Voltage-dependent calcium channels in mammalian motor synapses – triggers and modulators of neuromuscular transmission

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Исключительная роль ионов Са²⁺, входящих снаружи в нервные терминали синапсов и приводящих к выбросу нейротрансмиттера, впервые была обнаружена в нервно-мышечных синапсах (НМС) [1]. В настоящее время вход ионов Са²⁺ через определенные пресинаптические потенциал-зависимые Са²⁺-каналы известен как специфический триггерный сигнал, запускающий процесс экзоцитоза синаптических везикул во всех типах химических синапсов [2, 3]. К концу XX века стало очевидным, что набор источников и спектр внутриклеточных Са²⁺-сигналов в нейронах и других клетках весьма разнообразен. В постсинаптических структурах синапсов ЦНС подробно описана пространственно-временная организация Са²⁺-сигналов, их мишени и влияния на разные режимы синаптической передачи [4, 5]. В то же время в пресинаптических нервных окончаниях подобные явления до сих пор остаются малоизученными.

В настоящее время известны примеры Са²⁺-зависимой пресинаптической пластичности, такие как Са²⁺-зависимое облегчение, депрессия, посттетаническая потенциация [6, 7]. Однако источники регуляторного Са²⁺ в таких случаях часто остаются неясными либо – по умолчанию – приписываются Са²⁺, входящему в нервные терминали по основному, триггерному Са²⁺-входу – в случае моторных синапсов млекопитающих это Са²⁺-каналы P/Q-типа [8]. Между тем в последние годы идентифицирован целый ряд других путей и возможностей локального повышения уровня Са²⁺ в нервных терминалях. Это и активность разнообразных пресинаптических потенциал-зависимых Са²⁺-каналов, отличных от триггерного Са²⁺-входа [9, 10], и пресинаптические Са²⁺-проводящие ионотропные хеморецепторы [11, 12], и выброс Са²⁺ из внутриклеточных Са²⁺-депо по каналам рианодиновых (РиР) или IP₃-рецепторов [13]. Как правило, такие Са²⁺-входы рассматривают как вспомогательный источник ионов Са²⁺ для усиления триггерного Са²⁺-сигнала в терминалях. Способны ли такие Са²⁺-входы обеспечивать определенную регулировку параметров квантовой секреции нейротрансмиттера как в сторону ее усиления, так и торможения – остается малоизученным. Выявление спектра регуляторных Са²⁺-входов, работающих в комплексе с соответствующими им мишенями, условий их вовлечения в управление квантовой секрецией нейротрансмиттера, установление механизмов, лежащих в основе их регуляторного влияния, безусловно, представляет собой актуальное направление современной синаптической физиологии.

Несмотря на имеющиеся попытки описания ряда пресинаптических Са²⁺-входов и мишеней ионов Са²⁺ в нервных терминалях синапсов в ЦНС [14–16], наиболее удобной моделью для решения проблемы являются периферические НМС – благодаря их крупным размерам, изолированной локализации на мышечных волокнах и доступности пресинаптических процессов для электрофизиологических экспериментов [17].

В настоящее время в моторных нервных терминалях млекопитающих, наряду с триггерным для экзоцитоза синаптических везикул Са²⁺-входом (потенциал-зависимые Са²⁺-каналы P/Q-типа), описан ряд других потенциал-зависимых Са²⁺-каналов [18–20]. Cреди них особый интерес представляют «медленные» Са²⁺-каналы L-типа, чьи условия активации и модуляторная роль в отношении нервно-мышечной передачи неоднозначны и продолжают интенсивно изучаться.

ПОТЕНЦИАЛ-ЗАВИСИМЫЕ Сa²⁺-КАНАЛЫ

Са²⁺-проводимость в нервных терминалях синапсов активируется в ответ на деполяризацию пресинаптической мембраны распространяющимся по аксону потенциалом действия (ПД). Каналы, обеспечивающие такую проводимость, относятся к семейству потенциал-зависимых Са²⁺-каналов (Ca_V).

В нервных терминалях синапсов в ЦНС и на периферии описана экспрессия нескольких типов Ca_V, которые отличаются по молекулярной структуре, функциональным свойствам, регуляции, локализации и влияниям на секрецию нейротрансмиттеров. Если рассматривать Ca_V безотносительно паттерна экспрессии и локализации именно в пресинаптической мембране нервных окончаний, то их традиционно делят на две группы.

Первая группа – высокопороговые Ca_V, активирующиеся (переходящие в открытое состояние) при низких значениях мембранного потенциала (МП) (HVA – high voltage activated). Им требуется значительная деполяризация мембраны по сравнению с потенциалом покоя (ПП) для их активации. К ним относят L-тип (Ca_V1.1–1.4), P/Q-тип (Ca_V2.1), N-тип (Ca_V2.2) и R-тип (Ca_V2.3) потенциал-зависимых Сa²⁺-каналов [3, 7, 21].

Вторая группа – единственный Т-тип Са²⁺-каналов (Ca_V3.1–3.3) – низкопороговый (LVA – low voltage activated). Эти каналы активируются при незначительных деполяризующих сдвигах МП, близких к ПП, демонстрируют быструю кинетику срабатывания воротного механизма и обладают малой унитарной проводимостью. LVA-каналы играют главную роль в реализации нейрональной пейсмейкерной активности, развитии эпилепсии и проведении болевых сигналов [22].

На рубеже XX-XXI веков было установлено, что у млекопитающих каналообразующие α1-субъединицы Ca_V кодируются 10 отдельными генами, разделяемыми на три отдельных подсемейства по сходству последовательностей. Основываясь на генетических данных, в современной физиологии Ca_V также делят на 3 группы – Ca_V1, Ca_V2 и Ca_V3 [3, 21, 23]. Несмотря на определенные нюансы, такое деление на три группы справедливо и для беспозвоночных [24].

Исследование потенциал-активируемых Ca²⁺-токов и опосредующих их каналов на многочисленных объектах показало, что простое разделение потенциал-зависимых Ca²⁺-каналов на LVA и HVA достаточно искусственно и в малой степени отражает фактическое положение дел. Реально существует континуум порогов активации среди различных подтипов Ca_V, который меняется в зависимости от результата альтернативного сплайсинга основной каналообразующей α1-субъединицы в конкретных клетках и дополнительно модифицируется в результате комбинирования изоформ вспомогательных субъединиц β, α2δ и γ, взаимодействующих с α1. Это в конечном итоге способно приводить к различным физиологическим проявлениям, включая модулирование синаптической передачи [25–27]. Тем не менее буквенные варианты обозначений Ca_V до сих пор продолжают употребляться для подчеркивания функциональной специфики.

На пресинаптической мембране могут быть представлены разные типы Ca_V, при этом в разных синапсах плотность и степень их участия в определенных режимах функционирования нервных терминалей выражены по-разному. Наиболее типичными для центральных синапсов в качестве триггеров экзоцитоза синаптических везикул являются HVA-каналы N- и P/Q-типов, тогда как у периферических синапсов амфибий в качестве такого триггера задействован N-тип, а у млекопитающих – P/Q-тип Са²⁺-каналов [28, 29].

МОЛЕКУЛЯРНАЯ СТРУКТУРА ПОТЕНЦИАЛ-ЗАВИСИМЫХ Сa²⁺-КАНАЛОВ

Основная каналообразующая α1-субъединица Ca_V-каналов

Потенциал-зависимые Са²⁺-каналы представляют собой мультисубъединичный комплекс, состоящий из основной каналообразующей субъединицы α1 с дополнительными субъединицами (за исключением Ca_V3, образующих канал без участия дополнительных субъединиц) [30, 31]. Субъединица α1 (190–250 кДа) является самой большой и включает в себя структуры, образующие проводящую ионы Ca²⁺ пору, сенсор напряжения и воротный механизм, а также большинство специфических участков, обеспечивающих широкий спектр регуляторных влияний на работу канала со стороны вторичных посредников, фармакологических агентов и токсинов.

Топологическая организация субъединицы α1, состоящей из примерно 2000 аминокислотных остатков, представляет собой 4 гомологичных домена (I–IV). Каждый из доменов состоит из 6 трансмембранных α-спиралей (S1 – S6) и неспирализованной P-петли между S5 и S6. Сенсор потенциала S4 содержит последовательности из 4–5 положительно заряженных аминокислотных остатков аргинина или лизина, разделенных трехаминокислотными интервалами. Положительные заряды в составе S4 находятся во взаимодействии с «противозарядами» (негативно заряженные и полярные аминокислотные остатки) в составе S1 – S3, образуя совместно потенциал-чувствительный домен [32, 33]. P-петли выстилают пору и содержат в определенных местах негативно заряженные аминокислотные остатки (в основном глутамат), формирующие ионоселективный фильтр канала.

Конформационные изменения S5 и S6, индуцированные в ответ на деполяризацию мембраны транслокацией во внешний листок плазмалеммы S4 в составе потенциал-чувствительного домена, обеспечивают непосредственное функционирование воротного механизма Ca_V [33]. Обширные внутриклеточные неспирализованные участки α1-субъединицы – направленные в цитоплазму N- и С-концы, междоменные петли – служат своеобразной сигнальной платформой для модулирования Ca²⁺-токов и в конечном итоге Ca²⁺-зависимой регуляции синаптической передачи.

Вспомогательные субъединицы Ca_V-каналов

Свойства Ca_V1 и Ca_V2 модулируются вспомогательными субъединицами, зачастую обеспечивая различные роли этих типов каналов в секреции нейротрансмиттеров.

β-субъединицы Ca_V – результат экспрессии 4 отдельных генов. Это цитоплазматические модуляторы функций Ca_V, регулирующие как количество каналов на мембране клетки, так и их потенциал-зависимую активацию и инактивацию [34, 35]. β-субъединицы взаимодействуют с α1-субъединицами за счет наличия у последних специального участка на внутриклеточной петле между I и II доменами.

Субъединицы α2δ – результат посттрансляционного процессинга продукта одного из 4 генов, кодирующих препробелок, в результате протеолиза которого образуются α2 и δ, соединенные дисульфидным мостиком. За счет гликозилфосфатидилинозитольного якоря α2δ взаимодействуют с внешним листом плазмалеммы и одновременно связываются с первой внеклеточной петлей домена I α1-субъединиц Ca_V1 и Ca_V2. α2δ-субъединицы могут регулировать активацию и инактивацию Ca_V, а также не просто их плотность на поверхности клеток (вместе с β-субъединицами), но и траффик Ca_V в специфические мембранные домены нейронов, включая пресинаптическую мембрану [36, 37]. Кроме того, α2δ могут обеспечивать транссинаптические взаимодействия с белками постсинаптической мембраны, включая рецепторы к нейротрансмиттерам [38, 39], и определять уровень вероятности выброса нейротрансмиттера в синапсах ЦНС [40].

