. 6656–6663.
  25. Burgard A., Burk M.J., Osterhout R., Van Dien S., Yim H. // Curr. Opin. Biotechnol. 2016. V. 42. P. 118–125.
  26. Choi S., Kim H.U., Kim T.Y., Lee S.Y. // Metab. Eng. 2016. V. 38. P. 264–273.
  27. Yim H., Haselbeck R., Niu W., Pujol-Baxley C., Burgard A., Boldt J. et al. // Nat. Chem. Biol. 2011. V. 7. № 7. P. 445–452.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Российская академия наук, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».