Non-coding RNAs involved in the regulation of signaling pathways as possible markers of non-alcoholic fatty liver disease progression

Full Text

Развитие патологического процесса в организме человека и животных можно рассматривать как снижение их адаптационных возможностей, которые, в свою очередь, определяются как генетическими, так и эпигенетическими факторами и реализуются на уровне экспрессии генов. Некодирующие РНК играют важную роль в регуляции экспрессии генов, модулируя активность хроматина и уровень мРНК, участвуя в альтернативном сплайсинге. Изменение их количества связано с риском развития большого ряда заболеваний, в том числе и заболеваний печени (Bu et al., 2020; He et al., 2020; Rohilla et al. 2022; Zeng et al., 2023). Таким образом, некодирующие РНК могут выступать как терапевтические мишени, а их уровень служить в качестве биомаркеров развития патологических процессов в организме.

Важной составляющей эффективной терапии заболеваний внутренних органов является точная диагностика, основывающаяся не только на результатах с использованием инструментальных, но и биохимических и молекулярно-генетических методов исследования. Это касается и неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП), которая представляет собой широко распространенное хроническое, медленно прогрессирующее метаболическое мультифакториальное заболевание. НАЖБП характеризуется избыточным (>5%) накоплением липидов в печени, с развитием инсулинорезистентности, воспаления и фиброза, и отличается стадийностью течения от стеатоза к стеатогепатиту и циррозу печени. Согласно данным стадиям, выделяют ряд клинико-морфологических форм НАЖБП: стеатоз, неалкогольный стеатогепатит (НАСГ) (с фиброзом или без) и цирроз печени (ЦП) (Лазебник и др., 2021; Powell et al., 2021).

Стеатоз печени является ранней формой НАЖБП и характеризуется доброкачественным клиническим течением. Неалкогольный стеатогепатит (НАСГ) представляет собой воспалительную инфильтрацию паренхимы и стромы печени с наличием балонной дистрофии гепатоцитов и очаговых некрозов. НАСГ является промежуточным и центральным звеном среди последовательных стадий одного патологического процесса (неалкогольного стеатоза и неалкогольного стеатофиброза). Эта клинико-морфологическая форма НАЖБП отличается прогрессирующим течением с возможным развитием ЦП и гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК). Уровень смертности среди больных НАЖБП выше, чем в популяции, не только из-за повреждения органа-мишени, но и в связи с сердечно-сосудистыми событиями и онкопатологией (Маевская и др., 2022).

Ключевыми проблемами диагностики НАЖБП являются дифференциация НАСГ от простого стеатоза и выявление фиброза печени. Золотым стандартом решения данных проблем считается биопсия печени, но она имеет серьезные ограничения, которые включают: инвазивность, риск потенциально опасных для жизни осложнений, плохая переносимость, высокая стоимость. Поиск малоинвазивных, высокоспецифических и экономически эффективных биомаркеров НАЖБП является ключевой задачей в диагностике, определении стадии прогрессирования и длительном мониторинге этого заболевания.

В качестве биомаркеров прогрессирования НАЖБП и тяжести данного заболевания могут выступать эндогенные циркулирующие микроРНК (Baffy, 2015; Dongiovanni et al., 2018). Несмотря на активность РНКаз в клетках и неклеточном пространстве, эти молекулы стабильны. Циркулирующие микроРНК могут быть связаны с различными белками и липопротеинами и транспортироваться внутри внеклеточных везикул. МикроРНК регулируют экспрессию генов на транскрипционном и посттранскрипционном уровнях. Как правило, микроРНК комплементарно связываются с 3’-нетранслируемой областью мРНК (3’НТО) генов-мишеней, что приводит к деградации мРНК или репрессии трансляции (Bartel, 2009). Некоторые микроРНК, напротив, могут стабилизировать мРНК или способствовать трансляции путем связывания с 5'НТО мРНК. МикроРНК могут участвовать в метилировании ДНК через модулирование DNMT (ДНК-метилтрансферазы) напрямую или опосредованно (Tao et al., 2021). Так, мРНК генов DNMT 3aиDNMT3b являются мишенью для микроРНК-125b, 143, 92b, а микроРНК-148a/микроРНК-152 нацелены на мРНК гена DNMT1 (Tao et al., 2021). МикроРНК также могут влиять на содержание TET белков (белки, окисляющие 5-метилцитозин в 5-гидроксиметилцитозин) и, соответственно, уровень деметилирования ДНК и экспрессию генов (Lin et al., 2014). Так, оказалось, что экспрессия гена TET1, который может функционировать как супрессор опухоли, снижена при ГЦК. Транскрипты этого гена являются мишенью для микроРНК-29b (Lin et al., 2014).

Экспрессия микроРНК-122, микроРНК-34а и микроРНК-16 значительно выше у пациентов с НАЖБП и коррелирует с тяжестью заболевания (Cermelli et al., 2011). Интересно, что уровень микроРНК-122 у мышей с экспериментально вызванным стеатозом повышался при отсутствии изменений АЛТ в сыворотке, что позволяет предположить, что уровни микроРНК-122 в сыворотке могут фактически служить биомаркером для обнаружения ранней стадии НАЖБП (Yamada et al., 2015).

Другие молекулы, которые потенциально могут иметь прогностическое и клиническое значение при НАЖБП – длинные некодирующие РНК (днРНК). Уровень экспрессии днРНК у человека имеет клеточную и тканевую специфичность (Rohilla et al., 2022). ДнРНК включают разнообразный класс РНК, а именно длинные межгенные РНК (lincRNA), энхансерные РНК (eRNAs) и смысловые или антисмысловые транскрипты (AS) (Rohilla et al., 2022). Они выполняют различные функции, включая регуляцию транскрипции в цис- или транс-положении, формирование/организацию ядерного домена, регуляцию функции и стабильности белка, уровня микроРНК через их связывание или, по-другому, «спонжирования» (конкурентные РНК). Они могут кодировать малые белки или пептиды. Использование метода Microarray позволило выявить вовлечение 3111 днРНК (1915 с повышенной экспрессией и 1196 с пониженной экспрессией) в патогенез НАЖБП у мышей (Ye et al., 2021a). Обнаружены различия в уровне днРНК между контрольной группой мышей и животными с экспериментально вызванным НАСГ. Выявлены 1394 днРНК с повышенной экспрессией и 1283 днРНК со сниженным уровнем экспрессии. Были также выявлены отличия между группами НАСГ и НАЖБП: обнаружено 1513 днРНК с увеличением и 1824 днРНК с понижением их количества. В настоящее время опубликованы многочисленные обзоры, посвященные роли днРНК в этиологии и патогенезе заболеваний печени (Bu et al., 2020; He et al., 2020; Rohilla et al., 2022; Zeng et al., 2023).