γ-субъединица является неотъемлемым компонентом Ca_V1.1, но не пресинаптических Ca_V2.1 и Ca_V2.2 [21].

Таким образом, ансамбль дополнительных субъединиц Ca_V, хотя и модулирует функциональные характеристики Ca²⁺-каналов, но ключевые фармакологические и физиологические различия Ca_V обусловлены преимущественно различиями в структуре изоформ их α1-субъединиц.

ЛОКАЛИЗАЦИЯ ПОТЕНЦИАЛ-ЗАВИСИМЫХ Са²⁺-КАНАЛОВ В АКТИВНЫХ ЗОНАХ МОТОРНЫХ НЕРВНЫХ ТЕРМИНАЛЕЙ

Начиная с 60-х годов XX столетия стало известно, что в НМС и всех других химических синапсах квантовая секреция нейротрансмиттера происходит в специализированных регионах пресинаптической мембраны – активных зонах [41, 42]. Набор специфически взаимодействующих белков активных зон обеспечивает не только рекрутирование, докинг, прайминг синаптических везикул и их последующий экзоцитоз, но и позиционирование Са_V в непосредственной близости от везикул и точное расположение пре- и постсинаптических структур друг напротив друга, а также участвует в реализации пресинаптической пластичности [43, 44].

Активные зоны НМС млекопитающих организованы в виде коротких (80–100 нм) линейных рядов, образованных синаптическими везикулами и внутримембранными частицами (ионными каналами и др.). В каждой активной зоне экзоцитоз синаптических везикул происходит в местах их докинга, а по бокам от них расположены ряды из примерно 20 трансмембранных частиц, часть из которых считается Са_V [45]. Таким образом, в активных зонах НМС млекопитающих Са_V расположены по обеим сторонам докированных синаптических везикул, в отличие от НМС лягушки, где ряды частиц в активных зонах значительно длиннее (1–2 мкм), а Са_V располагаются только с одной стороны от синаптических везикул [46]. Эксперименты с использованием высокочастотной стимуляции показали, что в НМС мыши число докированных синаптических везикул, отражающих максимально возможный размер пула везикул, готовых к выбросу (RRP – readily-releasable pool), составляет около 1700 [47]. Учитывая, что зрелый НМС мыши содержит примерно 900 активных зон [29, 48], эти данные подтверждают предположения, полученные с помощью электронно-микроскопических методов, о наличии в каждой активной зоне моторных синапсов млекопитающих двух синаптических везикул, потенциально готовых к экзоцитозу.

Слияние синаптических везикул с пресинаптической мембраной может происходить и в отсутствие электрической стимуляции мембраны (спонтанная секреция), и в течение миллисекунд после достижения потенциала действия нервной терминали (быстрый синхронный выброс нейротрансмиттера) или в течение десятков секунд после стимуляции (асинхронный выброс). Все эти паттерны секреции нейротрансмиттеров по-разному зависят от изменения внутритерминальной концентрации ионов Ca²⁺ и функционирования определенных Ca²⁺-входов [49–51]. В подавляющем большинстве химических синапсов, включая нервно-мышечные, основными (триггерными) Ca²⁺-входами, обеспечивающими быстрый синхронный выброс нейротрансмиттера, служат Ca²⁺-каналы семейства Ca_V2 – Ca_V2.1 (P/Q-тип) и Сa_V2.2 (N-тип) и в меньшей степени – Ca_V2.3 (R-тип). Ключевая роль единичной изоформы Ca_V2 для запуска выброса нейротрансмиттеров показана и в НМС беспозвоночных (Drosophila melanogaster и Caenorhabditis elegans) [37, 52, 53], несмотря на ее определенные структурно-функциональные отличия от изоформ Ca_V2 позвоночных животных [24].

ПОТЕНЦИАЛ-ЗАВИСИМЫЕ Ca²⁺-КАНАЛЫ P/Q-ТИПА (Сa_V2.1) И ИХ РОЛЬ В НЕРВНЫХ ТЕРМИНАЛЯХ

Свое название Ca²⁺-каналы P/Q-типа получили после описания токсинов пауков, блокирующих Ca²⁺-токи, опосредуемые Ca²⁺-каналами в клетках Пуркинье (P-тип) или в гранулярных клетках мозжечка (Q-тип) [54, 55]. Ca²⁺-токи, чувствительные к этим токсинам, обеспечивают вызванную синаптическую активность не только во многих синапсах ЦНС, но и в НМС млекопитающих. В них селективный блокатор Са_V2.1 ω-агатоксин IVA способен полностью терминировать быструю синхронную многоквантовую секрецию АХ [56, 57]. Оба Ca²⁺-тока P- и Q-типа развиваются при срабатывании Ca_V с основной порообразующей субъединицей α1A, кодируемой одним геном CACNA1A. Разделение токов (и каналов) на P- и Q-типы может быть результатом комбинирования α1A-субъединицы с различными изоформами Ca_Vβ-субъединиц [58]. В НМС мыши доминирующей изоформой β-субъединицы, взаимодействующей с α1A Ca_V2.1, является β4 [59].

Еще одним фактором, обеспечивающим экспрессию широкого спектра Сa_V2.1-токов (которые сейчас называют P/Q-типом) с разными биофизическими и фармакологическими характеристиками, является альтернативный сплайсинг гена, кодирующего α1A-субъединицу Сa_V2.1 [60].

Роль субъединицы α1A Ca²⁺-каналов P/Q-типа в их активности

Об исключительной функциональной важности именно α1A-субъединицы по сравнению с дополнительными в составе гетеромультимерных комплексов Ca²⁺-каналов P/Q-типа для обеспечения нервно-мышечной передачи свидетельствуют данные о неврологических повреждениях (прогрессирующей атаксии и дистонии) у мышей с нокаутом гена α1A-субъединицы. Это сопровождалось значительными нарушениями синаптической передачи и смерти в течение нескольких недель после рождения, несмотря на компенсаторное участие в поддержании быстрой синхронной секреции квантов AX со стороны других типов Ca_V [61, 62].

α1A-субъединицы P/Q-типа Ca²⁺-каналов моторных синапсов являются ключевой мишенью аутоантител при миастеническом синдроме Ламберта – Итона. Характерной особенностью патогенеза этого заболевания является не просто уменьшение поступления ионов Ca²⁺ в моторное нервное окончание, но и дезорганизация там активных зон, сопровождающаяся изменением сопряжения триггерного Ca²⁺-входа и синаптических везикул. Это, учитывая нелинейность Ca²⁺-зависимости быстрой синхронной секреции нейротрансмиттеров в химических синапсах, крайне негативно сказывается на нервно-мышечной передаче [42, 63, 64].

Ключевая роль Ca_V2.1 в обеспечении секреции нейротрансмиттеров не только в качестве триггерного Ca²⁺-входа, но и как участника формирования и функционирования активных зон показана не только при каналопатиях и аутоиммунных воздействиях на этот тип Ca_V, но и по результатам протеомного анализа. Количественная протеомика свидетельствует, что пресинаптический интерактом (паттерн взаимодействия белков) Сa_V2 образует так называемое наноокружение и насчитывает около 200 белков, хотя не все из них связаны с Ca_V2 напрямую [65].

Именно такая эволюционно консервативная тесная ассоциация Сa_V2 с определенными белками активных зон обеспечивает при открывании этих каналов в ответ на приход ПД регулируемый быстрый экзоцитоз синаптических везикул, что будет рассмотрено далее.

Связь Ca²⁺-каналов P/Q-типа с белками докинга и прайминга синаптических везикул

Белки, взаимодействующие с везикулярными малыми ГТФазами Rab3 (RIMs – Rab3-interacting molecules), являются одними из ключевых факторов активных зон, обеспечивающими не только докинг и прайминг синаптических везикул. Они также связываются посредством своих PDZ-доменов с консервативным аминокислотным мотивом на цитоплазматическом С-конце α1А-субъединицы Сa_V2.1 [66]. Такое взаимодействие является необходимым для рекрутирования в активные зоны Сa_V2.1 и их правильного позиционирования, определяя там их плотность. Помимо прямого взаимодействия, RIMs также контактируют c Сa_V2.1 опосредованно, за счет взаимодействия с RIM-связывающими белками, которые связываются с богатыми пролином участками на C-конце субъединицы α1А Сa_V2.1. Учитывая многочисленные связи RIMs и RIM-связывающих белков как с β-субъединицей Ca²⁺-каналов, так и белками цитоматрикса активных зон СAST/ELKS и Bassoon, также взаимодействующими с β-субъединицей, можно говорить о наличии в активной зоне взаимосвязанной белковой сети. Основой такой сети служит тройной комплекс – RIMs, RIM-связывающие белки и C-концы Сa_V2.1, располагающий эти триггерные Ca²⁺-каналы на определенном расстоянии от синаптических везикул (позиционный прайминг). Нарушение одной точки связи в такой сети может быть скомпенсировано за счет других молекулярных взаимодействий Сa_V2.1-каналов в активных зонах [3, 37, 67, 68].

В синапсах ЦНС взаимодействие субъединиц Ca_V2.1 с RIMs, белками цитоматрикса и белковыми регуляторами прайминга определяет не только собственно позиционный прайминг синаптических везикул по отношению к триггерному Ca²⁺-входу, но и разнонаправленно контролирует время перехода самих Ca²⁺-каналов из закрытого в открытое состояние и обратно в ответ на пресинаптический ПД, а также – потенциалозависимость их инактивации. Это в конечном итоге обусловливает динамику функционирования Ca²⁺-каналов и Ca²⁺-зависимого характера секреции квантов нейротрансмиттера при ритмической нейрональной активности [69, 70].

Учитывая высокую консервативность белков активных зон и машинерии экзоцитоза, а также доказанное наличие всех ключевых белков в активных зонах моторных нервных терминалей млекопитающих [71, 72], можно с уверенностью предполагать, что сходный характер влияния белков позиционного прайминга на активность Ca_V2.1 имеет место и в активных зонах НМС млекопитающих.

