Comparison of the cytogenetic effects of a pulsed magnetic field and gamma radiation on meristem cells of onion seed sprouts (Allium cepa l.)

Texto integral

Магнитное поле (МП) является фактором окружающей среды, который оказывал влияние на живые организмы в течение всего периода их эволюции на Земле. В последние сто лет происходит массовое внедрение оборудования и технологий, что приводит к широкому распространению воздействия на живые организмы, в том числе и человека, магнитных и электромагнитных полей (ЭМП) с частотами, модуляцией и интенсивностями, отличающимися от природных МП. Поскольку воздействие техногенных ЭМП на живые организмы с эволюционной точки зрения началось лишь недавно, у них не было возможности адаптироваться к ней (Belyavskaya, 2004). Это требует, с одной стороны, определения безопасных уровней воздействия ЭПМ на биологические системы, а с другой – дает возможность использовать эти электромагнитные поля в качестве одного из стрессоров для изучения функционирования биологических систем.

Механизмы биологического действия МП остаются далекими от полного понимания. Результаты некоторых исследований in vitro показывают, что электромагнитные поля не оказывают прямого мутагенного действие на ДНК, но модифицируют активность ферментов (Loeschinger et al., 1998); МП может генерировать в биологических системах индукционные токи и таким образом менять мембранный клеточный потенциал (Goodman et al., 1986).

Импульсные магнитные поля (ИМП) применяются в научных исследованиях, материаловедении, геологии, медицине (Livshiz, Gafr, 1999; Shaburova et al., 2022). “Пороговая” чувствительность, начиная с которой регистрируются биологические реакции, оценивается в 3 мТл для переменного магнитного поля и в 0.1 мТл для ИМП (Боголюбов, 1978).

Одним из способов изучения биологического действия ИМП может быть сравнение его эффектов с действием факторов, для которых биологическое действие хорошо изучено, например с гамма-излучением. Ионизирующее излучение приводит к широкому спектру биологических эффектов (от стимуляции развития до угнетения и гибели) при изучении влияния на растениях и животных (Donà et al., 2013; Bolsunovsky et al., 2018). При этом основной мишенью для гамма-излучения является ДНК (Olive, 1998).

Аллиум-тест (Allium test) – растительная тест-система, используемая при оценке мутагенного влияния факторов различной природы (Evseeva et al., 2005; Kumar et al., 2020; Priakhin et al., 2020).

Целью настоящего исследования является сравнительный анализ цитогенетических эффектов в клетках растений при воздействии ИМП и острого гамма-облучения с использованием аллиум-теста.

Материалы и методы

Объектом исследования являлись проростки семян лука репчатого (Allium cepa L.) сорта “Забияка” (ООО «Группа компаний “Гавриш”», партия 25753).

Характеристики факторов воздействия. Гамма-облучение проводили на исследовательской гамма-установке радиобиологической ИГУР-1М с 4 источниками ¹³⁷Cs. Мощность дозы гамма-излучения составляла 0.7 Гр/мин, неравномерность гамма-поля в рабочем пространстве не более 5%. Острое γ-облучение проросших семян проводили в дозах 0.05; 0.1; 0.5; 1; 3 и 5 Гр.

В экспериментах использовали генератор импульсного магнитного поля, предназначенный для оценки влияния импульсного магнитного поля на биологические объекты (Галузо, Козлов, 2006). Прибор генерирует импульсное магнитное поле, которое имеет следующие параметры: несущая частота 1.8 МГц, импульсное магнитное поле модулировано импульсами с фронтом длительностью 40 нс и плавным нисходящим спадом, напоминающим параболу. Частота повторения импульсов – 28 кГц, длительность импульса по уровню 0.7 равна 2.7 мкс. Индукция МП в месте расположения биологических объектов составила 75 мТл. Воздействие ИМП на проросшие семена проводили в течение 1; 30; 60 с; 5 и 30 мин.