Представляет особый интерес поиск некодирующих РНК, уровень которых ассоциирован со степенью фиброза, что могло бы помочь в прогнозировании исхода заболевания. Формирование фиброза печени в основном обусловлено активацией звездчатых клеток печени (ЗКП) и дисбалансом производства и деградации внеклеточного матрикса (ВКМ) (Циммерман, 2017). Leti и соавторы (Leti et al., 2017) идентифицировали изменение профиля экспрессии 4057 длинных некодирующих РНК в тканях печени пациентов НАСГ, имеющих гистологические признаки развитого фиброза печени по сравнению с пациентами без признаков фиброза и лобулярного воспаления. У пациентов и у экспериментальных животных с НАСГ при фиброзе наблюдается изменение экспрессии днРНК GAS5 (growth arrest-specific transcript) (Yu, et al., 2015a; Han et al., 2020) H19 (Di Mauro et al., 2021), HULC (highly upregulated in liver cancer) (Shen et al., 2019), HOTAIR (Homeobox (HOX) transcript antisense RNA) (Yu et al., 2017; Wu et al., 2023), MALAT1 (metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1) (Shu et al., 2021; Wang et al., 2022), NEAT1 (nuclear enriched abundant transcript 1) (Wang et al., 2021a), MEG3 (maternally expressed gene 3) (Qin et al., 2021). Транскрипт 5, специфичный для остановки роста (GAS5), действует как важный медиатор в контроле клеточной пролиферации и роста. Сведения о роли этой днРНК в фиброгенезе печени противоречивы. Так, показано, что экспрессия GAS5 снижена в образцах фиброзной печени мышей, крыс и человека, а также в активированных звездчатых клетках печени (Yu et al., 2015a). Сверхэкспрессия GAS5 подавляла активацию первичных ЗКП in vitro и уменьшала накопление коллагена в фиброзных тканях печени in vivo (Yu et al., 2015a). GAS5 является мишенью для микроРНК-222, в то же время микроРНК-222 может ингибировать экспрессию GAS5, связываясь с ней напрямую. Усиление экспрессии GAS5, которая функционирует в качестве конкурирующей эндогенной РНК для микроРНК-222, способствует повышению уровня белка p27, ингибируя тем самым активацию и пролиферацию ЗКП. В тоже время имеются данные о том, что уровень экспрессии GAS5 в плазме пациентов с НАЖБП может повышаться или снижаться у пациентов с разной степенью фиброза (Han et al., 2020). У пациентов с F3 стадией количество этой днРНК было значимо выше, чем у пациентов с F2 и F4 стадиями фиброза и циррозом печени. При этом, содержание GAS5 в плазме крови и в печени не зависело от тяжести НАСГ (тяжелая и нетяжелая форма согласно оценке активности НАЖБП (NAS). В плазме крови пациентов с фиброзом печени по сравнению со здоровыми индивидами обнаружено снижение уровня MEG3 (Qin et al., 2021). Как оказалось, уровень этой днРНК отрицательно коррелирует со степенью фиброза. Повышенная экспрессия MEG3 в клетках LX-2 (звездчатые клетки человека) способствует снижению активации звездчатых клеток. Данная днРНК «спонжирует» участвующую в регуляции PPARγ (гамма-рецептора, активируемого пролифератором пероксисом) микроРНК-145. MEG3 может ингибировать активацию звездчатых клеток печени и ускорять реверсию фиброза печени также путем нацеливания на ген NLRC5, кодирующий NOD-подобный рецептор C5 (Wu et al., 2021). NLRC5 является высококонсервативным членом семейства цитоплазматических рецепторов NLR, участвует в воспалении и иммунных реакциях, регулируя различные сигнальные пути, такие как NF-κB (ядерный фактор каппа B), активация которого усиливает воспалительные реакции и фиброз печени (Zhang et al., 2019a). Со степенью фиброза положительно коррелирует плазменный уровень днРНК MALAT1 (Wang et al., 2022).

Прогрессирование фиброза также связано с нарушением регуляции экспрессии микроРНК. Экспрессия микроРНК-21, микроРНК-222, микроРНК-221, микроРНК-199a и микроРНК-17-5p усиливается при активации ЗКП (Ogawa et al., 2012; Lino Cardenas et al., 2013; Zhang et al., 2013; Yu et al., 2015b). В тканях печени больных НАЖБП с фиброзом (F3-F4) наблюдается сверхрегуляция уровней микроРНК-182, -31, -183, -224, -150, -200a, -92b (Leti et al., 2015). В тоже время, экспрессия микроРНК-590, -378i, -17, -219a у этих пациентов снижена по сравнению с больными НАЖБП без признаков фиброза. Также при прогрессировании фиброза печени выявлено снижение уровня микроРНК-19b, микроРНК-15b, микроРНК-16, микроРНК-150 и микроРНК-29a/b (Guo et al., 2009; Estep et al., 2010; Lakner et al., 2012; Zheng et al., 2014).

Предпринимаются попытки связать клинические показатели при НАЖБП с уровнем не отдельных некодирующих РНК, а в комплексе, что обусловлено их регуляторными функциями. Так, в работе Albadawy и соавторов была предпринята попытка оценки экспрессии панели циркулирующих РНК при НАЖБП/НАСГ без подозрения на прогрессирующий и с подозрением на прогрессирующий фиброз (Albadawy et al., 2021a). Обнаружено усиление экспрессии РНК, регулирующих эндотелин 1, в группе пациентов с НАЖБП/НАСГ по сравнению со здоровыми людьми. Авторы предложили использовать панель РНК EDN1/TNF/MAPK3/EP300/hsa-miR-6888-5p/lncRNARABGAP1L-DT-206 в качестве маркеров НАЖБП/НАСГ, а также для разграничения НАЖБП/НАСГ (F1, F2) от поздних стадий фиброза (F3, F4) (Albadawy et al., 2021a). Эта же группа авторов (Albadawy et al., 2021b) предложила использовать и другую панель РНК HSPD1/MMP14/ITGB1/miR-6881-5P/Lnc-SPARCL1-1:2, связанную с регуляцией мРНК гена белка теплового шока HSPD1 (или иначе HSP60), который представляет собой хорошо охарактеризованный митохондриальный шаперон. Его основные функции заключаются в сохранении целостности клеточных белков. HSPD1 действует как важный регулятор продукции цитокинов и взаимодействует с регуляторным фактором интерферона 3 (IRF3), который играет роль в регуляции сигнального пути NLR и IFN-β. Экспрессия мРНК HSPD1 у пациентов с НАСГ отличалась от экспрессии у здоровых людей. Также обнаружены различия в уровне транскриптов этого гена у пациентов с НАЖБП без стеатоза, с простым стеатозом и НАСГ (Albadawy et al., 2021b). Содержание транскриптов HSP60 регулируется днРНК SPARCL1-1:2 и микроРНК 6881-5р.

Сигнальные пути, опосредованные активацией PPAR

В основе патогенеза НАЖБП лежит воспаление, цитотоксическое действие избытка свободных жирных кислот и их метаболитов, формирование инсулинорезистентности. Липотоксичность, как один из триггерных факторов патогенеза НАЖБП, связана с активацией рецепторов активатора пролиферации пероксисом (PPAR) − PPARα, PPARβ/δ, PPARγ. Они представляют собой ядерные рецепторы гормонов, регулирующие обмен углеводов и липидов, гомеостаз глюкозы. Свои функции PPAR выполняют посредством контроля экспрессии генов, кодирующих белки, связанные с окислением жирных кислот, такие как среднецепочечная ацил-КоА-дегидрогеназа и карнитин-пальмитоилтрансфераза-1 (Puengel et al., 2022). Рецепторы активатора пролиферации пероксисом присутствуют в иммунных и паренхиматозных клетках печени (гепатоцитах, ЗКП, макрофагах, дендритных клетках и Т-клетках), активируются при избыточном накоплении липидов и желчных кислот. Активность PPARα связана с высокой способностью к окислению жирных кислот в клетках различных тканей организма. PPARα может регулировать выработку жира в печени посредством активации белка 1c, связывающего регуляторный элемент стерола (SREBP1c), или косвенно координируя его через сигнальный путь LXR (X-рецепторы печени). В обзорной статье Puengel и соавторов приводятся данные литературы, свидетельствующие о том, что активация PPARα происходит уже на ранних стадиях НАЖБП, а экспрессия гена PPARα в печени коррелирует с тяжестью и ответом на лечение пациентов с НАСГ (Puengel et al., 2022). PPARα преимущественно участвует в повышении уровня экспрессии генов печени, связанных с глюконео- и кетогенезом, митохондриальным и пероксисомальным β-окислением, а также связыванием и транспортировкой жирных кислот (Gross et al., 2017). Таким образом, активность сигнального пути PPARα связана с защитой клеток печени от избытка липидов и ЖК. Помимо своих противовоспалительных свойств, PPARα также играет важную роль в защите печени путем регуляции фактора роста фибробластов 21 (FGF21). FGF21 может улучшить системную чувствительность к инсулину и замедлить фиброз печени. PPARβ/δ способствует β-окислению жирных кислот во внепеченочных тканях, преимущественно экспрессируется в жировой ткани, действуя как сенсибилизатор инсулина, и предотвращает накопление жира путем индукции образования триглицеридов свободных жирных кислот (Fuchs et al., 2016). В печени PPAR β/δ экспрессируется в гепатоцитах, ЗКП и клетках Купфера, таким образом участвуя в регуляции воспаления и фиброгенеза при НАСГ (Staels et al., 2013). АктивацияPPARβ/δ играет роль в гепатопротекции через ряд механизмов, например, посредством ингибирования SREBP1c, регуляции рецепторов липопротеинов низкой плотности (Puengel et al., 2022).