Регуляция Ca²⁺-каналов P/Q-типа в нервных терминалях: synprint-сайт Са_V2-каналов

В составе триггерных Сa_V2 был идентифицирован synprint-сайт (synaptic protein interaction). Это последовательность аминокислот в составе цитоплазматической петли между доменами II и III α1-субъединиц каналов Cav2.1 и Cav2.2. Synprint обеспечивает Ca²⁺-зависимое связывание несущих его Ca²⁺-каналов с белками экзоцитоза SNARE-комплекса синтаксином и SNAP-25, а также с быстрым низкоаффинным везикулярным Сa²⁺-сенсором синаптотагмином (1, 2 или 9) [73, 74]. Физиологическое значение такого прямого взаимодействия заключается не в физической связи канала с синаптической везикулой и машинерией экзоцитоза, а в регуляции активности самих триггерных Ca²⁺-каналов. Встроенные в пресинаптическую мембрану синтаксин и SNAP-25 (t-SNAREs) еще вне собранных SNARE-комплексов при отсутствии докированной синаптической везикулы обеспечивают сдвиг потенциалозависимости инактивации Ca_V2.1 в сторону более негативных значений МП. Это уменьшает доступность каналов для обеспечения экзоцитоза, но не препятствует их активации [74, 75]. Образование окончательно собранных SNARE-комплексов с участием везикулярных синаптотагминов и взаимодействие именно этих синаптотагминов с synprint обеспечивает отмену негативного влияния t-SNARE на Ca_V2.1. Это способствует открытию Ca²⁺-каналов, входу через них ионов Ca²⁺, взаимодействию последних с синаптотагминами и в конечном итоге увеличению вероятности выброса (p – probability) докированных вблизи этих Ca²⁺-каналов синаптических везикул [74, 76]. Совсем недавно появились данные о взаимодействии медленного, высокоаффинного синаптотагмина-7 с synprint-сайтом Ca_V2.1, что модулирует Ca²⁺-зависимую фасилитацию (CDF) и Ca²⁺-зависимую инактивацию (CDI) канала, обеспечивая в конечном итоге кратковременное облегчение квантовой секреции и асинхронный выброс нейротрансмиттера в синапсах ЦНС [76–78].

Взаимодействие t-SNAREs c сайтом synprint контролируется фосфорилированием synprint Ca²⁺-зависимыми ферментами – протеинкиназой С (PKC) и кальций-кальмодулин-зависимой киназой II типа (CaMKII) [79, 80]. Кроме того, не только synprint, но и другие участки в составе α1А-субъединицы Сa_V2.1 могут функционально взаимодействовать со SNARE-белками, расширяя таким образом возможности регуляторных воздействий со стороны Ca_V2.1 на процесс запуска нейротрансмиссии [81].

Регуляция Ca²⁺-каналов P/Q-типа в нервных терминалях: ионы Са²⁺ и кальмодулин (СаМ)

Вход ионов Ca²⁺, изменяя их цитоплазматическую концентрацию около Сa_V2.1, влияет не только на экзоцитоз синаптических везикул, но и на активность самих Ca²⁺-каналов. Это происходит за счет стимулирования Ca²⁺-связывающих белков и прежде всего CaM. Внутриклеточный С-конец α1A-субъединицы несет два функционально важных участка, обеспечивающих ее взаимодействие с Ca²⁺-связывающими белками – IQ-похожим мотивом (IM) и CaM-связывающим доменом (CBD). При увеличении локальной концентрации ионов Ca²⁺ связывающие его белки сначала взаимодействуют с участком IM, инициируя CDF, обеспечивая развитие кратковременного облегчения синаптической передачи в НМС мыши. В случае длительного (глобального) повышения концентрации ионов Ca²⁺ СaM, связывая больше ионов Ca²⁺, взаимодействует и с СBD, индуцируя CDI Ca_V2.1 [82–84]. Эти данные свидетельствуют о том, что регулирование активности триггерных Ca_V2.1 с помощью СaM и других Сa²⁺-связывающих белков может играть одну из ключевых ролей в механизмах кратковременной пластичности в моторных синапсах.

Регуляция Ca²⁺-каналов P/Q-типа в нервных терминалях: пресинаптические метаботропные рецепторы и G-белки

Модулирование активности Сa_V2.1 не исчерпывается их взаимодействием с белками SNARE-комплекса и Сa²⁺-связывающими белками. Еще один путь регуляции работы Ca_V2 – их ингибирование за счет активности G-белок-сцепленных рецепторов, связанных с G_i/G₀-белками. Такое ингибирование Ca_V реализуется за счет замедления их активации и опосредуется непосредственным взаимодействием βγ-субъединиц G-белка с определенными участками на N- и С-концах, а также на цитоплазматической петле между I и II доменами α1-субъединиц Ca_V2-каналов при необходимом участии β-субъединицы [85, 86].

G_βγ-опосредованное ингибирование Ca_V2 является потенциал-зависимым, поскольку его влияние на работу Сa²⁺-каналов может быть значительно снижено при сильной и/или повторяющейся деполяризации мембраны, что вызывает уход G_βγ-субъединиц от Сa_V [85]. В НМС млекопитающих такой способ регуляции активности триггерных Сa²⁺-каналов P/Q-типа принципиально может функционировать в случае активации и запуска сигнальных путей со стороны пресинаптических метаботропных G_i-белок-сцепленных аденозиновых А₁- и А₃-рецепторов [87, 88], пуриновых P2Y13-рецепторов [89, 90] и мускариновых M2-рецепторов [91].

Регуляция Ca²⁺-каналов P/Q-типа в нервных терминалях: пресинаптические ферменты

Существует еще один возможный способ модулирования активности в НМС Сa²⁺-каналов P/Q-типа – за счет их фосфорилирования различными Сa²⁺-зависимыми и Сa²⁺-независимыми протеинкиназами, как это показано для ряда центральных синапсов и в гетерологичных экспрессирующих системах [92]. Среди потенциальных кандидатов, способных оказывать влияние на работу P/Q-типа Сa²⁺-каналов, можно рассматривать цАМФ-зависимую протеинкиназу А (PKA), различные пресинаптические изоформы PKC и CaMKII.

В зависимости от результата альтернативного сплайсинга получающиеся белковые продукты α1A-субъединицы Ca_V2.1 могут дифференцированно фосфорилироваться PKA или PKC [93]. В ЦНС активация G_s-белок-сцепленных рецепторов, стимулирующих аденилатциклазу и PKA, обеспечивает усиление Сa_V2.1-опосредуемых Сa²⁺-токов [94]. Предполагается, что PKA может модулировать активность Ca_V2.1 не напрямую, а противодействуя негативному влиянию на канал мембранного фосфатидилинозитол-4,5-бифоcфата, сдвигающего потенциал-зависимость активации Ca_V2.1 в сторону более деполяризованного МП [95, 96]. Активация PKC может приводить к фосфорилированию G_βγ-связывающего сайта в I-II линкерном участке Сa_V2.1, противодействуя таким образом G-белок-опосредованному торможению Сa²⁺-каналов [97]. В НМС крысы активация PKA и PKC и последующее потенцирование одиночной вызванной секреции квантов АХ зависит от функционирования P/Q-типа Сa²⁺-каналов. Это позволяет рассматривать Сa_V2.1-каналы как возможную мишень, обеспечивающую регуляторное действие этих протеинкиназ на секрецию АХ в НМС млекопитающих [98].

Согласно данным, полученным при экспрессии Сa_V2.1 в клеточных линиях и их активности в нервных терминалях пирамидальных нейронов гиппокампа, потенцировать работу этого типа Сa²⁺-каналов, замедляя развитие их потенциал-зависимой инактивации, способна СаMKII. Причем оказалось, что модулирующая роль CaMKII обеспечивается самой ее посадкой на C-конец α1-субъединиц Сa_V2.1, а не ее каталитической активностью [79]. Связывание CaMKII c Сa_V2.1 обеспечивает усиление активности самой CaMKII за счет увеличения ее аутофосфорилирования Сa²⁺-независимым способом [99]. Такая связанная с Сa_V2.1 CaMKII способна фосфорилировать синапсины, снижая уровень связи синаптических везикул в резервном или рециклирующем пулах с актиновым цитоскелетом, что способствует восполнению RRP при высокочастотной и/или длительной активности синапсов [100].

Пресинаптические Ca²⁺-каналы P/Q-типа и создание в активных зонах Ca²⁺-доменов

Срабатывание в течение определенного (обычно короткого) промежутка времени Сa²⁺-входа вызывает появление в цитоплазме нервной терминали локализованного и достаточно короткоживущего увеличения концентрации ионов Сa²⁺ – Сa²⁺-домена.

Пресинаптические Сa²⁺-домены можно разделить на два типа. Первый – нанодомен, своеобразная «струя» ионов Сa²⁺ в высокой концентрации, возникающая в цитоплазме в результате открытия одиночного Сa²⁺-канала (или иного источника ионов Сa²⁺ в нервной терминали). Нанодомен возникает и прекращается практически мгновенно при открытии и закрытии Сa²⁺-канала (микросекунды) и имеет достаточно однородный концентрационный профиль c центром в устье канала. Данные Сa²⁺-имиджинга свидетельствуют, что концентрация ионов Сa²⁺ в таком нанодомене может достигать сотен микромолей [101], но только в нескольких десятках нм от устья Сa²⁺-канала, а на бóльших расстояниях – резко снижается до 1 мкМ [102].

Второй тип Сa²⁺-домена – микродомен – может возникать в результате перекрывания отдельных нанодоменов кластера открывающихся вблизи друг от друга Сa²⁺-входов. Данный Сa²⁺-сигнал – его размер, продолжительность существования и концентрационный профиль – достаточно вариабелен, поскольку будет определяться количеством Сa²⁺-каналов в их кластере и их взаимном пространственном расположении, а также флуктуациями их перехода из открытого состояния в закрытое [103, 104].

Таким образом, когда быстрый запуск секреции медиатора осуществляется с использованием нанодомена, необходимо расположение одного (или небольшого количества) Сa²⁺-входов в непосредственной близости от синаптической везикулы (на расстоянии порядка 10–20 нм) – тогда везикула будет практически «омываться» входящим потоком ионов Сa²⁺. Разобщить такой Сa²⁺-сигнал способен только Сa²⁺-буфер с быстрой кинетикой связывания ионов Ca²⁺ – 1,2-бис(2-аминофенокси) этан-N,N,N',N'-тетрауксусная кислота (BAPTA) [46, 105, 106]. При формировании Сa²⁺-микродомена, когда расстояние от источников ионов Сa²⁺ до готовых к выбросу синаптических везикул превышает 20 нм (100 нм – 1 мкм), необходимо срабатывание большего числа Сa²⁺-каналов и подъем концентрации ионов Сa²⁺, при котором возможен запуск экзоцитоза более удаленных везикул. При этом не только BAPTA, но и Сa²⁺-буфер с более медленной кинетикой связывания ионов Сa²⁺ – этиленгликоль-бис(β-аминоэтил)-N, N, N', N'-тетрауксусная кислота (EGTA) – способен эффективно конкурировать с везикулярными синаптотагминами за свободные ионы Сa²⁺ [3, 103, 107]. Исследование сопряжения Сa²⁺-сигнала в районе активных зон и секреции нейротранмиттера в разных синапсах показало, что имеет место континуум разных расстояний и геометрии расположения Сa²⁺-входов по отношению к синаптическим везикулам как в отдельных синапсах, так иногда и в пределах одного синапса [108–111].