Схема эксперимента. Аллиум-тест проводили с использованием семян лука в соответствии с протоколом (Паушева, 1988). Семена лука для синхронизации клеточного цикла до эксперимента хранили в холодильнике при температуре 4–5°C в течение суток. За 1 час до начала эксперимента семена извлекали из холодильника.

В эксперименте было сформировано 12 групп (табл. 1), в том числе группа ложного воздействия, где проростки семян лука подвергали таким же манипуляциям, как при воздействии ИМП или гамма-облучения, но без воздействия исследуемых физических факторов.

 

Таблица 1. Экспериментальные группы

№ группы	Воздействие ИМП, время	№ группы	Доза гамма-облучения, Гр
1	Ложное воздействие
2	1 с	8	0,05
3	10 с	9	0,1
4	30 с	10	0,5
5	60 с	11	1,0
6	5 мин	12	3,0
7	30 мин	13	5,0

 

Для исследования семена помещали в чашки Петри с фильтровальной бумагой (“Красная лента”), добавляли по 3.0 мл дистиллированной воды и оставляли в термостате при t = 24.0°C. На третьи сутки семена с проростками длиной 1 см помещали в пробирки Эппендорфа объемом 1.5 мл по 20 проростков семян в 1 пробирку, в пробирки добавляли 100 мкл дистиллированной воды и подвергали воздействию острого гамма-излучения или ИМП согласно протоколу эксперимента. После экспериментального воздействия семена переносили в новые чашки Петри с фильтровальной бумагой, добавляли по 3 мл дистиллированной воды и помещали в термостат при температуре 24.0°C. Через 24 ч проростки фиксировали фиксатором Кларка (спирт 96%, ледяная уксусная кислота в соотношении 3:1) в течение суток при температуре 4°C, затем промывали и фиксировали 70% спиртом для долговременного хранения.

Для приготовления давленого препарата фиксированные корешки промывали дистиллированной водой, помещали в 2% раствор ацетоорсеина, нагревали до появления признаков кипения, оставляли на сутки. Далее из корня проростка скальпелем отделяли участок меристемы (2 мм с апикального конца) и готовили давленый препарат для микроскопии. Анализ проводили на микроскопе ZEISS AXIO Scope.A1, объектив 40×/0.75, окуляры 10×/23.

Показатели. Определяли митотическую активность, частоту клеток с микроядрами и частоту ана- и телофаз с аберрациями (Grant, 1982; Fiskesjo, 1985; Прохорова и др., 2005). Для оценки митотической активности меристематической ткани подсчитывали процент делящихся клеток от общего числа проанализированных клеток (МИ, % доля делящихся клеток). Определяли соотношение фазных индексов как долю клеток в каждой фазе митоза: профаза, метафаза, анафаза, телофаза (Паушева, 1988). Было проанализировано более 9000 клеток меристемы.

Был проведен анализ хромосомных аберраций в ана-телофазе (фрагменты, мосты, отставшие хромосомы и др.) и рассчитана частота клеток с аберрациями. Было проанализировано не менее 500 клеток на стадии ана-телофазы в каждой экспериментальной группе. Частоту клеток с аберрациями рассчитывали как отношение суммы ана- и телофазных клеток, в которых были зарегистрированы хромосомные аберрации, к общему числу проанализированных ана-телофаз (% клеток с нарушениями).

Был проведен анализ спектра аберраций, для этого выделяли три группы нарушений согласно работе (Удалова и др., 2016): хроматидные (одиночные мосты (m1) и фрагменты (f1)), хромосомные (двойные мосты (m2) и фрагменты (f2)), геномные (отстающие хромосомы (lg) и многополюсные митозы (3p)).

Для определения частоты клеток с микроядрами было проанализировано не менее 7000 клеток меристемы лука. Выявляли микроядра в цитоплазме интерфазных клеток, рассчитывали долю клеток с микроядрами (МЯ,%).