Описаны две изоформы PPARγ, PPARγ1 и PPARγ2, транслируемые с четырех альтернативно сплайсируемых мРНК гена PPARG (Zaiou et al., 2023). Изоформа PPARγ1 экспрессируется в печени и других тканях, тогда как изоформа PPARγ2 экспрессируется исключительно в жировой ткани, где она регулирует адипогенез и липогенез. PPARγ регулирует множество процессов в гепатоцитах, резидентных макрофагах печени (клетках Купфера) и звездчатых клетках печени (Skat-Rørdam et al., 2019). При НАСГ повреждение печени, вызванное избытком липидов и гибелью гепатоцитов, запускает активацию клеток Купфера, что приводит к секреции ими провоспалительных цитокинов и хемокинов и усилению рекрутирования моноцитов из кровотока (Wang and Gao, 2021). Активация ЗКП способствует процессам фиброгенеза (Циммерман, 2017). Следовательно, PPARγ может играть значительную роль в патогенезе НАЖБП. Об этом свидетельствуют факты увеличения экспрессии гена PPARG в печени у пациентов с НАЖБП (Pettinelli,Videla, 2011). Патогенентическая или, напротив, защитная роль активации этого рецептора, по-видимому, определяется типом клеток печени, в которых он экспрессируется (Lee et al., 2023). В гепатоцитах PPARγ активируется поступающими жирными кислотами и накопленными липидами и может опосредовать индукцию стеатогенных механизмов, способствуя усилению продукции «молекул опасности» (DAMP) для активации других (непаренхиматозных) клеток печени. В гепатоцитах PPARγ способствует усилению экспрессии генов ADIPOQ (адипонектин), FSP27 (белок липидных капель), CD36 (белок семейства B скэвенджер-рецепторов), LOC112043943 (ацил-КоА дельта(9)десатуразы) и других ферментов синтеза жирных кислот, способствуя адипогенной трансформации гепатоцитов (Yu et al., 2003). PPARγ может регулировать активность ЗКП, процессы эпителиально-мезенхимального перехода и фиброгенеза печени (Morán-Salvador et al., 2013). Показано, что у мышей с делецией гена Pparg в макрофагах и ЗКП наблюдались более выраженные симптомы воспаления и фиброза печени, что предполагает противовоспалительные и антифиброгенные свойства этого ядерного рецептора в непаренхиматозных клетках печени (Morán-Salvador et al., 2013). Полученные к настоящему моменту данные свидетельствуют о том, что усиление экспрессии Pparg способствует накоплению липидов в печени, синтезу и поглощению ЖК. Так, нокаут PPARγ предотвращал развитие стеатоза у мышей, получавших питание с высоким содержанием жиров, а также у мышей дефицитных по лептину (Morán-Salvador et al., 2011; Qin et al., 2020). С другой стороны, активация PPARγ в макрофагах способствует переключению противовоспалительного фенотипа за счет повышения регуляции генов MRC1 (CD206) (маннозный рецептор) и CD163 (скавенджер-рецептор), ингибированию секреции провоспалительных факторов (Zizzo,Cohen, 2015).

В регуляции экспрессии гена PPARG при НАЖБП участвуют некодирующие РНК (табл. 1). К настоящему моменту опубликованы обзорные статьи, посвященные роли эпигенетических механизмов в модулировании уровня транскриптов этого гена (Skat-Rørdam et al., 2019; Zaiou, 2023). Выявлен ряд микроРНК, взаимодействующих с мРНК гена PPARG и способствующих снижению ее уровня при НАЖБП. МикроРНК-27а и микроРНК-27в нацелены на 3'НТО мРНК PPARG (Kim et al., 2010; Zhu et al., 2018). Оказалось, усиление экспрессии микроРНК-34a и микроРНК-34c способствует активации ЗКП путем нацеливания на мРНК гена PPARG. Таким образом, члены семейства микроРНК-34 могут участвовать в фиброзе печени через пути PPAR (Li et al., 2015). Усиление экспрессии микроРНК-30a-3p в гепатоцитах может способствовать накоплению липидных капель и триглицеридов (Wang et al., 2020). мРНК PPARА является мишенью для микроРНК-30a-3p. Напротив, повышение уровня микроРНК-3666 ослабляет признаки стеатоза путем нацеливания на мРНК PPARG (Mittal et al., 2020; Wang et al., 2020).

Важную роль в регуляции метаболизма триглицеридов, холестерина и липопротеинов при НАЖБП играют днРНК. Выявлены днРНК, взаимодействующие с PPAR. Как уже было указано выше, в регуляции активности PPARγ участвует днРНК MEG3, контролирующая уровень микроРНК-145 (Qin et al., 2021). ДнРНК из гепатоцитов lnc-HC участвует в накоплении липидных капель в печени через путь микроРНК-130-3p/PPAR (Lan et al., 2019). Как показано в экспериментах с мышами, находившимися на высокожировой диете,и гепатоцитами, обработанными раствором свободных жирных кислот, сверхэкспрессия днРНКH19 способствует стеатозу посредством усиления накопления липидов в печени и липогенеза через ось микроРНК130a/PPAR (Liu et al., 2019). В регуляции активности PPAR участвует днРНК-активатор стероидных рецепторов РНК (SRA) (Xu et al., 2010). Как оказалось, при НАЖБП активируется консервативный сигнальный путь Hedgehog (Hh) (Guy et al., 2012; Kwon et al., 2016), играющий важную роль в метаболизме липидов в печени и связанных с ним заболеваниях посредством прямой регуляции ранее не охарактеризованной днРНК, называемой длинной некодирующей РНК, индуцированной передачей сигналов Hedgehog (Hilnc) (Jiang et al., 2021). Ингибирование сигнального пути Hh переводит миофибробласты в состояние покоя, тем самым снижая содержание их в печени и ослабляя фиброз (El-Agroudy et al., 2016). Было обнаружено, что Hilnc контролирует стабильность мРНК PPAR путем прямого взаимодействия с IGF22BP2 (белок 2, связывающий мРНК инсулиноподобного фактора роста 2). Таким образом, микроРНК и днРНК, контролирующие уровень транскриптов гена PPAR, могут быть вовлечены не только в регуляцию накопления липидов и жиров в гепатоцитах (как триггерного фактора стеатоза), но и фиброгенеза при НАЖБП.

В прогрессировании неалкогольного стеатогепатита (от стеатоза до фиброза и цирроза печени) важную роль играет воспаление, которое реализуется за счет активации резидентных иммунных клеток печени, в частности клеток Купфера, и усиления миграции в ткани органа дендритных клеток, нейтрофилов, активированных T-лимфоцитов. Цитокины опосредуют ответ клеток на воспаление, запуская сигнальный каскад, направленный на активацию транскрипционных факторов, регулирующих рост, пролиферацию, дифференцировку и выживание гепатоцитов. Среди наиболее важных сигнальных путей, контролирующих процессы воспаления печени, эпителиально-мезенхимального перехода, выживания или повреждения гепатоцитов – TGFβ, IL-6/JAK/STAT3 и TNF/TNFR сигнальные пути. Активность сигнальных путей при воспалении определяется также эпигенетическими факторами. В настоящее время имеется экспериментальный материал, свидетельствующий о вовлечении некодирующих РНК в регуляцию экспрессии генов, контролирующих воспаление, фиброз и цирроз печени, в том числе TGFβ, IL-6/JAK/STAT3 и TNFα/TNFR сигнальные пути (рис. 1, табл. 1).