В настоящий момент считается, что сопряжение входа ионов Сa²⁺ через P/Q-тип Сa²⁺-каналов и синаптотагмина в НМС млекопитающих – очень тесное, то есть обеспечивается Сa²⁺-нанодоменом протяженностью порядка 20 нм [29, 43, 44].

В отличие от НМС лягушки, где количество триггерных Сa_V2.2 на везикулу, докированную в активной зоне, не превышает 2, в НМС млекопитающих это соотношение может достигать 4 [44, 112]. Кроме того, в НМС млекопитающих Сa²⁺-каналы теснее сопряжены пространственно с синаптическими везикулами, что, по всей видимости, обеспечивает более высокую вероятность выброса АХ и меняющийся характер синаптической пластичности при ритмической активности в НМС млекопитающих по сравнению с таковыми у холоднокровных. При этом в НМС млекопитающих, несмотря на высокое количество мест, откуда может осуществляться экзоцитоз синаптических везикул (500–900 активных зон, каждая содержит две везикулы – итого около 1000–1800 потенциальных мест выброса АХ), квантовый состав постсинаптических потенциалов концевой пластинки (ПКП) составляет всего от 20 до 80, в зависимости от экспериментальных процедур, используемых при регистрации и анализе данных электрофизиологических сигналов. Это свидетельствует о низкой вероятности выброса квантов АХ (порядка 3–5% на везикулу).

Гетерогенность Ca²⁺-зависимости вероятности выброса синаптических везикул и ее связь с локализацией пресинаптических Ca²⁺-каналов P/Q-типа

Биномиальный анализ секреции АХ в НМС мыши показал, что вероятность выброса квантов АХ достаточно высока (около 0.9), однако число мест секреции оказалось довольно низким (около 70) [113]. Это резко противоречит вышеприведенным данным о количестве активных зон в моторной нервной терминали и числе синаптических везикул, потенциально готовых к выбросу в них, если не допускать, что значительное большинство активных зон в составе НМС «молчит», и лишь небольшое их количество (меньше 10–20%) принимает участие в вызванной приходом пресинаптического ПД быстрой квантовой секреции АХ. Такая гетерогенность вероятности выброса АХ между активными зонами может быть связана с разной чувствительностью машинерии экзоцитоза синаптических везикул к ионам Сa²⁺ в отдельных активных зонах, что, возможно, определяется разным положением Сa²⁺-входов (Сa²⁺-каналов P/Q-типа) по отношению к везикулам [114].

Косвенно о том, что вероятность выброса в НМС млекопитающих реально не приближена к 1, а гораздо ниже при небольшом числе функционирующих активных зон, говорят исследования кратковременной пластичности при высокочастотной ритмической активности НМС. Если секреция АХ осуществляется из небольшого числа активных зон с очень высокой вероятностью выброса, следует ожидать сильную кратковременную депрессию передачи по ходу залпа за счет преобладания истощения RRP над рекрутированием синаптических везикул из других пулов к активным зонам, что, однако, не наблюдается в экспериментах. Наоборот, при короткой высокочастотной активности моторных синапсов сначала наблюдается выраженное облегчение синаптической передачи, и затем следует депрессия [47, 106, 114]. Таким образом, либо вероятность выброса квантов АХ из каждой отдельной активной зоны очень низка, либо после первого стимула в коротком залпе последующие ПД приводят к экзоцитозу синаптических везикул из набора активных зон, отличных от задействованных в выбросе АХ при первом ПД в залпе (последнее нуждается в строгом экспериментальном подтверждении).

Выявленное в моторных терминалях млекопитающих значительное число отдельно расположенных и независимых друг от друга активных зон неизбежно порождает вопрос о гомогенности их секреторной активности для обеспечения надежной и достаточно эффективной нервно-мышечной передачи. Имеется ли и какова допустимая степень гетерогенности вероятности выброса квантов АХ между активными зонами в НМС? При использовании везикулярных оптических зондов слияния синаптических везикул в НМС мыши было установлено, что при высокочастотной активности моторных терминалей экзоцитоз синаптических везикул по ходу ритмического залпа начинает преимущественно происходить в определенных кластерах активных зон, названных «горячими точками» [115–117]. Такие данные свидетельствуют в пользу того, что выброс АХ в моторной нервной терминали при физиологических режимах ее работы может преимущественно осуществляться в определенном наборе активных зон, где происходит повышенное рекрутирование резервных везикул, в то время как оставшаяся часть активных зон остается функционально «молчащей» [44, 47, 118].

Число мест в моторной нервной терминали, где происходит вызванная пресинаптическими ПД секреция АХ, зависит от частоты стимуляции терминали [115]. Более того, оценка размера RRP – общего числа докированных везикул, содержимое которых может выбрасываться при ритмической активности НМС, выявила зависимость этого параметра от частоты стимуляции [43, 47, 118]. Это также свидетельствует в пользу того, что в НМС млекопитающих, видимо, существуют «молчащие» активные зоны, часть из которых вовлекается в секрецию АХ при переходе от одиночной или низкочастотной активности к высокочастотной. Такое вовлечение недавно было показано в НМС дрозофилы [119].

Таким образом, с функциональной точки зрения НМС млекопитающих представляет собой большой, одиночный и самое главное надежный в плане обеспечения передачи сигнала синаптический контакт, построенный из сотен «ненадежных» активных зон с преимущественно низкой вероятностью выброса АХ [29, 48, 105]. Низкая вероятность выброса АХ обеспечивает надежность синаптической передачи во время ритмической активности НМС, поскольку в этом случае активные зоны не вовлекаются в секрецию слишком часто, предотвращая развитие мощной депрессии нервно-мышечной передачи за счет быстрого массированного истощения RRP, не компенсируемого восполнением за счет рекрутирования резервных синаптических везикул. Активно обсуждается вопрос – в чем причина такой низкой вероятности секреции медиатора в отдельных активных зонах НМС млекопитающих?

Количество триггерных Ca_V2.1 в активных зонах НМС млекопитающих невелико, а вероятность их открытия, зависящая от пространственно-временных характеристик деполяризации пресинаптической мембраны, создаваемой коротким (~1 мс) пресинаптическим ПД, также, скорее всего, низка – около 0.2 [46, 64]. Об этом свидетельствуют как данные о вероятности открытия триггерных Сa²⁺-входов в ответ на пресинаптический ПД в НМС лягушки [120] и в синапсе Сalyx of Held [121], так и моделирование динамики квантовой секреции АХ в НМС мыши с учетом особенности архитектуры и взаиморасположения его активных зон [29, 122].

Таким образом, в ответ на генерацию пресинаптического ПД в каждой отдельной активной зоне возможно открытие одного (или совсем небольшого) числа потенциал-зависимых Сa²⁺-каналов, способных обеспечить вход ионов Сa²⁺, достаточный для запуска слияния синаптической везикулы с пресинаптической мембраной. Однако реальные случаи экзоцитоза (исходя из вышеописанных условий срабатывания Сa²⁺-каналов и взаимодействия Сa²⁺-сигнала с синаптической везикулой) будут возникать с очень низкой вероятностью.

ПОТЕНЦИАЛ-ЗАВИСИМЫЕ Ca²⁺-КАНАЛЫ N- И R-ТИПОВ (Сa_V2.2 И Ca_V2.3) И ИХ РОЛЬ В МОТОРНЫХ НЕРВНЫХ ТЕРМИНАЛЯХ

P/Q-тип Са²⁺-каналов – ключевой, но отнюдь не единственный потенциал-зависимый Са²⁺-вход в моторных нервных терминалях млекопитающих.

В неонатальных НМС крыс и мышей показано, что наряду с Ca_V2.1, блокируемыми ω-агатоксином IVA, экспрессируется и принимает участие в запуске выброса АХ и блокируемый ω-конотоксином GVIA N-тип Са²⁺-каналов (Ca_V2.2), хотя сопряжение этого Са²⁺-входа с секрецией АХ было слабее, чем у Ca_V2.1. Это связывают с более удаленным расположением Ca_V2.2 от синаптических везикул [123–126].

Что касается зрелых НМС, то долгое время считалось, что там вклад в регуляцию секреции АХ Са²⁺-каналов, отличных от Сa_V2.1, проявляется либо при особых экспериментальных условиях, либо при патологиях, затрагивающих Сa_V2.1 [28]. Генетическая элиминация каналов Сa_V2.1 у мышей вызывала быстро прогрессирующие неврологические синдромы, приводящие к утрате способности передвигаться и гибели животных на самых ранних этапах постнатального развития. При этом возможность нервно-мышечной передачи сохранялась, однако в электрофизиологических экспериментах в моторных синапсах у таких мышей отмечались сильные нарушения быстрой мультиквантовой синхронной секреции АХ и кратковременной пластичности – сниженный по сравнению с диким типом квантовый состав ПКП, увеличенная вариабельность задержек синаптической передачи (что свидетельствует о десинхронизации выброса АХ) и угнетение парной фасилитации. Функции отсутствующего P/Q-типа Са²⁺-каналов в таких случаях берут на себя Са²⁺-каналы N- и R-типов, но полностью компенсировать тотальную утрату основного триггерного Са²⁺-входа эти типы Са²⁺-каналов не могут [61, 127]. Подобные компенсаторные подключения к контролю секреции АХ Са²⁺-каналов N- и R-типов в НМС млекопитающих отмечены и при определенных мутациях, затрагивающих как каналообразующую α1A-субъединицу Са²⁺-каналов P/Q-типа [18, 20], так и регуляторную β-субъединицу [59].

В последнее время появляются экспериментальные данные, свидетельствующие об участии N- и R-типов Са²⁺-каналов в регуляции как спонтанной, так и вызванной квантовой секреции АХ в нормальных зрелых НМС млекопитающих, обеспечивая там определенный уровень синхронизации выброса нейротрансмиттера [128].

Кроме того, в моторных нервных терминалях млекопитающих, наряду с N- и R-типами потенциал-зависимых Са²⁺-каналов, показана экспрессия и Са²⁺-каналов L-типа [19].