Статистический анализ. Данные обрабатывали методами вариационной статистики с использованием пакета MS Excel и Past 3.10. При регрессионном анализе использовали метод наименьших квадратов. Для проверки нормальности распределения использовали критерий Шапиро – Уилка. Для сравнения показателей митотического индекса применяли двухвыборочный t-критерий Стьюдента (Barberio et al., 2011). При сравнении средних показателей частоты клеток с хромосомными аберрациями, различные типы аберраций и частота клеток с микроядрами использовали непараметрический метод χ² (Rank, 2003). Различия принимали статистически значимыми при p < 0,05. Сравнения 3 групп по количественным показателям с ненормальным распределением проводили с помощью критерия Краскела – Уоллиса с дальнейшим попарным расчетом критерия Манна – Уитни (Кузовлев и др., 2021). Согласно поправке Бонферрони корректировка производится по формуле α_B = α/m, где α – первоначальный уровень альфа (0.050); α_B – скорректированный уровень α с помощью поправки Бонферрони; m – число сравнений (гипотез) (Наркевич и др., 2020). Различия принимали статистически значимыми при p < 0.017.

Результаты исследования

1. Анализ влияния исследуемых факторов на митотический индекс

Распределение величины митотического индекса статистически значимо не отличалось от нормального: W₍₄₇₎ = 0.99; p = 0.87. В группе ложного воздействия митотическая активность составляла 8.1 ± 0.3% (табл. 2).

 

Таблица 2. Показатели митотической активности клеток меристемы проростков семян Allium cepa L.

Экспериментальные группы	Митотический индекс, %	Профазный индекс, %	Метафазный индекс, %	Анафазный индекс, %	Телофазный индекс, %
1	8.1 ± 0.3	32.7 ± 1.5	23.1 ± 1.4	15.8 ± 1.2	28.3 ± 1.5
2	10.8 ± 0.3*	43.0 ± 1.5*	21.7 ± 1.2	11.8 ± 1.0*	23.4 ± 1.3*
3	9.3 ± 0.3*	37.2 ± 1.5*	23.0 ± 1.3	9.2 ± 0.9*	30.7 ± 1.4
4	10.0 ± 0.3*	31.9 ± 1.5	25.2 ± 1.4	14.4 ± 1.1	28.5 ± 1.4
5	11.5 ± 0.3*	42.5 ± 1.4*	21.6 ± 1.2	10.0 ± 0.8*	26.0 ± 1.2
6	12.6 ± 0.4*	43.0 ± 1.5*	19.0 ± 1.2*	10.7 ± 0.9*	27.4 ± 1.4
7	9.6 ± 0.3*	43.5 ± 1.5*	20.1 ± 1.2	10.0 ± 0.9*	27.0 ± 1.4
Среднее для всех групп ИМП	11.0 ± 0.1	40.4 ± 1.8	21.7 ± 0.5	11.0 ± 0.4	27.0 ± 0.5
8	11.1 ± 0.3*	40.8 ± 1.3*	22.0 ± 1.1	12.7 ± 0.8*	24.6 ± 1.1*
9	8.8 ± 0.2	39.0 ± 1.4*	21.7 ± 1.3	12.0 ± 0.9*	27.5 ± 1.3
10	10.2 ± 0.3*	46.0 ± 1.5*	20.5 ± 1.2	10.2 ± 0.9*	23.3 ± 1.2*
11	9.7 ± 0.3*	41.2 ± 1.4*	23.8 ± 1.3	13.0 ± 1.0*	22.1 ± 1.2*
12	8.1 ± 0.2	44.4 ± 1.5*	24.2 ± 1.4	8.3 ± 0.8*	23.1 ± 1.2*
13	10.4 ± 0.3*	38.0 ± 1.5*	21.6 ± 1.5	9.4 ± 0.9*	31.0 ± 1.5
Среднее для всех групп гамма-облучения	10.0 ± 0.1*	41.6 ± 1.8*	22.3 ± 0.5	11.0 ± 0.4*	25.1 ± 0.5*

Примечание. * – статистически значимое отличие от группы контроля при значении р < 0.05. ** – статистически значимое отличие всех доз гамма-облучения от группы всех сроков воздействия ИМП при значении р < 0.017.