 

Сигнальные пути, опосредованные TGFβ, IL-6/JAK/STAT3 и TNFα/TNFR, как участники прогрессирования НАЖБП

 

Таблица 1. Некодирующие РНК, вовлеченные в регуляцию сигнальных путей при НАЖБП и фиброзе печени

Некодирующая РНК	Мишень	Функции	Ссылка
Сигнальные пути, опосредованные активацией PPAR
МикроРНК27а и микроРНК27в	Нацелены на 3'НТО мРНКPPARγ	Взаимодействуют с мРНК гена PPARγ и способствуют снижению ее уровня при НАЖБП	Kim et al., 2010
МикроРНК-34a и микроРНК-34c	мРНК гена PPARγ	Усиление экспрессииспособствует активации ЗКП	Li et al., 2015
МикроРНК-30a-3p	мРНК PPARА	Сверхэкспрессия способствует повышению содержания липидных капель и триглицеридов	Wang et al., 2020
МикроРНК-3666	мРНК PPARG	Усиление экспрессии в гепатоцитах может способствовать ослаблению признаков стеатоза	Mittal et al., 2020
ДнРНК MEG3,	МикроРНК-145	Участвуетв регуляции активности PPARγ	Qin et al., 2021
ДнРНК HC	микроРНК-130-3p/PPAR	Регулирует накопление липидных капель в печени	Lan et al., 2019
ДнРНК H19	МикроРНК130a/PPAR	Сверхэкспрессия стеатозу посредством усиления накопления липидов в печени и липогенеза	Liu et al., 2019
TGFβ сигнальный путь
ДнРНК PCAT6	микроРНК-185-5p	Активирует путь TGFβ	Zhu et al., 2020
ДнРНК NEAT1	МикроРНК-339-5p, микроРНК-139-5p	модулирует активность TGFβ сигнального пути, может вовлекаться в процессы фиброгенеза печени, регулируя β-катенин/SOX9/TGFβ1 сигнальный путь, может непосредственно подавлять экспрессию микроРНК-139-5p, способствуя активации ЗКП и усугубляя фиброз печени	Zhang et al., 2019b; Wang et al., 2021a
ДнРНК LFAR1	Smad 2/3	Lnc-LFAR1 способствует связыванию Smad2/3 с TGFβR1 и его фосфорилированию в цитоплазме. Lnc-LFAR1 связывается непосредственно с Smad2/3 и способствует транскрипции TGFβ, SMAD2, SMAD3, NOTCH2 и NOTCH3, что, в свою очередь, приводит к образованию TGFβ.	Zhang et al., 2017
ДнРНК MALAT1	МикроРНК-125b, микроРНК-203a	Конкурирующая эндогенная РНК (ceRNA), взаимодействующая с микроРНК-125b и микроРНК-203a, которые были идентифицированы как два новых отрицательных регулятора передачи сигналов TGFβ	Zhang et al., 2020
ДнРНК HOTTIP	МикроРНК-148a	Негативно регулирует экспрессию микроРНК-148a в ЗКП мышей	Li et al., 2018
ДнРНК LINC00663	Hsa-miR-3916	Регулирует ЭМП и миграцию LX-2 клеток, регулирует процессы фиброгенеза через конкурентное связывание («спожирование») Hsa-miR-3916.	Chu et al., 2023
МикроРНК-101	TβRI,KLF6	Супрессор передачи сигналов TGFβ	Tu et al., 2014
МикроРНК-130a-3p	TGFBR1, TGFBR2	Отрицательная регуляция активации и пролиферации звездчатых клеток печени при прогрессировании неалкогольного стеатогепатита путем прямого действия на гены-мишени TGFBR1 и TGFBR2 (кодирующие рецепторы TGFβ) через сигнальный путь TGFβ/SMAD	Wang et al., 2017
МикроРНК-125b, микроРНК-203a	TGFBR1 и TGFBR2	Отрицательная регуляция передачи сигналов TGFβ	Zhang et al., 2020
МикроРНК-148a	TGFBR1 и TGFBR2	Негативное влияние на активацию ЗКП путем нацеливания на TGFBR1 и TGFBR2.	Li et al., 2018
Hsa-miR-3916	SF2	Участвует в контроле альтернативного сплайсинга пре-мРНК FN (фибронектина) через связывание с фактором сплайсинга 2 (SF2). При альтернативном сплайсинге пре-мРНК FN образуются такие варианты, как дополнительный домен A-FN (EDA-FN), который имеет решающее значение при фиброзе	Mòdol et al., 2015
МикроРНК-139-5p	CTNNB1,	Способствует активации ЗКП и усугубляя фиброз печени	Wang et al., 2021a
МикроРНК-34а	TGIF2	Регуляция TGFβ1 сигнального пути, усиление процессов ЭМП и повышение уровня маркеров фиброза, активирует рецептор трансформирующего фактора роста-бета типа 1 (TβR1), TGFβ1 и p-smad2/3, способствует усилению продукции воспалительных цитокинов IL-6 и IL-17	Pan et al., 2021
Сигнальный путь TNFα /NF-κB
МикроРНК-378	Prkag2	Усиление экспрессии микроРНК-378 способствует снижению уровня транскриптов гена Prkag2, кодирующего AMP активированную протеин киназу γ2 (AMPKγ2), снижению деацетилазной активности сиртуина, повышению активности NF-κB и усилению экспрессии гена TNF.	Zhang et al., 2019c
ДнРНК-gm9795	IRE1α, BIP	Способствует воспалительной реакции при НАСГ, активируя экспрессию генов, кодирующих маркерные белки стресса эндоплазматического ретикулума IRE1α, BIP и экспрессию генов провоспалительных цитокинов через пути NF-kB и JNK	Ye et al., 2021a
MALAT1	МикроРНК-181a	MALAT1 модулирует активацию звездчатых клеток печени посредством регуляции оси микроРНК-181a/TLR4/NF-κB, тем самым способствуя развитию фиброза печени	Wang et al., 2021b
ДнРНК TNF	A20, NFKBIA	Нокаут lncTNF в клетках HepG2 снижает активность транскрипционного фактора NF-kB и подавляет экспрессию генов-мишеней A20 и NFKBIA	Atanasovska et al., 2021
МикроРНК-125b	TNFAIP3	Сверхэкспрессия микроРНК-125b способствует усилению процессов фосфорилирования IκBα и p65 и секреции воспалительных факторов, также способствует NF-κB-опосредованному воспалительному ответу при НАЖБП путем прямого нацеливания на ген TNFAIP3, кодирующий фактор некроза опухоли альфа-индуцированный белок 3 или А20	Zhang et al., 2021
МикроРНК-155	C/EBPβ и SOCS1	Экспериментально подтверждены мишени C/EBPβ и SOCS1. Дефицит микроРНК-155 у нокаутных мышей ослаблял стеатоз и фиброз печени, вызванные диетой с дефицитом метионина- холина, без уменьшения воспаления	Faraoni et al., 2009; Csak et al., 2015
IL-6/JAK/STAT3 сигнальный путь
МикроРНК-200а-3р	мРНК гена STAT3	Повышенная экспрессия может способствовать снижению уровня мРНК гена STAT3 и, вероятно, активности IL-6/JAK/STAT3 сигнального пути	Ye et al., 2021b
МикроРНК-148.	мРНК гена KLF6	Способна снижать соотношение про- и противовоспалительных макрофагов печени, и таким образом, способствовать снижению фибротических процессов в этом органе	Tian et al., 2022
МикроРНК-21	PPARA	Является частью регуляторной сети, которая модулирует фиброгенез печени, участвует в активации воспаления печени (или НАСГ) за счет увеличения экспрессии генов провоспалительных белков через сигнальный путь STAT3, через сигнальные пути TGFβ/Smad3/Smad7 вызывает активацию звездчатых клеток (HSC), отложение коллагена и фиброз печени, повышенный уровень экспрессии микроРНК-21 связывают с развитием стеатоза	Qian et al., 2015; Belloni et al., 2018; Lai et al., 2021

 

TGFβ сигнальный путь

Звездчатые клетки печени, гепатоциты и некоторые другие клетки подвергаются эпителиально-мезенхимальному переходу (ЭМП) в ответ на повреждения печени и воспалительные стимулы, что способствует отложению внеклеточного матрикса (ВКМ) и развитию фиброза. Так, показано, что обработка сфероидов на основе клеток печени человека HepG2/C3A растворами олеиновой и пальмитиновой кислот индуцировала процессы, характерные при НАЖБП (накопление внутриклеточных липидов и повышение содержания АТФ) (Frandsen et al., 2022). При этом отмечена активация транскрипции генов, кодирующих белковые факторы ЭМП (Frandsen et al., 2022). Например, ЭМП сопровождается усилением экспрессии генов факторов транскрипции, таких как Snail, Twist и ZEB, снижением содержания белков межклеточных соединений, таких как E-кадгерин, CAR, клаудины, окклюдины и ZO-1, и активацией синтеза виментина, фибронектина, и N-кадгерина (Kalluri, Weinberg, 2009; Thiery et al., 2009). МикроРНК, такие как микроРНК-200а и микроРНК-141, также способны регулировать ЭMП (Chen et al., 2020).