НЕЙРОНАЛЬНЫЕ ПОТЕНЦИАЛ-ЗАВИСИМЫЕ Ca²⁺-КАНАЛЫ L-ТИПА (Сa_V1.2 И Сa_V1.3) И ИХ СВОЙСТВА

Семейство Са²⁺-каналов L-типа в настоящее время включает в себя 4 подтипа (Сa_V1.1–1.4), имеющих около 70% идентичности каналообразующих α1S-F субъединиц. Представители данного семейства были первоначально названы Са²⁺-каналами L-типа по результатам ранних исследований на кардиомиоцитах и нейронах – благодаря опосредуемым этими Са²⁺-каналами при деполяризации мембраны долго длящимся входящим Са²⁺-токам с медленной кинетикой спада (long-lasting), что позволило отделить их от короткоживущих (transient) Ca²⁺-токов через Ca_V3 [129, 130].

Особенностью L-типа Са²⁺-каналов, отличающей его от всех остальных Са²⁺-каналов, является его чувствительность к органическим модуляторам (преимущественно блокаторам) трех химически различающихся видов: дигидропиридинам, фенилалкиламинам и бензотиазепинам. Данные соединения, такие как соответственно нитрендипин, верапамил и дилтиазем, а также их многочисленные структурные аналоги не только являются излюбленным фармакологическим инструментом для работы с данными Са²⁺-каналами (и опосредуемыми ими Са²⁺-токами) in vitro, но и широко используются много лет в терапии сердечно-сосудистых заболеваний [23, 131]. Выделение, гомологичное клонирование и исследование биохимических характеристик субъединиц Ca_V1 показало, что в скелетных мышцах экспрессируется изоформа α1-субъединицы Ca_V1.1, кодируемая геном CACNA1S. В нейронах, кардиомиоцитах, хромаффинных клетках надпочечников были выявлены другие изоформы α1-субъединицы – Ca_V1.2 (CACNA1C) и Ca_V1.3 (CACNA1D). В сетчатке выявлена экспрессия отдельной изоформы α1-субъединицы – Ca_V1.4 (CACNA1F) [132], которая, обладая ограниченной инактивацией, обеспечивает постоянную работу Са²⁺-канала и поддерживает пролонгированную секрецию глутамата в ленточных синапсах фоторецепторов.

Все 4 подтипа Сa_V1 обладают сходной чувствительностью к фармакологическим агентам – до сих пор отсутствуют изоформ-специфические модуляторы их активности [133, 134]. При этом подтипы Сa_V1 различаются по представленности в тканях и биофизическим характеристикам. Сa_V1.1 и Сa_V1.4 имеют очень ограниченный паттерн экспрессии – скелетные мышечные волокна и сетчатка соответственно. Сa_V1.2 и/или Сa_V1.3 экспрессируются в большинстве электровозбудимых клеток и часто – совместно в одних и тех же клетках. Обе эти изоформы каналов необходимы для нормального функционирования мозга и играют каждый определенную роль в сердечно-сосудистой и эндокринной системах [10, 21].

Несмотря на высокую степень структурного сходства их каналообразующих α1-субъединиц и чувствительности к блокаторам, изоформы Сa_V1.2 и Сa_V1.3 различаются по особенностям работы воротного механизма образуемых ими Са²⁺-каналов L-типа, вовлеченности в различные белок-белковые регуляторные взаимодействия и по механизмам тонкой настройки их работы в результате альтернативного сплайсинга [10, 133]. Так, нейрональные каналы Ca_V1.3 активируются при более высоких (негативных) значениях МП (на 9–25 мВ) и медленнее инактивируются, чем Сa_V1.2 [135–137].

Инактивация Са²⁺-каналов L-типа – важнейший процесс, необходимый для тонкого регулирования входа ионов Са²⁺ в клетку. Специфической особенностью инактивации Са²⁺-каналов L-типа является ее очень медленная кинетика, приводящая к пролонгированному снижению Са²⁺-тока в ответ на деполяризацию мембраны. Инактивация Са²⁺-каналов L-типа может обеспечиваться за счет функционирования нескольких механизмов.

Потенциал-зависимая инактивация («в чистом виде» ее исследуют при экспрессии Ca²⁺-каналов L-типа в клеточных системах и замене Сa²⁺ на Ba²⁺) включает в себя несколько процессов с разной кинетикой развития и участием нескольких сайтов в составе α1-субъединиц Сa_V1.2 и Ca_V1.3. Это цитозольные концы S6-сегментов, N- и С-концы, участок линкерной петли между доменами II и III, а также линкерная петля между I и II доменами, служащая инактивационной створкой [138–140]. Наряду с потенциал-зависимой инактивацией, у каналов, образованных Ca_V1.2 и Ca_V1.3 (так же, как и у Ca_V2.1), ярко выражена CDI [139].

CDI Ca²⁺-каналов L-типа реализуется за счет конформационных перестроек, затрагивающих многие участки каналообразующих α1-субъединиц при взаимодействии определенных аминокислотных мотивов их С-концов с CaM, который служит Ca²⁺-сенсором [141–143]. Наличие CDI у L-типа Ca²⁺-каналов обеспечивает таким образом тонкий ауторегуляторный механизм лимитирования входа ионов Ca²⁺ по этим каналам [144].

Ca²⁺-каналы L-типа располагают еще одним Ca²⁺-зависимым механизмом регуляции – CDF. СDF проявляется в увеличении вероятности нахождения Ca²⁺-каналов L-типа в открытом состоянии при продолжительной или повторяющейся активности. Данное усиление Ca²⁺-входа реализуется с участием CaM и CaMKII [145–147].

Управление воротным механизмом (как активации, так и инактивации) каналов, образованных Сa_V1.2 и Сa_V1.3, контролируется белок-белковыми взаимодействиями между участками С-конца канала [143]. При этом конкретные электрофизиологические характеристики Ca²⁺-токов L-типа в местах их функционирования в значительной степени будут определяться тканеспецифическим альтернативным сплайсингом, затрагивающим в результате многие важные структурные компоненты α1-субъединицы, участвующие как в активации и инактивации каналов, так и в различных механизмах регуляции этих процессов [148, 149].

Важную регулирующую роль, определяющую характеристики Ca²⁺-токов и Ca²⁺-сигналов, обеспечиваемых Сa_V1.2 и Сa_V1.3-каналами, будут играть изоформы дополнительных субъединиц этих каналов – β и α2-δ [150, 151].

Ca²⁺-индуцированные физические взаимодействия между С-концами α1-субъединиц Ca²⁺-каналов L-типа, кластрированных в непосредственной близости друг от друга, потенцируют вход ионов Ca²⁺ за счет увеличения активности соседних каналов, усиливая кооперативным образом Ca²⁺-сигнал в возбудимых клетках [152].

Таким образом, вход ионов Ca²⁺ через нейрональные Ca²⁺-каналы L-типа может регулироваться с использованием сигнальных механизмов, устроенных по принципу прямой и обратной связи.

Потенциал-зависимые Ca²⁺-каналы L-типа в пост- и пресинаптических структурах синапсов ЦНС

Каналы Сa_V1.2 и Сa_V1.3 широко экспрессируются в мозге. Для обеих изоформ характерна преимущественная постсинаптическая дифференцированная сомато-дендритная локализация, где этот Ca²⁺-вход является основополагающим для запуска электро-транскрипционного сопряжения с участием CaM, CaMKII и митоген-активируемых протеинкиназ [153–155]. Электро-транскрипционное сопряжение с ключевым участием именно Ca²⁺-каналов L-типа в постсинаптических структурах дендритов и сомы нейронов трансформирует паттерны синаптической активности в ремоделирование нейронов и их участков. Данный процесс лежит в основе нейронального развития, обучения, формирования разных типов памяти и привыкания к лекарственным и наркотическим веществам [10, 156]. Регуляция транскрипционной активности обеспечивается за счет формирования на С-конце α1-субъединицы Ca²⁺-каналов L-типа мультимолекулярного сигнального комплекса, включающего якорные и каркасные белки цитоскелета, например, AKAP (А-kinase anchoring protein), а также ферменты, участвующие в сигнальных каскадах, такие как PKA и кальцинейрин (СaN), модулирующие входящий Ca²⁺-ток по этим каналам [154, 157, 158].

Хорошо известно участие постсинаптических Ca²⁺-каналов L-типа в индукции, экспрессии и поддержании различных форм синаптической пластичности [159–161] и регуляторного контроля спайковой и осцилляторной активности нейронов в разных отделах ЦНС [162–164].

Долгое время считалось, что в синапсах ЦНС, где доминируют быстрые Ca²⁺-каналы P/Q- и N-типов, на пресинаптическоой мембране Ca²⁺-каналы L-типа или практически отсутствуют [165], или, за редким исключением [9, 166], не участвуют в запуске секреции нейротрансмиттеров (в ходе базальной активности) [2, 167]. Однако за последние 10–15 лет постепенно появляются свидетельства как о присутствии разных изоформ Ca²⁺-каналов L-типа в нервных терминалях синапсов ЦНС [168, 169], так и о вовлечении этих каналов в реализацию разных форм пластичности во многих синапсах ЦНС именно на пресинаптическом уровне (в нормальных условиях и при патологиях) [170–172].

Тем удивительнее выглядят накопленные в литературе за последние десятилетия данные о присутствии и активности Ca²⁺-каналов L-типа в НМС и их способности эффективно и специфически регулировать секрецию АХ при определенных функциональных состояниях и режимах активности синапсов.

Потенциал-зависимые Ca²⁺-каналы L-типа (Сa_V1.2 и Сa_V1.3) в нервных терминалях НМС млекопитающих

Исследование L-типа Ca²⁺-каналов в НМС млекопитающих и их возможный вклад в регуляцию секреции АХ продолжается с конца 80-х годов XX века. Оно началось с использования в качестве агониста (активатора) этих каналов дигидропиридина S(-) Bay K8644, который в субмикромолярных концентрациях вызывал увеличение амплитуды и квантового состава одиночных многоквантовых ПКП в диафрагмальных синапсах крысы и мыши, что предотвращалось или реверсировалось блокатором L-типа Ca²⁺-каналов нимодипином, который сам не оказывал влияния на вызванную секрецию АХ [173].