 

Величина митотической активности клеток меристемы в корнях проростков семян лука после воздействия ИМП во всех экспериментальных группах была статистически значимо выше уровня ложного воздействия (t = 8.89; p < 0.001). При проведении регрессионного анализа не было выявлено зависимости митотического индекса от времени воздействия ИМП (R² = 0.02; F = 0.49; p = 0.48). Профазный индекс во всех группах ИМП был статистически значимо (t = 15.16, p < 0.001) выше, чем в группе ложного воздействия.

При анализе митотической активности клеток меристемы после гамма-облучения не было выявлено четкой зависимости от дозы этого показателя (R² = 0.0003; F = 0.008; p = 0.93). Статистически значимое увеличение показателя митотической активности было зарегистрировано при облучении проростков семян в дозах 0.05; 0.5; 1.0; 5.0 Гр. Такие изменения происходили преимущественно за счет увеличения длительности профазы. При анализе данных было обнаружено, что профазный индекс во всех группах с воздействием гамма-излучения статистически значимо был выше (p < 0.001), чем в группе ложного воздействия. При проведении регрессионного анализа не было выявлено статистически значимой зависимости профазного индекса от дозы (R² = 0.004; F = 0.1, p = 0.7).

Кроме профазного индекса в клетках меристемы проростков лука гамма-излучение приводило к изменению длительности анафазы и телофазы. При проведении регрессионного анализа было показано, что анафазный индекс снижался с увеличением дозы облучения согласно линейной функции (R² = 0.16; F = 5.5; p = 0.02). Телофазный индекс был статистически значимо меньше в группах с гамма-облучением в дозах 0.05; 0.5, 1.0 и 3.0 Гр.

2. Анализ влияния исследуемых факторов на частоту клеток в ана-телофазе с аберрациями

Распределение величины частоты клеток с аберрациями статистически значимо отличались от нормального (W₍₄₇₎ = 0.64; p < 0.001). Частота клеток с аберрациями в ана-телофазе меристемы проростка лука в группе ложного воздействия составила 4.6 ± 1.0% (табл. 3). ИМП приводило к повышению частоты клеток с аберрациями: статистически значимое увеличение показателя было зарегистрировано в группах с воздействием ИМП в течение 10 с, 60 с, 5 мин и 30 мин. При воздействии ИМП в течение 1 и 30 с частота клеток с аберрациями статистически значимо не отличалась от значения показателя в группе ложного воздействия.

 

Таблица 3. Частота клеток с аберрациями в ана-телофазе в меристеме проростков семян Allium cepa L.

Экспериментальные группы	Условия эксперимента	Кол-во А-Т	ХА, %
1	Ложное воздействие	500	4.6 ± 1.0
2	ИМП, 1 с	613	6.0 ± 1.1
3	ИМП, 10 с	580	8.3 ± 1.2*
4	ИМП, 30 с	453	5.2 ± 1.0
5	ИМП, 60 с	501	10.6 ± 1.3*
6	ИМП, 5 мин	452	8.0 ± 1.2*
7	ИМП, 30 мин	505	10.0 ± 1.4*
Среднее для всех групп ИМП	ИМП, все сроки	3041	8.0 ± 1.2*
8	γ-облучение, 0.05 Гр	613	8.3 ± 1.1*
9	γ-облучение, 0.1 Гр	580	9.0 ± 1.2*
10	γ-облучение, 0.5 Гр	453	10.8 ± 1.5*
11	γ-облучение, 1.0 Гр	501	15.0 ± 1.6*
12	γ-облучение, 3.0 Гр	452	25.0 ± 2.0*
13	γ-облучение, 5.0 Гр	505	38.4 ± 2.2*
Среднее для всех групп гамма-облучения	γ-облучение, все дозы	3104	17.7 ± 1.6*