Трансформирующий фактор роста-β (TGFβ) является одним из основных регуляторов ЭМП. В каноническом пути TGFβ связывается с рецепторами серин/треонинкиназы типа I и типа II (TβRI и TβRII) на клеточной поверхности. Активированный TβRI фосфорилирует белки R-Smad, Smad2 и Smad3, которые собираются в гетеромерные комплексы с Co-Smad4 (Hata, Chen, 2016; Tzavlaki, Moustakas, 2020). Этот путь регулирует содержание факторов транскрипции, участвующих в ЭMП, включая Snail, ZEB и Twist. В неканоническом пути TGFβ стимулирует различные альтернативные сигнальные пути, такие как митоген-активируемая протеинкиназа (MAPK), малые ГТФазы, фосфоинозитид-3-киназа (PI3K)/Akt и ядерный фактор κB (NF-κB) для регуляции экспрессии генов, связанных с ЭМП. В условиях воспалительной микросреды TGFβ может ускорять прогрессирование ЭМП. Выяснилось, что члены семейства микроРНК-101 действуют как супрессоры передачи сигналов TGFβ, нацеливаясь на TβRI и Kruppel-подобный фактор 6 (KLF6), в процессе фиброгенеза печени (Tu et al., 2014).

Wang и соавторы (Wang et al., 2017) показали, что микроРНК-130a-3p может играть роль в регуляции активации и пролиферации звездчатых клеток печени при прогрессировании неалкогольного стеатогепатита путем прямого действия на гены-мишени TGFBR1 и TGFBR2 (кодирующие рецепторы TGFβ) через сигнальный путь TGFβ/SMAD. Сверхэкспрессия микроРНК-130a-3p в звездчатых клетках ингибировала их активацию и пролиферацию, что сопровождалось снижением содержания на поверхности клеток TGFBR1, TGFBR2, активности Smad2, Smad3, матриксной металлопротеиназы-2 (ММП-2), ММП-9, и уровня коллагена 1 и 4 типов (Wang et al., 2017). Известно, что днРНК PCAT6 способствует повышению экспрессии генов TGFBR1 и TGFBR2 и активирует путь TGFβ посредством спонжирования микроРНК-185-5p (Zhu et al., 2020). ДнРНК ядерно-обогащенный обильный транскрипт 1 (NEAT1) также может участвовать в модулировании активности TGFβ сигнального пути, «спонжируя» микроРНК-339-5p, функциональной мишенью которой является мРНК гена TGFB1 (Zhang et al., 2019b). Транскрипт 1 метастаз-ассоциированной аденокарциномы легкого (MALAT1) функционирует как конкурирующая эндогенная РНК (ceRNA), взаимодействующая с микроРНК-125b и микроРНК-203a, которые были идентифицированы как два новых отрицательных регулятора передачи сигналов TGFβ путем нацеливания на TGFBR1 и TGFBR2 (Zhang et al., 2020). В тканях печени и звездчатых клетках печени мышей, которым внутрибрюшинно вводили тетрохлорметан (CCl4), в значительной степени индуцировалась экспрессия днРНК HOTTIP, которая, в свою очередь, ингибировала экспрессию микроРНК-148a (Li et al., 2018). В данном исследовании показано, что микроРНК-148a оказывает негативное влияние на активацию ЗКП путем нацеливания на мРНК TGFBR1 и TGFBR2. Длинная некодирующая РНК AK002107 отрицательно модулирует микроРНК-140-5p и нацеливается на мРНК TGFBR1, чтобы индуцировать эпителиально-мезенхимальный переход при гепатоцеллюлярной карциноме (Tang et al., 2019). У мышей при индуцированном CCl4 фиброзе печени днРНК LFAR1 регулирует процессы фиброгенеза, связываясь непосредственно с Smad2/3, что способствует транскрипции TGFB, Smad2, Smad3, Notch2 и Notch3 и образованию TGFβ (Zhang et al., 2017). Функциональное выключение днРНК LFAR1 посредством LFAR1-shRNA снижает TGFβ-индуцированный апоптоз гепатоцитов in vitro и ослабляет фиброз печени, вызванный CCl4 и лигированием желчных протоков у мышей (Zhang et al., 2017).

 

Сигнальные пути, опосредованные TGFβ, IL-6/JAK/STAT3 и TNFα/TNFR, как участники прогрессирования НАЖБП

 

В фиброзе печени, опосредованном активацей TGFβ сигнального пути в ЗКП, вероятно, играет роль днРНК LINC00663 (Chu et al., 2023). Так, обработка звездчатых клеток человека LX-2 раствором TGFβ1 (10 ng/ml) в течение 48 часов индуцировала усиление в них экспрессии LINC00663. В работе Chu с соавторами показано, что эта днРНК регулирует ЭМП и миграцию LX-2 клеток (Chu et al., 2023). Наблюдается увеличение ее уровня в тканях печени мышей с экспериментально вызванным холестазным фиброзом. Как оказалось, LINC00663 регулирует процессы фиброгенеза через конкурентное связывание («спожирование») Hsa-miR-3916. В свою очередь, Hsa-miR-3916 участвует в контроле альтернативного сплайсинга пре-мРНК FN (фибронектина) через связывание с фактором сплайсинга 2 (SF2). При альтернативном сплайсинге пре-мРНК FN образуются такие варианты, как дополнительный домен A-FN (EDA-FN), увеличение содержания которого имеет значение для усиления фиброза (Mòdol et al., 2015).

ДнРНК NEAT1 также может вовлекаться в процессы фиброгенеза печени, регулируя β-катенин/SOX9/TGFβ1 сигнальный путь (Wang et al., 2021a). Ранее была выяснена патогенетическая роль повышенной экспрессии β-катенина в фиброгенезе, обусловленная его стимулирующим эффектом на экспрессию гена SOX9, кодирующего одноименный транскрипционный фактор (Cui et al., 2021). ДнРНК NEAT1 может непосредственно подавлять экспрессию микроРНК-139-5p, которая в свою очередь нацелена на мРНКCTNNB1, таким образом, способствуя активации ЗКП и усугубляя фиброз печени (Wang et al., 2021a).

Получены сведения о роли микроРНК-34а в регуляции TGFβ1 сигнального пути (Song et al., 2019; Pan et al., 2021). Оказалось, что микроРНК-34а сверхэкспрессирована в периферической крови у пациентов с первичным билиарным холангитом. Повышенная экспрессия микроРНК-34а в клетках HIBEC (клетки эпителия желчных протоков человека) способствует усилению процессов ЭМП и повышению уровня маркеров фиброза. Как оказалось, усиление экспрессии микроРНК-34a связано с активацией TβR1, TGFβ1 и p-SMAD2/3, усилением продукции воспалительных цитокинов IL-6 и IL-17 (Pan et al., 2021). Показано, что микроРНК-34a способствует ЭМП и фиброзу печени при первичном билиарном холангите путем нацеливания на мРНК гена антагониста пути TGFβ1/SMAD − TGIF2 (кодирующий ДНК-связывающий гомеобоксный белок TGIF2, репрессор транскрипции). В работе Song и соавторов (Song et al., 2019) показано, что у крыс фиброз печени, индуцируемый употреблением10% раствором фруктозы, связан с активацией передачи сигналов TGFβ1/Smad и miR-34a/Sirt1/p53.

Сигнальный путь TNFα /NF-κB

Многие сигнальные пути, активирующиеся при воспалении, направлены на регуляцию транскрипционного фактора NF-κB. Цитокины, принадлежащие к семейству TNF, индуцируют транскрипцию генов, регулирующих воспаление, выживаемость, пролиферацию и дифференцировку клеток, главным образом посредством активации пути NF-κB. Семейство NF-kB состоит из пяти родственных белков, p50 (NF-kB1) и p52 (NF-kB2), p65 (RelA), RelB и c-Rel (Rel), которые имеют общий N-концевой участок длиной примерно 300 аминокислот названный доменом гомологии Rel (RHD). RHD вступает в непосредственный контакт с ДНК, в то время как отдельные белковые домены опосредуют как положительные, так и отрицательные эффекты на транскрипцию генов-мишеней посредством рекрутирования коактиваторов и корепрессоров (Hayden, Ghosh, 2014). Белки NF-κB p65, c-Rel и RelB обладают трансактивационным доменом, позволяющим им инициировать транскрипцию посредством рекрутирования коактиватора. Белки p50 и p52 не имеют доменов трансактивации и могут влиять на транскрипцию либо путем гетеродимеризации с p65, c-Rel или RelB, либо посредством взаимодействия с факторами транскрипции, отличными от Rel, например, с негативными регуляторами передачи сигналов NF-κB − IκB. IκB образуют комплексы с димерами NF-κB и удерживают их в цитоплазме.Так называемый «классический» путь передачи сигнала TNF характеризуется индуцируемой деградацией комплекса NF-κB-IκBα в результате связывания TNF с TNFR1. После связывания лиганда с рецептором сигнал передается на IKK-комплекс, который фосфорилирует IκB. «Неканонический» путь представляет собой образование активных гетеродимеров p52:RelB посредством ограниченного протеолиза незрелого предшественника NFKB2, p100, связанным с RelB.