Экспрессия L-типа Ca²⁺-каналов в НМС млекопитающих показана не только с помощью фармакологических воздействий в сочетании с электрофизиологией, но и с использованием иммуногистохимических методов. В 2004 г. было представлено первое безусловное доказательство наличия в НМС млекопитающих – и в здоровых зрелых нервных терминалях, и в НМС мышей с нокаутом Сa_V2.1 – α1D-субъединицы (Сa_V1.3), но не α1С-субъединиц (Ca_V1.2) [19]. В более поздней работе на диафрагме крыс была выявлена экспрессия и α1С-субъединицы (Ca_V1.2), причем значительная только у новорожденных и уменьшающаяся в ходе постнатального онтогенеза [174]. Выраженная экспрессия α1D-субъединицы (Сa_V1.3) обнаружена и в созревающих, и в зрелых НМС мыши [175]. Использованные иммуногистохимические методы, конечно, не дают ответа на вопрос о точной локализации Ca²⁺-каналов L-типа по отношению к активным зонам.

Учитывая низкий порог активации нейрональных изоформ, особенно у Сa_V1.3, и то, что эти каналы могут находиться в открытом состоянии дольше, чем триггерные Ca²⁺-каналы P/Q-типа, можно было бы ожидать появления опосредуемого Ca²⁺-каналами L-типа выраженного Ca²⁺-сигнала при деполяризации моторных терминалей, потенциально способного влиять на секрецию квантов АХ. С таким предположением согласуются ранние данные электрофизиологических экспериментов о вовлечении L-типа Ca²⁺-каналов в обеспечение уровня спонтанной секреции квантов АХ в НМС крысы. Нифедипин (дигидропиридиновый блокатор L-типа Ca²⁺-каналов) вызывал уменьшение частоты миниатюрных потенциалов концевой пластинки при нормальных внеклеточных концентрациях ионов K⁺ и Са²⁺, но не в условиях K⁺-деполяризации [176]. Предполагается, что вклад L-типа Ca²⁺-каналов (наряду с другими типами Ca²⁺-каналов) в поддержание уровня именно спонтанной секреции обеспечивается за счет возможности их стохастического открывания при значениях МП около ПП [128].

При этом уже пионерские работы постулировали, во-первых, неучастие пресинаптических Ca²⁺-каналов L-типа в регуляции вызванной квантовой секреции АХ в нормальных условиях [177, 178] и, во-вторых, наличие принципиальной способности у этого Ca²⁺-входа при его принудительной прямой активации потенцировать выброс АХ в НМС млекопитающих [173, 179]. «Замаскированность» Ca²⁺-каналов L-типа и отсутствие вовлеченности этого Ca²⁺-входа в регуляцию вызванного выброса АХ в НМС млекопитающих как при их одиночной, так кратковременной ритмичной стимуляции многократно подтверждались во многих дальнейших экспериментах разными научными коллективами, в том числе и нами [128, 174, 180, 181]. Нужно отметить, что в последнее время начинает рассматриваться мнение об относительно слабом участии Ca²⁺-каналов L-типа в работе НМС млекопитающих в нормальных условиях [182], что никак не оспаривает доминирующую триггерную роль каналов Ca_V2.1 в индукции экзоцитоза синаптических везикул, вызванного деполяризацией мембраны.

Ca²⁺-каналы L-типа в нервных терминалях развивающихся, новообразованных при реиннервации и находящихся в патологических условиях моторных синапсов

Эксперименты на развивающихся и новообразованных НМС, формирующихся на мышечных волокнах в ходе их реиннервации, показали, что в нервных терминалях таких нервно-мышечных контактов, во-первых, имеет место активация L-типа Ca²⁺-каналов, а во-вторых, их вовлечение и в регуляцию секреции АХ, и в проведение ПД в таких моторных терминалях [183]. Однако данные о роли Ca²⁺-каналов L-типа в регуляции секреции АХ в развивающихся и новообразованных синапсах неоднозначны. Отмечается как отсутствие влияния L-типа Ca²⁺-каналов на секрецию АХ в таких синапсах [184], так и возможный позитивный вклад этого Ca²⁺-входа в функционирование незрелых моторных синапсов [183, 185]. Описано и негативное воздействие активности L-типа Ca²⁺-каналов, тормозящее вызванную квантовую секрецию АХ [125, 186, 187], или десинхронизирующее ее (в условиях сниженной по сравнению с нормой внеклеточной концентрации ионов Ca²⁺) [174]. Последний способ – уменьшение пресинаптического триггерного входа ионов Ca²⁺ за счет уменьшения их наружной концентрации или частичного блокирования Сa²⁺-каналов P/Q-типа, а также угнетение опосредуемого этими каналами инициирующего быструю синхронную секрецию квантов АХ Сa²⁺-сигнала за счет загрузки в нервные терминали «быстрого» Ca²⁺-буфера в сочетании с ингибированием фосфатазы PP1 позволило выявить, во-первых, появление в таких условиях периневрального Са²⁺-тока, опосредуемого L-типом Са²⁺-каналов [188], а во вторых, демаскировать этот обычно «молчащий» Са²⁺-вход, зарегистрировав его участие в обеспечении квантовой секреции АХ в зрелых НМС млекопитающих [189].

Снижение опосредованного P/Q-типом Са²⁺-каналов входа ионов Са²⁺, наблюдаемое при экспериментальном моделировании развития синдрома Ламберта – Итона, также приводило к появлению в моторных нервных терминалях компоненты пресинаптических Са²⁺-токов, опосредуемых L-типом Са²⁺-каналов, и выявило их вовлечение в регуляцию квантовой секреции АХ [190, 191]. Аналогичная картина наблюдается при экспериментальном снижении внеклеточной концентрации ионов Ca²⁺, в этих условиях вовлечение L-типа Са²⁺-каналов в поддержание квантовой секреции АХ сопровождается ее десинхронизацией [192].

Таким образом, совокупность современных данных о последствиях подавления основного (по P/Q-типу Са²⁺-каналов) Са²⁺-входа в моторные нервные терминали свидетельствует о том, что при нормальном функционировании НМС млекопитающих (в нормокальциевой наружной среде) и сохраняющейся активности триггерных Са²⁺-каналов P/Q-типа пресинаптические Са²⁺-каналы L-типа, хотя и потенциально способны обеспечивать массированный вход ионов Са²⁺ в моторную нервную терминаль млекопитающих, тем не менее не активны – по крайней мере, в отношении их вклада в Са²⁺-зависимую регуляцию синхронной многоквантовой секреции АХ. Это неизбежно вызывает вопрос об их физиологическом назначении в нормально функционирующих НМС.

Регуляция активности Ca²⁺-каналов L-типа в моторных синапсах млекопитающих

Отсутствие проявлений регуляторных влияний L-типа Са²⁺-каналов на Са²⁺-зависимую вызванную секрецию АХ у здоровых и зрелых НМС млекопитающих инициировало поиск факторов и сигнальных путей как подавляющих там эти каналы и препятствующих их участию в контроле над секрецией АХ, так и способствующих вовлечению этого Са²⁺-входа в регуляцию нервно-мышечной передачи. В настоящее время таких факторов насчитывается несколько.

В моторных синапсах мыши Са²⁺-активируемые K⁺-каналы высокой проводимости (ВK-каналы) находятся в непосредственной близости от триггерных Са²⁺-каналов P/Q-типа (входят в Са²⁺-нанодомен) в составе белкового кластера активных зон [112]. Такой вывод был сделан в результате загрузки терминалей Са²⁺-буфером с быстрой кинетикой связывания ионов Са²⁺ – BAPTA. В присутствии ВАРТA не наблюдалось активации K⁺-тока, опосредуемого BK-каналами: блокаторы BK-каналов на фоне ВАРТА теряли способность вызывать облегчение секреции АХ [193]. Принято считать, что активация BK-каналов входящим в терминаль Са²⁺-током во время нервного импульса, вызывая гиперполяризацию мембраны, ограничивает дальнейшее поступление ионов Са²⁺ по потенциал-зависимым Са²⁺-каналам по механизму отрицательной обратной связи [43]. Действительно, блокирование BK-каналов в НМС мыши сопровождается увеличением выброса АХ как в ответ на одиночный ПД [180], так и (в наших экспериментах) при короткой ритмической стимуляции [194, 195]. Важно, что такое потенцирование вызванной секреции АХ полностью предотвращалось предварительным блокированием L-типа Са²⁺-каналов. Таким образом, роль BK-каналов в активных зонах моторных нервных терминалей предназначена не для ограничения входящего Са²⁺-тока по триггерным каналам P/Q-типа, как считалось ранее, а в удержании в «молчащем» состоянии Са²⁺-каналов L-типа. Механизм негативного влияния со стороны BK-каналов на Са²⁺-каналы L-типа in vivo может быть связан с более медленной кинетикой активации этих каналов по сравнению с Са²⁺-каналами P/Q-типа [196] и, следовательно, зависимостью их активации от длительности пресинаптического ПД. Мы с уверенностью предполагаем, что в моторных синапсах млекопитающих существует взаимосвязь между активностью двух потенциал-управляемых Са²⁺-входов терминалей – через P/Q- и L-типы Са²⁺-каналов, осуществляемая с участием BK-каналов. Вход Са²⁺ через P/Q-тип Са²⁺-каналов под действием пресинаптического ПД активирует BK-каналы. В свою очередь, их срабатывание предназначено для одновременного подавления активности L-типа Са²⁺-каналов. По-видимому, этот тип Са²⁺-каналов играет роль резервного (страховочного) Са²⁺-входа, необходимого для поддержания секреции АХ в условиях ослабления триггерного Са²⁺-входа (Са²⁺-каналы P/Q-типа). Выдвинутые нами представления подтверждаются и данными литературы, поскольку в случаях существенного ослабления активности P/Q-типа Са²⁺-каналов в моторных терминалях мыши при миастенических синдромах [191] либо при длительной и интенсивной активности НМС [197] наблюдается компенсаторное растормаживание L-типа Са²⁺-каналов.