Примечание. * – статистически значимое отличие от группы контроля при значении р < 0.05, ** – статистически значимое отличие всех доз гамма-облучения от группы всех сроков воздействия ИМП при значении р < 0.017

 

Регрессионный анализ показал отсутсвие зависимости частоты клеток с аберрациями от времени воздействия ИМП (R² = 0.026; F = 1.21; p = 0.3). Таким образом, ИМП независимо от длительности воздействия (в исследуемом диапазоне до 30 мин) приводит к повышению частоты клеток с аберрациями на 57% по сравнению с ложным воздействием.

Цитогенетический анализ показал, что гамма-излучение приводит к дозозависимому повышению частоты аберрантных клеток в ана-телофазе (рис. 1).

 

Рис. 1. Линейная модель зависимости частоты клеток с хромосомными аберрациями от дозы облучения гамма-излучения

 

Статистически значимое повышение частоты клеток с аберрациями было обнаружено при радиационном воздействии в дозе 0.05 Гр и выше. В диапазоне доз до 5 Гр частота клеток с хромосомными аберрациями линейно зависит от дозы гамма-облучения (R² = 98.40; F = 309.90; p < 0.001).

В ходе ана-телофазного анализа проводили анализ спектра аберраций хромосом (табл. 4). В группе ложного воздействия регистрировали только хроматидные аберрации. В группах воздействия ИМП основной вклад в спектр нарушений вносили хроматидные аберрации (7.4 ± 0.3%) и в меньшей степени хромосомные аберрации (0.2 ± 0.2%) и геномные (0.3 ± 0.2%).

 

Таблица 4. Спектр аберраций в ана-телофазе клеток меристемы проростков семян лука

Группа	f' + m', %	f" + m", %	lg, %
0	4.6 ± 0.9	0.0 ± 0.0	0.0 ± 0.0
1	5.4 ± 1.0	0.2 ± 0.2	0.2 ± 0.2
10	7.9 ± 1.2*	0.2 ± 0.2	0.2 ± 0.2
30	5.0 ± 0.9	0.2 ± 0.2	0.0 ± 0.0
60	9.4 ± 1.3*	0.2 ± 0.2	0.9 ± 0.4*
300	7.4 ± 1.2	0.2 ± 0.2	0.2 ± 0.2
1800	9.5 ± 1.3*	0.2 ± 0.2	0.2 ± 0.2
Среднее для всех групп ИМП	7.4 ± 1.2*	0.2 ± 0.2	0.3 ± 0.2
0,05	8.2 ± 1.1*	0.0 ± 0.0	0.2 ± 0.2
0,1	8.3 ± 1.1*	0.9 ± 0.4*	0.0 ± 0.0
0,5	9.9 ± 1.4*	0.7 ± 0.4	0.2 ± 0.2
1	13.6 ± 1.5*	0.4 ± 0.3	1.0 ± 0.4*
3	18.4 ± 1.8*	2.9 ± 0.8*	3.8 ± 0.9*
5	25.2 ± 1.9*	8.5 ± 1.2*	3.2 ± 0.8*
Среднее для всех групп гамма-облучения	13.6 ± 1.5*	2.1 ± 0.6*	1.3 ± 0.5*

Примечание. f' + m' – хроматидные аберрации; f" + m" – хромосомные аберрации; lg – геномные аберрации; одиночные мосты (m') и фрагменты (f'), двойные мосты (m") и фрагменты (f"), отстающие хромосомы (l), *– статистически значимое отличие от группы контроля при значении р < 0.05, **– статистически значимое отличие всех доз гамма-облучения от группы всех сроков воздействия ИМП при значении р < 0.017.