Некодирующие РНК регулируют различные компоненты TNFα/NF-κB сигнального пути при НАЖБП. Так, сверхэкспрессия микроРНК-125b способствует усилению процессов фосфорилирования IκBα и p65 и секреции воспалительных факторов (Zhang et al., 2021). МикроРНК-125b способствует NF-κB-опосредованному воспалительному ответу при НАЖБП путем прямого нацеливания на ген TNFAIP3, кодирующий фактор некроза опухоли, альфа-индуцированный белок 3 или А20. Длинная некодирующая РНК HOTAIR положительно регулирует фосфорилирование p65 и активацию NF-kB, результатом чего является усиление экспрессии генов провоспалительных белков, в том числе IL6, TNF (Wu et al., 2023). MALAT1 модулирует активацию звездчатых клеток печени посредством регуляции оси микроРНК-181a/TLR4/NF-κB, тем самым способствуя развитию фиброза печени (Wang et al., 2021b). ДнРНК-gm9795 способствует воспалительной реакции при НАСГ, активируя экспрессию генов, кодирующих маркерные белки стресса эндоплазматического ретикулума IRE1α, BIP и экспрессию генов провоспалительных цитокинов через пути NF-kB и JNK (Ye et al., 2021a). Gm9795 представляет собой псевдоген StAR-родственного домена переноса липидов (START).

Выявлена роль микроРНК-378 в формировании НАСГ и фиброза печени путем активации передачи сигналов TNFα (Zhang et al., 2019c). На примере мышей с индуцированным высокожировой диетой стеатогепатитом показано, что микроРНК-378 непосредственно нацеливается на мРНК гена Prkag2, который кодирует AMP-активированную протеинкиназу γ2 (AMPKγ2). Передача сигналов AMPK негативно регулирует ось NF-κB-TNFα за счет увеличения деацетилазной активности сиртуина 1. Нокаут микроРНК-378 приводит к усилению деацетилазной активности сиртуина и снижению активности оси NF-κB-TNFα. Активация NF-kB может способствовать подавлению микроРНК-29 при фиброзе печени (Ladeiro et al., 2008). Установлена роль этой некодирущей РНК не только в формировании фиброза, но и НАЖБП (Lin et al., 2019). Повышение содержания микроРНК-29a в печени уменьшает выраженность признаков стеатоза у мышей, находящихся на высокожировой диете (Lin et al., 2019). Кроме этого, усиление экспрессии микроРНК-29a способствует снижению экспрессии в ткани печени эпителиального мезенхимального транскрипционного фактора Snail, содержания виментина и провоспалительных маркеров IL-6 и MCP1 (Lin et al., 2019).

Хорошо изучена регуляция сигнального пути NF-κB при гепатоцеллюлярной карциноме (ГЦК) (Jin et al., 2017). Выявлена прямая реципрокная регуляция микроРНК компонентами сигнального пути NF-κB. Так, микроРНК-26b подавляет NF-κB сигналинг и повышает хемочувствительность клеток ГЦК путем ингибирования TAK1 и TAK1-связывающего белка 3 (TAB3), двух положительных регуляторов, опосредующих активацию канонического пути NF-κB (Zhao et al., 2014). Были идентифицированы целые семейства или кластеры микроРНК, которые регулируют почти все этапы пути NF-κB. Среди них − микроРНК-195, член семейства микроРНК-15, играет решающую роль в регуляции пути TNFα/NF-κB путем подавления IκB-α и TAB3 при ГЦК (Ding et al., 2013). p65/NF-κB является прямым регулятором транскрипции микроРНК-224 (Scisciani et al., 2012). Экспрессия микроРНК-224 не обнаруживается в печени здоровых людей, однако по мере прогрессирования НАЖБП уровень микроРНК-224 увеличивается (Gong et al., 2015). У пациентов с фиброзом печени (стадии F3-F4) уровень этой микроРНК в клетках печени почти в 1.7 раза выше, чем у больных НАЖБП без признаков фиброза (Leti et al., 2015).

TNFα играет одну из ключевых ролей в развитии НАСГ. Было продемонстрировано, что у пациентов с НАСГ со значительным фиброзом наблюдается повышенная экспрессия мРНК TNF по сравнению с пациентами с минимальным или отсутствующим фиброзом (Crespo, 2001).Усиление опосредованного TNFα/TNFR сигнального пути посредством активации клеток Купфера аутокринным или паракринным образом может иметь решающее значение в патогенезе фиброза печени при НАСГ (Tomita, 2006). TNFα, IFN-γ, TGFβ являются индукторами продукции микроРНК-155 (O’Connell et al., 2007). Общее количество предсказанных потенциальных мишеней микроРНК-155 (согласно базе данных miRBaseSequence) составляет 991, хотя было изучено лишь ограниченное число мРНК этих генов. Экспериментально подтверждены такие как C/EBPβ и SOCS1 (Faraoni et al., 2009; He et al., 2009). Экспрессия микроРНК-155 может индуцироваться при активации макрофагов, дендритных клеток, В-клеток и Т-клеток посредством NF-κB и белка- активатора (AP)-1 (Gottwein, 2013). Показано, что при гепатоцеллюлярной карциноме, индуцированной стеатогепатитом, наблюдается активация микроРНК-155, сопровождающаяся снижением экспрессии C/EBPβ и активацией NF-κB (Wang et al., 2009). Дефицит микроРНК-155 у нокаутных мышей ослаблял стеатоз и фиброз печени, вызванные диетой с дефицитом метионина-холина, без уменьшения воспаления (Csak et al., 2015).

Недавно была обнаружена новая межгенная днРНК, обозначенная как днФНО (lncTNF), уровень которой после стимуляции клеток HepG2 обработкой раствором TNFα повышался более чем в 20 раз (Atanasovska et al., 2021). Экспрессия этой днРНК положительно коррелировала с лобулярным воспалением в печени человека. Нокаут lncTNF в клетках HepG2 снижал активность транскрипционного фактора NF-kB и подавлял экспрессию генов-мишеней A20 и NFKBIA. lncTNF может представлять собой новую мишень для контроля воспаления печени.

IL-6/JAK/STAT3 сигнальный путь

Среди сигнальных путей, которые опосредуют развитие НАСГ и фиброза печени, IL-6/JAK/STAT3 играет ключевую роль, как в процессе регенерации печени, так и повреждении гепатоцитов. Следует отметить, что в настоящее время не совсем понятно, оказывает ли повышенный уровень IL-6 позитивный или негативный эффект в отношении функций печени при НАЖБП. Уровень IL-6 в клетках печени и в плазме крови при данном заболевании значительно повышен (Wieckowska et al., 2008; Hou et al., 2021). Обнаружена положительная корреляция его содержания со значениями биохимических показателей, отражающих функциональное состояние этого органа, с уровнем провоспалительных маркеров, признаками портальной гипертензии и степенью фиброза печени (Streetz et al., 2003), с количеством лейкоцитов и моноцитов (Hou et al., 2021). Как оказалось, у больных НАЖБП с фиброзом (S1, S2–S3) уровень IL-6 выше, чем у пациентов без фиброза (S0) (Hou et al., 2021). У пациентов с НАЖБП наблюдается изменение уровня растворимого рецептора IL-6R (Hou et al., 2021; Курбатова и др., 2023). Причем, оказалось, что при высокой активности НАСГ концентрация растворимого IL-6R в крови пациентов резко снижена по сравнению с более ранними стадиями прогрессирования НАЖБП (Курбатова и др.,2023). Повышенный уровень IL-6 в плазме у пациентов с НАЖБП, вероятно, обусловлен усилением его секреции разными типами клеток, включая фибробласты, моноциты, макрофаги, нейтрофилы и гепатоциты, поскольку все они продуцируют IL-6 (Schmidt-Arras, Rose-John, 2016). Получены свидетельства его патологической роли в прогрессировании НАЖБП (Курабтова, Дуданова, 2017). Показана роль интерлейкина-6 в формировании фиброза печени. Во время повреждения печени ЗКП могут подвергаться активации и трансформироваться в клетки, экспрессирующие альфа-гладкомышечный актин (αSMA), сократительные миофибробластоподобные клетки. Показано, что первичные ЗКП мышей, обработанные раствором рекомбинантного IL-6, характеризовались повышенной регуляцией уровня мРНК αSMA и Col1a, а также повышением содержания белка αSMA и активацией JAK/STAT3 сигнального пути (Kagan et al., 2017).