Помимо BK-каналов, длительность ПД в моторных нервных терминалях, а значит, и возможность активации Са²⁺-каналов L-типа может контролироваться пресинаптическими потенциал-зависимыми K⁺-каналами преимущественно K_V3-типа, опосредующими калиевый А-ток. Присутствие этих каналов в моторных терминалях и их функциональная активность давно выявлены в многочисленных исследованиях с использованием аминопиридинов в качестве селективных блокаторов этого типа K⁺-каналов [198, 199]. Блокаторы K_V3-каналов 4-аминопиридин и 3,4-диаминопиридин, вызывающие увеличение квантовой секреции АХ в НМС, рассматриваются в настоящее время как компоненты терапии, поддерживающей сниженную нервно-мышечную передачу при синдроме Ламберта – Итона и ряде других неврологических расстройств [64, 200, 201]. Считается, что это действие аминопиридинов связано с увеличением вероятности выброса квантов АХ за счет потенцирования входа ионов Са²⁺ в моторную терминаль при снижении потенциал-зависимой K⁺-проводимости [179, 202]. Исследование возможного растормаживания именно L-типа Са²⁺-каналов под действием близких к миллимолярным концентрациям аминопиридинов привело к неожиданному результату – подверглась сомнению сама их способность блокировать развитие пресинаптических потенциал-зависимых K⁺-токов. Вместо этого в качестве нового механизма действия аминопиридинов предлагалось их прямое потенцирующее влияние на Са²⁺-каналы N- и L-типов [203], опосредуемое через взаимодействие c Сa_Vβ-субъединицей [204]. Такое непосредственное потенцирующее влияние аминопиридинов на активность дополнительных пресинаптических Са²⁺-входов и в особенности клиническое значение такого влияния в настоящее время подвергаются критике [199, 205]. Тем не менее наши исследования с использованием 4-аминопиридина показывают способность L-типа Са²⁺-каналов вовлекаться в контролирование Са²⁺-зависимой квантовой секреции АХ в моторных синапсах млекопитающих при манипуляциях с потенциал-зависимой K⁺-проводимостью [206].

Многочисленные данные свидетельствуют, что функционирование L-типа Са²⁺-каналов, как и других потенциал-зависимых Са²⁺-каналов в НМС млекопитающих, может находиться под сильным управляющим контролем со стороны сигнальных путей, запускаемых при активации многочисленных пресинаптических метаботропных рецепторов в работающих синапсах.

Анализ выделения меченного тритием АХ из моторных синапсов нервно-мышечного препарата, изменений флуоресценции липофильного красителя мембраны синаптических везикул (FM2-10) при стимуляции моторных синапсов и электрофизиологическая регистрация постсинаптических потенциалов концевой пластинки выявили, что Са²⁺-каналы L-типа в моторных синапсах млекопитающих подвержены разнонаправленным влияниям со стороны компонентов пуринергической системы. Активация пресинаптических аденозиновых А₁-рецепторов через торможение аденилатциклазы и фосфорилирующей активности PKA может приводить к ослаблению регуляторного фосфорилирования Са²⁺-каналов L-типа и торможению их функционирования. Это наблюдается при обычной залповой активности синапсов и образовании там соответствующих концентраций эндогенного аденозина [90, 207–210].

Пресинаптические мускариновые М2-рецепторы, преимущественно активируемые эндогенным АХ в моторных синапсах при их обычной работе, также могут оказывать аналогичное А₁-рецепторам тормозное влияние на L-тип Са²⁺-каналов [211–213].

Обсуждается комплексное взаимодействие пресинаптических мускариновых и аденозиновых рецепторов, направленное на тонкую регуляцию активности пресинаптических ферментов (PKA и PKC), способных потенциально менять функционирование пресинаптических Ca²⁺-входов или компонентов машинерии экзоцитоза, регулируя таким образом квантовую секрецию АХ в моторных синапсах млекопитающих [214, 215]. О возможности регулирования работы Са²⁺-каналов L-типа в таких условиях комплексного контроля со стороны метаботропных рецепторов в НМС говорит присутствие в моторных терминалях якорного белка AKAP150 [216], необходимого для расположения в непосредственной близости от потенциальной мишени регуляторного воздействия PKA и PKC и их функционального антагониста – фосфатазы кальцинейрина (CaN). Мы установили, что CaN играет значимую роль в поддержании Са²⁺-каналов L-типа в «молчащем» состоянии – равноценную таковой у BK-каналов и активностью метаботропных рецепторов [181, 195, 217].

Совсем недавно выявлено, что у метаботропных пуринорецепторов P2Y13, активируемых АТФ и в большей степени АДФ, присутствующих и негативно влияющих на квантовую секрецию АХ в НМС мыши [89, 90, 218], одной из мишеней являются Ca²⁺-каналы L-типа – при блокировании P2Y13 данный Ca²⁺-вход растормаживается, что приводит к характерному потенцированию вызванного выброса АХ [213].

Таким образом, в НМС млекопитающих L-тип Са²⁺-каналов находится под мощным и разнообразным по природе тормозным контролем, в основе которого лежат как Са²⁺-зависимые факторы (BK-каналы и CaN), так и продублированные петли обратной связи, запускаемые со стороны пресинаптических эндогенно активируемых метаботропных рецепторов основного нейротрансмиттера (M2) и дериватов котрансмиттера – АТФ (A₁ и P2Y13).

При этом не прекращаются поиски условий и механизмов, позволяющих превозмочь вышеописанный многоуровневый тормозной контроль и обеспечить вовлечение L-типа Са²⁺-каналов в регуляцию вызванного выброса АХ в НМС млекопитающих.

Выявлено, что при увеличении интенсивности и продолжительности синаптической активности (и возрастающей концентрации аденозина в синаптической щели) может происходить «растормаживание» L-типа Са²⁺-каналов [219]. Предполагается, что это реализуется вследствие сдвига баланса регуляторного действия аденозина от А₁-рецепторов в сторону преимущественной активации пресинаптических А_2А-рецепторов, стимулирующих аденилатциклазный сигнальный путь и облегчающих активацию L-типа Са²⁺-каналов [210, 220, 221]. Кроме того, показана возможность функционального взаимодействия G_q-белок-сцепленных мускариновых M1-рецепторов, стимулирующих активацию пресинаптической PKC, с А_2А-рецепторами в демаскировании L-типа Са²⁺-каналов [222].

Такой сдвиг баланса активности А₁/A_2A-рецепторов в сторону PKA-опосредованного усиления активности L-типа Са²⁺-каналов проявляется в моторных синапсах не только в норме как отражение изменений уровня аденозина в синаптической щели и его влияний на разные типы аденозиновых рецепторов, но может возникать в моторных синапсах и на модели бокового амиотрофического склероза в пресимптоматическую фазу [223, 224].

Мы обнаружили, что демаскирование L-типа Са²⁺-каналов с последующим усилением нервно-мышечной передачи может происходить в результате селективного функционирования необычного синаптического Ca²⁺-входа – ионотропных P2X7-рецепторов, активирующихся только АТФ в высоких концентрациях и обладающих значительной проводимостью для ионов Ca²⁺. Механизм такого функционального сопряжения двух Ca²⁺-входов обеспечивается активацией CaM и CaMKII за счет входа ионов Са²⁺ через P2X7-рецепторы, с последующим СаMKII-зависимым усилением активности L-типа Са²⁺-каналов [106, 225]. Активная СаMKII (наряду с PKA и PKC) требуется для проявления вовлечения L-типа Са²⁺-каналов в регуляцию квантовой секреции АХ в НМС млекопитающих [195].

Достаточно неожиданным, но мощным активатором пресинаптических Ca²⁺-каналов L-типа в моторных синапсах млекопитающих оказался анандамид. Этот эндоканнабиноид через CB1-рецепторы неканоническим образом, стимулируя PKA (а не снижая ее активность, как это обычно происходит в синапсах ЦНС), вызывал растормаживание именно Ca²⁺-каналов L-типа и потенцирование квантовой секреции АХ [226–228].

Итак, обычно «молчащий» пресинаптический Ca²⁺-вход через L-тип Ca²⁺-каналов находится под совокупным контролем целого ряда одновременно действующих как облегчающих, так и (обычно доминирующих) тормозных воздействий (рис. 1). Такая многокомпонентная регуляция Ca²⁺-входа через L-тип Ca²⁺-каналов сходна с ранее описанной сложной и неоднозначной метаболической зависимостью активности L-типа Ca²⁺-каналов и в других возбудимых клетках [229, 230].

Рис. 1. Схема разнонаправленных влияний в нервной терминали НМС млекопитающих, контролирующих вовлечение L-типа Са²⁺-каналов в регуляцию квантовой секреции АХ. Черные пунктирные стрелки – активирующие влияния. Отрезки с плоским концом – тормозные влияния. Красные стрелки – потоки ионов Cа²⁺. АС – аденилатциклаза.

Дублирование систем потенциальной негативной регуляции L-типа Ca²⁺-каналов, вероятнее всего, связано с тем, что может различаться пространственно-временной паттерн появления в синаптической щели каждого из эндогенных активаторов (АХ, АТФ, АДФ и аденозина) разных типов метаботропных рецепторов (соответственно M1-/M2-, P2Y13 и А₁/A_2A). Это позволяет создать в НМС комплексную и пролонгированную избирательную активацию сигнальных путей, функционирующих сходно либо параллельно (подавление PKA, активирование СaN), которые надежно препятствуют вовлечению Ca²⁺-каналов L-типа в регуляцию секреции АХ. При этом наличие регуляторных контуров не только для снижения активности аденилатциклазного сигнального каскада, но и подключение других сигнальных путей (за счет вероятной активации M1-, P2X7-, A_2A-, СB1-рецепторов) позволяет потенциально не только препятствовать, но и промотировать (при определенных условиях) вовлечение L-типа Ca²⁺-каналов в регуляцию секреции АХ в НМС. Контуры обратной связи для регуляции секреции нейротрансмиттеров с участием пресинаптических ауторецепторов хорошо известны и в синапсах ЦНС. Однако там они, как правило, обеспечивают тонкую настройку основного Са²⁺-входа и функционирования ансамбля белков, обеспечивающего экзоцитоз синаптических везикул. В моторных терминалях аналогичные контуры, как выяснилось, могут быть нацелены на контроль не только и не столько триггерного Сa²⁺-входа, сколько на отслеживание активности дополнительного Са²⁺-входа обычно «молчащих» Са²⁺-каналов L-типа. Низкий порог активации этих Са²⁺-каналов и их пролонгированная Са²⁺-проводимость делает их принципиально легко вовлекаемыми в регуляцию работы нервных терминалей НМС. Именно поэтому, видимо, существуют множественные механизмы удерживания этих каналов от их активного включения в контролирование вызванной квантовой секреции АХ при нормальной работе НМС. В то же время предусмотренное «аварийно включение» именно L-типа Са²⁺-каналов в случае ослабления триггерного Са²⁺-входа, сопровождающегося дефицитом секреции АХ и нервно-мышечной передачи, призвано поддержать секрецию АХ, причем, как оказалось, по собственным механизмам, не имеющим места при обычном функционировании выброса квантов АХ, запускаемого за счет входа ионов Са²⁺ по триггерному P/Q-типу Са²⁺- каналов.