 

Средняя частота хроматидных аберраций при гамма-облучении в дозах 0.05–0.5 Гр составила 8.8 ± 1.2%; частота хромосомных аберраций – 0.5 ±0.3%; геномных – 0.13 ± 0.13%. При гамма-облучении в дозах 1.0–5.0 Гр частота всех типов аберраций была существенно больше: частота хроматидных аберраций составила 19.0 ± 1.8%; частота хромосомных аберраций – 3.9 ± 0.8%; частота геномных – 2.6 ± 0.7%.

Результаты однофакторного дисперсионного анализа показали, что значения средних статистически значимо отличаются в трех группах (ИМП; гамма-облучение в дозах 0.05–0.5 Гр; гамма-облучение в дозах 1.0–5.0 Гр) (H = 7.2; p = 0.03). Попарное сравнение методом Манна – Уитни показало, что они были обусловлены различиями частоты аберраций в группе ИМП и гамма-облучения в дозе 1.0–5.0 Гр, для хроматидных аберраций значение p = 0.03; для хромосомных аберраций – p =0.02; для геномных аберраций – p = 0.03. Но с учетом поправки Бонферрони в этих группах не было выявлено статистически значимого отличия, как и при сравнении группы ИМП и гамма-облучения в дозах 0.05–0.5 Гр: частота хроматидных (p = 0.2), хромосомных (p = 0.5) и геномных аберраций (p = 0.6).

3. Анализ влияния исследуемых факторов на частоту клеток с микроядрами

Распределение величины частоты клеток с аберрациями статистически значимо отличалось от нормального: W₍₄₇₎ = 0.71; p < 0.001. При анализе частоты клеток с микроядрами в группе ложного воздействия было выявлено, что этот показатель составляет 0.09 ± 0.03%. Частота клеток меристемы проростков с микроядрами ни в одной из экспериментальных групп после воздействия ИМП статистически значимо не отличалась от группы ложного воздействия (табл. 5).

 

Таблица 5. Частота клеток с микроядрами в меристеме проростков семян лука Allium cepa L.

Экспериментальные группы	Условия эксперимента	Кол-во подсчитанных клеток	Частота клеток с микроядрами, %
1	Ложное воздействие	10898	0.09 ± 0.03
2	ИМП, 1 с	9362	0.2 ± 0.04
3	ИМП, 10 с	10312	0.06 ± 0.02
4	ИМП, 30 с	8961	0.1 ± 0.03
5	ИМП, 60 с	9620	0.1 ± 0.04
6	ИМП, 5 мин	7459	0.1 ± 0.04
7	ИМП, 30 мин	10107	0.2 ± 0.04
Среднее для всех групп ИМП	ИМП, все cроки	55821	0.1 ± 0.04
8	γ-облучение, 0.05 Гр	11274	0.05 ± 0.02
9	γ-облучение, 0.1 Гр	12372	0.3 ± 0.05*
10	γ-облучение, 0.5 Гр	9197	0.3 ± 0.06*
11	γ-облучение, 1.0 Гр	11274	2.2 ± 0.1*
12	γ-облучение, 3.0 Гр	11738	2.2 ± 0.1*
13	γ-облучение, 5.0 Гр	8618	2.0 ± 0.2*
Среднее для всех групп гамма-облучения	γ-облучение, все дозы	64473	1.2 ± 0.1*

Примечание. * – статистически значимое отличие от группы контроля при значении р ≤ 0.05, ** – статистически значимое отличие всех доз гамма-облучения от группы всех сроков воздействия ИМП при значении р < 0.017.

 

Гамма-излучение приводило к повышению частоты клеток с микроядрами. Статистически значимые отличия частоты клеток с микроядрами регистрировались при радиационном воздействии 0.1 Гр (χ² = 12.4; p < 0.001) и больше. При дозе 1 Гр частота клеток с микроядрами достигала 2.2 ± 0.1%, и далее с увеличением дозы γ-облучения в наших экспериментах показатель существенно не менялся.