Специфическая активность IL-6 связана со способностью активировать гены-мишени, участвующие в процессах дифференцировки, выживаемости, апоптоза и пролиферации клеток (Naka et al., 2002). Интерлейкин 6 участвует в модулировании баланса Th1 и Th2 клеток (Nishihara et al., 2007). Он способствует дифференцировке клеток Th2 путем усиления продукции ИЛ-4 CD4+T-клетками (Rincón, Flavell, 1997). Интерлейкин 6 способствует продукции другого цитокина, также вырабатываемого Th2 клетками, – IL-13 (Neveu et al., 2009). IL-6 препятствует выработке CD4 Т-клетками интерферона гамма, посредством сверхрегуляции супрессоров цитокинового сигналинга (SOC1и SOC3). SOC факторы обеспечивают отрицательную обратную связь и снижают активность IFNγ сигналинга (Diehl et al., 2000). Интерлейкин 6 в комбинации с TGFβ участвует в дифференцировке T-регуляторных клеток (Treg) в T-хелперы 17 (Th17) (Bettelli et al., 2006). Через индукцию IL-17, интерлейкин 6 способствует рекрутированию нейтрофилов и макрофагов и их миграции в очаг воспаления. Также этот цитокин стимулирует продукцию наивными CD4 Т-клетками и клетками памяти IL-21 (Dienz et al., 2009). IL-21 участвует в дифференцировке В клеток, продуцирующих иммуноглобулины (Dienz et al., 2009).

Важно, что интерлейкин 6 обильно вырабатывается как клетками врожденного, так и приобретенного иммунитета, являясь таким образом «стратегическим» мостом между врожденным и приобретенным иммунитетом. Этот цитокин способствует дифференцировке моноцитов в макрофаги и дендритные клетки (Chomarat et al., 2000), участвует в регуляции экспрессии различных хемокинов и хемокиновых рецепторов, например, CCR7, CXCL1, CXCL5 (Scheller et al., 2011). Плейотропность действия IL-6 на клетки обусловлена сложностью механизмов сигналинга, посредством которых данный цитокин реализует свое действие на клетки. Выделяют классический IL-6-сигналинг и транс-сигналинг. Альтернативный классическому, тип сигналинга (через комплекс IL-6/sIL-6R) был назван IL-6-транс-сигналингом. Образование растворимой формы IL-6R расширяет спектр клеток-мишеней интерлейкина-6. В клетках-мишенях IL-6 в первую очередь связывается с мембраносвязанным α-рецептором IL-6R (mbIL-6R). Этот комплекс затем связывается с двумя молекулами GP130, что приводит к передаче сигнала, которая включает активацию JAK/STAT, ERK и PI3K сигнальных путей. Помимо этого, IL-6 способен связываться с растворимыми sIL-6R (Mitsuyama et al., 2006). Растворимые рецепторы IL-6 выступают в качестве усилителей эффекта этого цитокина и опосредуют активацию транс-сигнального пути в клетках, на поверхности которых отсутствует mbIL-6R (Scheller et al., 2011). Увеличение уровня sIL-6R, наблюдаемое при воспалении, в основном связано с активацией процессов протеолитического расщепления mbIL-6R (эктодоменный шеддинг) металлопротеазами семейства ADAM (Scheller et al., 2011). Активация GP130 транс-сигнальным путем имеет решающее значение для перемещения лимфоцитов в места воспаления. Комплекс IL-6/sIL-6R вовлечен в контроль за проницаемостью сосудов. Воздействуя на фибробласты и индуцируя продукцию сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), IL-6/sIL-6R способен активировать клетки эндотелия (Nakahara et al., 2003). Повышенная проницаемость эндотелия может усилить миграцию воспалительных клеток в пораженные ткани и, следовательно, способствовать их повреждению. Повышенный уровень IL-6 в местах воспаления также может способствовать инфильтрации фибробластов в очаг воспаления.

Что касается неалкогольной жировой болезни печени, то роль активации транс-сигнального пути в патогенезе этого заболевания пока еще не совсем понятна. IL-6/GP130 путь считается протекторным в отношении тяжести фиброза в непаренхимальных клетках печени (Streetz, 2003). По всей вероятности, его блокирование, например, посредством растворимого GP130, может способствовать усилению фиброза печени и ухудшению функционирования этого органа при НАЖБП (Lemmers et al., 2009). Считается, что антивоспалительные эффекты IL-6 реализуются посредством классического сигнального пути, тогда как провоспалительное действие главным образом связано с транс-сигналингом. sIL-6R в основном продуцируется гепатоцитами и миелоидными клетками, которые ответственны примерно за 60% и 40% циркулирующего sIL-6R соответственно (McFarland-Mancini et al., 2010). Передача сигналов IL-6 в миелоидных клетках (клетках, которые являются предшественниками гранулоцитов, макрофагов (зрелый моноцит), тучных клеток или миелоидных дендритных клеток) действует как антифиброзный сигнал.

Содержание IL-6 в основном регулируется на транскрипционном уровне транскрипционными факторами NF-κB и C/EBPα. Их активность в свою очередь регулируется через запуск сигнальных путей при воспалении и, вероятно, может зависеть от соотношения мембраносвязанных и растворимых рецепторов цитокинов. Действительно, IL-6/sIL-6R комплекс активирует p65, NF-κB и STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3) транскрипционные факторы и способствует увеличению содержания мРНК генов IL6, GP130, STAT3 (Kim et al., 2011). МикроРНК-34а супрессирует транскрипционную активность гена IL6R (Li et al., 2015; Yokomizo et al., 2019). Как оказалось, IL-6 регулирует уровень рецепторов IL-6R и IL-6ST (Gp130, OncostatinMReceptor). Повышение содержания этого цитокина способствует изменению уровня микроРНК-181а-3р, -214-3р, -18а-5р, -938, которые, в свою очередь, ингибируют экспрессию гена IL6R (Candido et al., 2021).

Показано, что при некоторых онкологических заболеваниях экспрессия гена IL6R положительно коррелирует с уровнем днРНК LINC01116. В регуляции уровня транскриптов IL6R и LINC01116играет роль микроРНК-520a-3p, которая нацелена на 3'-НТО LINC01116 и IL6R (Zhang et al., 2018). Экспрессию гена IL6R регулирует микроРНК-136. Длинная некодирующая РНК CRNDE (Colorectal Neoplasia Differentially Expressed) может усиливать экспрессию гена IL6R, спонжируя микроРНК-136 (Zhang et al., 2019d). В регуляции экспрессии IL6R участвует микроРНК-451a. Снижение уровня последней способствует активации сигнального пути JAK/STAT (Feng et al., 2019). С использованием клеток HepG2, обработанных свободными жирными кислотами, показано, что микроРНК-451a может участвовать в стеатозе печени путем регуляции экспрессии гена THRSP (Thyroid Hormone-Inducible Hepatic Protein), который представляет собой новую потенциальную мишень для терапии НАЖБП (Zeng et al., 2018). МикроРНК-211 связывается с 3'-НТО мРНК гена IL6R, регулируя уровень его транскриптов (Chen et al., 2019). МикроРНК-211 является мишенью HOTAIR, которая участвует в регуляции состояния хроматина и вызывает молчание генов путем взаимодействия с гистонметилазой и гистондеметилазой (Bhan, Mandal, 2015). Сверхэкспрессия HOTAIR и нокдаун микроРНК-211 связаны с повышенной экспрессией IFNγ, IL-6, IL-17, TNFα, IL-1β и IL-6R в моноцитах. В плазме пациентов с НАЖБП концентрации микроРНК-211 коррелировали с уровнями АСТ (Mehta et al., 2016). Таким образом, ось HOTAIR/miR-211/IL6R может быть задействована в регуляции воспаления и выживаемости или гибели иммунных клеток и, возможно, гепатоцитов. МикроРНК-124 (отдельно или вместе с микроРНК-7) ингибирует активацию IL-6R и NF-kB (Rel-A) (Bhan, Mandal, 2015). Следует отметить, что сведений относительно изменения уровня этих некодирующих РНК у пациентов с НАЖБП и фиброзом печени в настоящее время в имеющийся литературе мы не встретили.