Особенности механизмов потенцирования квантовой секреции АХ в моторных синапсах млекопитающих при демаскировании Ca²⁺-каналов L-типа

Влияние Ca²⁺-каналов L-типа на секрецию АХ при их демаскировании вышеописанными способами во время не одиночной, а более физиологически характерной для НМС ритмической вызванной активности имеет особый характер – единообразный симметричный прирост амплитуд и квантового состава ПКП по всему ходу короткого ритмического залпа [181, 225, 227]. При этом сохраняется неизменной выраженность всех трех фаз изменений амплитуд в залпе ПКП (начальное облегчение, депрессия и плато). Проведенный нами анализ с использованием последовательной модели [47] выявил, что такое характерное усиление секреции АХ при растормаживании Ca²⁺-каналов L-типа связано не с увеличением вероятности выброса, как это наблюдается при усилении входа ионов Ca²⁺ через Ca²⁺-каналы P/Q-типа, а с возрастанием пула синаптических везикул, непосредственно готовых к выбросу (RRP) [225, 227] при высокочастотной ритмической активности НМС. Такое возрастание динамического параметра квантовой секреции АХ, как RRP, на наш взгляд, происходит за счет вовлечения в выброс АХ ранее «молчавших» активных зон.

Необходимо было понять, происходит ли при демаскировании Ca²⁺-каналов L-типа формирование нового Ca²⁺-сигнала только за счет их активности, или, учитывая мощные негативные влияния на них и удаленность этих каналов от синаптических везикул, для вовлечения этого Ca²⁺-входа в регуляцию секреции АХ требуется «усилитель Ca²⁺-сигнала».

Наши исследования выявили, что при практически всех способах стимулирования входа ионов Са²⁺ в моторные нервные терминали по пресинаптическим Са²⁺-каналам L-типа – блокировании BK-каналов, ингибировании CaN и А₁-рецепторов, активации А_2А-рецепторов и стимулировании PKC – происходит Са²⁺-зависимая активация пресинаптических рианодиновых рецепторов (РиР), необходимая для усиления (либо пространственного распространения) Са²⁺-сигнала, формируемого Са²⁺-каналами L-типа [181, 194, 210]. Такое Са²⁺-зависимое подключение РиР и выброса депонированного Са²⁺, генерируя новый, комбинированный Са²⁺-сигнал, способно обеспечить необходимую концентрацию ионов Са²⁺ для запуска экзоцитоза везикул, обычно не выбрасывающих АХ из-за недостаточной насыщаемости их Са²⁺-сенсоров ионами Са²⁺, входящими снаружи. Это объясняет расширение пространственного диапазона доступных для Са²⁺-зависимой секреции квантов АХ, что находит отражение в равномерном возрастании квантового состава ПКП по всему ходу короткого высокочастотного залпа именно за счет увеличения RRP, а не роста вероятности выброса при подключении в регуляцию секреции АХ Са²⁺-каналов L-типа (в комплексе с активацией РиР и выбросом депонированного Са²⁺). Такой комбинированный Ca²⁺-сигнал, по-видимому, способен специфически усиливать секрецию дополнительной популяции квантов АХ из ранее «молчавших» активных зон. Данный механизм отличен от реализуемого при входе ионов Ca²⁺ через P/Q-тип Ca²⁺-каналов.

Это позволяет выдвинуть новое, подкрепленное экспериментальными данными представление, согласно которому специфическое увеличение концентрации ионов Са²⁺ за счет срабатывания функционального тандема «L-тип Са²⁺-каналов – РиР» может быть предназначено для вовлечения в секрецию АХ дополнительных, ранее «молчащих» активных зон и секретируемых из них квантов АХ в ответ на достигающий моторной терминали нервный импульс. Об этом свидетельствует возрастание значения RRP, но не вероятности выброса квантов АХ именно и только при активации (растормаживании разными способами) L-типа Ca²⁺-каналов.

Качественно подобный механизм усиления вызванной секреции нейротрансмиттера – за счет роста числа сайтов, участвующих в секреции квантов, а не возрастания вероятности выброса или размера квантов – недавно выявлен в созревающих ГАМКергических синапсах интернейронов зрительной коры мыши под действием эндоканнабиноидов [231]. НМС присуща низкая вероятность выброса квантов АХ, но при большом количестве активных зон в совокупности это обеспечивает достаточно высокое значение квантового состава ПКП [44, 47]. Такое сочетание структурных и функциональных особенностей позволяет предполагать, что в активных зонах значительное число потенциально доступных для выброса в ответ на приходящий ПД (и активацию входа в моторную терминаль ионов Са²⁺) синаптических везикул испытывает недостаток триггерного действия Са²⁺-сигнала из-за слабой «мощности» возникающих вблизи везикул Са²⁺-нанодоменов. Это может быть связано с низкой вероятностью открывания потенциал-зависимых Ca²⁺-каналов P/Q-типа в ответ на короткий по длительности пресинаптический ПД [64]. Включение в активность моторных терминалей эффективно функционирующего тандема «L-тип Са²⁺-каналов – РиР» в районе активных зон может дополнить недостающий уровень ионов Са²⁺ вблизи «молчащих» активных зон и расположенных там готовых к выбросу синаптических везикул (рис. 2) и тем самым вовлекать их в экзоцитоз. При этом в моторных терминалях нельзя исключить возможность прямой физической сцепки (характерной для триад в скелетных мышечных волокнах) между Ca²⁺-каналами L-типа и РиР, опосредующей выброс депонированного Са²⁺ [232].

Рис. 2. Схема, иллюстрирующая механизм равномерного увеличения квантового состава ПКП в ритмических высокочастотных залпах при растормаживании функционального тандема «L-тип Са²⁺-каналов – РиР». Слева вверху представлены архитектура и вероятное расположение ионных каналов в активной зоне НМС млекопитающих. Демаскирование L-типа Са²⁺-каналов с обязательным участием РиР в качестве «усилителя» Са²⁺-сигнала приводит к вовлечению в секрецию АХ везикул из ранее «молчавших» активных зон (справа внизу). Знак ? означает не установленное точно расположение определенных ионных каналов в активных зонах НМС млекопитающих. Относительное пространственное расположение везикул и каналов в составе активных зон основано на литературных данных [43, 44, 112].

Стабильность обеспечиваемого L-типом Ca²⁺-каналов Ca²⁺-сигнала, вызывающего активацию РиР и выброс депонированного Са²⁺, может обеспечивать комбинированный Ca²⁺-сигнал и, как следствие, повышение размера RRP и обусловленное этим возрастание квантового состава (количества квантов) ПКП по всему ходу короткого ритмического залпа. Именно это и наблюдается при растормаживании L-типа Ca²⁺-каналов, но, как оказалось, обязательно в тандеме с выбросом ионов Са²⁺ из рианодин-чувствительных пресинаптических Cа²⁺-депо.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данном обзоре собраны воедино данные о специфической роли пресинаптических потенциал-зависимых Ca²⁺-каналов в управлении квантовой секрецией АХ в НМС млекопитающих. У этих Ca²⁺-каналов имеется четкое разделение функциональных ролей – триггером экзоцитоза синаптических везикул в нормальных условиях служит P/Q-тип Ca²⁺-каналов (Сa_V2.1). N-, R- и особенно L-тип Ca²⁺-каналов не дублируют роль P/Q-типа Ca²⁺-каналов в НМС, но могут существенно влиять на квантовую секрецию АХ в зависимости от функционального состояния НМС и условий их работы, причем задействуя разнообразные механизмы. В НМС активность обычно «молчащих» пресинаптических Ca²⁺-каналов L-типа находится под многоуровневым и разнонаправленным (преимущественно тормозным) контролем со стороны метаботропных и ионотропных рецепторов, ферментов и калиевых токов в терминалях. При этом достаточно выключения лишь одного из тормозных либо усиления облегчающего влияния, чтобы сдвинуть баланс модулирующих воздействий в сторону активации L-типа Ca²⁺-каналов. Включение L-типа Ca²⁺-каналов облегчает выброс нейротрансмиттера по особому механизму – за счет увеличения размера RRP – роста числа срабатывающих активных зон при стабильной вероятности выброса, что обеспечивает повышенный уровень секреции АХ. Такое потенцирование секреции АХ при растормаживании Ca²⁺-каналов L-типа вызывает активация РиР. Это может быть частью адаптивной системы страхования надежности синаптической передачи через единственный синапс мышечного волокна – в случае функционального ослабления триггерного Ca²⁺-входа по P/Q-типу Ca²⁺-каналов при избыточной активности или различных патологиях нервно-мышечной передачи. Таким образом, роль модуляторных типов Ca²⁺-каналов не сводится лишь к повышению внутритерминальной концентрации Ca²⁺ за счет суммации с Ca²⁺, поступающим по P/Q-типу Ca²⁺-каналов. Каждый такой Ca²⁺-вход является частью дифференцированной адаптивной регулировки параметров секреции АХ в работающих моторных синапсах. Взятые вместе, такие данные расширяют современные представления о возможностях Ca²⁺-зависимой регуляции квантовой секреции нейротрансмиттеров.

ВКЛАДЫ АВТОРОВ

Идея работы, сбор данных (А. Е. Г. и О. П. Б.), написание и редактирование манускрипта (А. Е. Г.).

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Данная работа финансировалась за счет средств бюджета научного проекта государственного задания Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова № 121032300071-8 (28-3-21). Никаких дополнительных грантов на проведение или руководство данным конкретным исследованием получено не было.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

В данной работе отсутствуют исследования человека или животных.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы данной работы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

About the authors

А. Е. Gaydukov

Author for correspondence.
Email: gaydukov@gmail.com
Russian Federation, Moscow

О. P. Balezina

Email: gaydukov@gmail.com
Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Fig. 1. Scheme of multidirectional influences in the mammalian NMJ nerve terminal that control the involvement of L-type Ca2+ channels in the regulation of quantal secretion of ACh. Black dotted arrows are activating influences. Segments with flat ends are inhibitory influences. Red arrows are Ca2+ ion flows. AC is adenylate cyclase.

Download (160KB)

Indexing metadata

3. Fig. 2. Scheme illustrating the mechanism of uniform increase in the quantal content of EPPs in rhythmic high-frequency bursts during disinhibition of the functional tandem "L-type Ca2+ channels - RiR". The architecture and probable arrangement of ion channels in the active zone of the mammalian NMJ are shown at the top left. Unmasking of L-type Ca2+ channels with the obligatory participation of RiR as an "amplifier" of the Ca2+ signal leads to the involvement of vesicles from previously "silent" active zones in the secretion of ACh (bottom right). The sign ? denotes an undetermined location of specific ion channels in the active zones of the mammalian NMJ. The relative spatial arrangement of vesicles and channels within the active zones is based on literature data [43, 44, 112].

Download (394KB)

Indexing metadata