Как уже отмечалось, IL-6 активирует транскрипционный фактор STAT3, который является ключевым регулятором фиброза печени (Zhao et al., 2021). STAT3 играет положительную роль в регуляции выживания и пролиферации клеток. Однако его постоянная активация может приводить к запуску процессов, имеющих негативный эффект в отношении функций печени. Так, постоянная активация STAT3 играет решающую роль в фиброгенезе печени. Активация STAT3 обнаружена во многих фиброзных тканях (Kasembeli et al., 2018). Показана роль активации STAT3 в накоплении липидов и развитии стеатоза (Belloni et al., 2018). Так, ингибирование STAT3 уменьшало накопление липидов, вызванное обработкой клеток dHepaRG раствором олеата натрия. Более того, ингибирование STAT3 в этих клетках с помощью S3I-201 (химический ингибитор STAT3) способствовало нормализации уровня экспрессии генов, регулирующих метаболизм липидов. Однако молекулярные механизмы, посредством которых STAT3 участвует в инициации и прогрессировании стеатоза и фиброза печени, до сих пор полностью не изучены.

Антивоспалительный и провоспалительные эффекты активации STAT3 при заболеваниях печени также могут регулироваться эпигенетически. Довольно полно изучена роль регуляции IL-6/STAT3 пути молекулами микроРНК и днРНК при гепатоцеллюлярной карциноме (Jin et al., 2017). Известно, что IL-6/STAT3 путь активирует днРНК THOR (Ge et al., 2020). ДнРНК TSLNC8 ингибирует фосфорилирование STAT3 (Zhang et al., 2018). У больных ГЦК снижение экспрессии этой днРНК связано с плохим прогнозом выживаемости (Zhang et al., 2018). Показано, что IL-6 активирует микроРНК-21 посредством прямого связывания STAT3 с вышестоящим энхансером (Kohanbash, Okada, 2012). У мышей, дефицитных по микроРНК-21 (miR21KO) наблюдается активация MAPK и STAT3 сигнальных путей и усиление экспрессии протоонкогенных генов (Correia De Sousa et al., 2021). В то же время, микроРНК-21 является частью регуляторной сети, которая модулирует фиброгенез печени. Активация p65, STAT3 при обработке гепатоцитов раствором IL-6 или TNFα приводила к усилению экспрессии микроРНК-21 (Qian et al., 2015). Qian и соавторы показали важную роль регуляторной сети, состоящей из HNF1α (Hepatocyte nuclear factor 1α), SHP-1, STAT3, p65, микроРНК-21 и микроРНК-146a, в развитии гепатоцеллюлярной недостаточности. Поврежденные гепатоциты высвобождают IL-6 и TGFβ1 для активации покоящихся ЗКП, а активированные ЗКП высвобождают IL-6 и TNFα, усиливая экспрессию микроРНК-21 и микроРНК-146a, что еще больше усугубляет повреждение печени (Qian et al., 2015). Воздействие провоспалительных факторов на гепатоциты стимулирует экспрессию члена кластера микроРНК-17-92 − микроРНК-18a (Brock et al., 2011). МикроРНК-18a нацелена на мРНК PIAS3 (Е3 SUMO-протеинлигаза – транскрипционный модулятор), что приводит к усилению активности STAT3 и в итоге к высвобождению белков острой фазы (Brock et al., 2011). Это представляет новую петлю положительной обратной связи передачи сигналов IL-6/STAT3 посредством участия микроРНК.

С использованием модельной системы трансгенных рыбок данио со стабильной экспрессией микроРНК-21, показано, что эта микроРНК участвует в активации воспаления печени (или НАСГ) за счет увеличения экспрессии генов провоспалительных белков через сигнальный путь STAT3. Помимо этого, установлено, что микроРНК-21 через сигнальные пути TGFβ/Smad3/Smad7 вызывает активацию звездчатых клеток (HSC), отложение коллагена и фиброз печени (Lai et al., 2021).

Показана роль микроРНК-21 в формировании стеатоза печени и ее связь с активностью STAT3. Так, обработка клеток HepaRG раствором олеата натрия индуцировала развитие в них признаков, характерных при везикулярном стеатозе печени, активировала воспалительный ответ посредством регулирования фосфорилирования STAT3 по остатку тирозина в положении 705 аминокислотной последовательности (Belloni et al., 2018). Авторами исследования в обработанных раствором олеата клетках были идентифицированы несколько микроРНК с повышенным уровнем экспрессии, в частности, микроРНК-21, микроРНК-181-b, микроРНК-18а и микроРНК-34. Количество микроРНК-26а, let7a, микроРНК-122 и миР-221, напротив, было снижено. Оказалось, что, фосфорилированная форма STAT3-Tyr705 после обработки клеток dHepaRG олеатом натрия может связываться с промоторами генов, включая регуляторную область гена, кодирующего микроРНК-21, таким образом, усиливая их транскрипционную активность. Ингибирование STAT3, напротив, снижает уровень экспрессии микроРНК-21 и способствует ослаблению признаков везикулярного стеатоза (Belloni et al., 2018). STAT3 также регулирует уровень микроРНК-18а (Cao et al., 2013).

С пироптозом гепатоцитов и развитием фиброза положительно связана экспрессия гена ANXA2 (ген, кодирующий Аннексин А2) (Feng et al., 2022). Фосфорилированная форма STAT3 (p-STAT3) связывается с промотором ANXA2 и способствует его транскрипции. Ингибирование p-STAT3 может значительно подавлять пироптоз гепатоцитов и фиброз (Feng et al., 2022). В работе Ye и соавторы (Ye et al., 2021b) показано, что при фиброзе печени уровень экспрессии гена STAT3 снижен. Согласно результатам биоинформатического анализа, выполненного в этом исследовании, мРНК гена STAT3 является мишенью для микроРНК-200а-3р и ее повышенная экспрессия может способствовать снижению уровня мРНК гена STAT3 и, вероятно, активности IL-6/JAK/STAT3 сигнального пути (Ye et al., 2021b).

Уровень экспрессии STAT3 регулируется Круппелеподобным фактором 6 (KLF6). мРНК гена KLF6 является мишенью для микроРНК-148. Оказалось, что микроРНК-148, содержащаяся в экзосомах мезенхимальных стволовых клеток, за счет модулирования JAK/STAT3 пути способна снижать соотношение про- и противовоспалительных макрофагов печени, и, таким образом, способствовать снижению фибротических процессов в этом органе (Tian et al., 2022).

Таким образом, учитывая роль некодирующих РНК в патогенезе НАЖБП и формировании фиброза печени, можно заключить, что они могут быть потенциальными малоинвазивными маркерами прогрессирования НАЖБП и стадий фиброза. Однако в настоящее время недостаточно данных литературы относительно соответствия уровня некодирующих РНК определенным формам этого заболевания, тяжести течения НАСГ и степени фиброза, чтобы обозначить их как высокоспецифические, имеющие диагностическое значение молекулярно-генетические маркеры.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Работа выполнена в рамках государственного задания по теме № FMEN-2022-0009 (№ гос. регистрации 122031100064-4).

БИОЭТИКА

Авторы подтверждают, что данная статья не является оригинальным исследованием, а представляет собой обзор данных литературы. Одобрение этического комитета не требуется.

About the authors

L. I. Topchieva

Karelian Research Centre of the Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: topchieva67@mail.ru
198910, Petrozavodsk, st. Pushkinskaya, 11

G. A. Zhulay

Karelian Research Centre of the Russian Academy of Sciences

Email: topchieva67@mail.ru
Russian Federation, 198910, Petrozavodsk, st. Pushkinskaya, 11

I. V. Kurbatova

Karelian Research Centre of the Russian Academy of Sciences

Email: topchieva67@mail.ru
Russian Federation, 198910, Petrozavodsk, st. Pushkinskaya, 11

O. P. Dudanova

Petrozavodsk State University

Email: topchieva67@mail.ru
Russian Federation, 185910, Petrozavodsk, st. Lenina, 33

A. V. Vasilyeva

Karelian Research Centre of the Russian Academy of Sciences

Email: topchieva67@mail.ru
Russian Federation, 198910, Petrozavodsk, st. Pushkinskaya, 11

References

Supplementary files