При проведении регрессионного анализа зависимости частоты клеток меристемы с микроядрами через 24 ч после гамма-облучения в дозах до 5 Гр было выявлено, что линейная модель (рис. 2) удовлетворительно описывает данную зависимость (R² = 0.41; F = 21.3; p < 0.001).

 

Рис. 2. Линейная модель зависимости частоты клеток с микроядрами от поглощенной дозы облучения

 

Обсуждение результатов

Широкое распространение применения технологий, связанных с использованием ИМП в медицине, материаловедении, научных исследованиях, требует прояснения механизмов действия этого физического фактора (Wahab, 2007; Tkalec, 2009; Yalçın, Erdem, 2012). Несмотря на успехи в этом направлении, остается очень много вопросов (Sarraf et al., 2020). Одним из подходов к изучению биологического действия ИМП может быть сравнение его эффектов с действием хорошо изученных физических факторов, например ионизующего излучения. Одним из удобных и эффективных биологических объектов для изучения действия физических факторов являются клетки растений, в частности Allium cepa L. Аллиум-тест является одним из очень эффективных инструментов оценки генотоксического действия различных факторов (Evseeva et al., 2005; Kumar et al., 2020; Pryakhin et al., 2020).

Изменение митотической активности клеток меристемы можно рассматривать как интегральный показатель воздействия исследуемых факторов на клеточный цикл. На основании полученных результатов делают вывод о митотоксическом или митостимулирующем действии изучаемого фактора (Прохорова и др., 2003). В то же время известно, что снижение величины МИ ниже 50% от контрольной величины (порог цитотоксичности) может привести к сублетальному эффекту для организма (Panda et al., 1985). Также большое значение имеет процентное соотношение клеток, находящихся в различных фазах митоза. Данные показатели нужны для выявления возможных отклонений в продолжительности стадий митоза и регулярности прохождения клеточного цикла.

В наших экспериментах величина митотической активности клеток меристемы в корнях проростков семян лука после воздействия ИМП во всех экспериментальных группах достоверно увеличивалась в диапазоне от 9.3 до 12.6%, что на 14–55% больше по сравнению с группой ложного воздействия. Однако говорить о митозостимулирующем действии на пролиферацию в данном случае преждевременно, так как повышение МИ, как обсуждалось в работах (Калаев и др., 2003; Удалова и др., 2016), может быть связано с задержкой на стадии G2/M, что проявлялось в повышении профазного индекса в наших экспериментах, который во всех группах с воздействием ИМП статистически значимо был выше, чем в группе ложного воздействия.

Похожие эффекты в виде увеличения МИ были выявлены при действии малых доз ионизирующего излучения на клетки меристемы корня лука. Так, при внешнем γ-облучении луковиц A. cepa в дозах 0.1 и 0.2 Гр было обнаружено стимулирующее действие на митотическую активность ионизирующего излучения (Синовец и др., 2009). В наших экспериментах также было выявлено статистически значимое увеличение показателя МИ при облучении проростков семян в дозах 0.05; 0.5; 1.0; 5.0 Гр. Такие изменения происходили так же, как и при воздействии ИМП, преимущественно за счет увеличения длительности профазы.

В наших экспериментах ИМП приводило к повышению частоты клеток в ана-телофазе с аберрациями: статистически значимое увеличение показателя было зарегистрировано в группах с воздействием ИМП в течение 10 с, 60 с, 5 мин и 30 мин. Полученные данные указывают на то, что ИМП с несущей частотой 1.8 МГц, частотой повторения импульсов 28 кГц, индукцией МП 75 мТл в импульсе обладает генотоксическим эффектом. При этом регрессионный анализ показал отсутствие зависимости частоты клеток с аберрациями от времени воздействия ИМП. Таким образом, ИМП, независимо от длительности воздействия (от 10 с до 30 мин), приводит к повышению частоты клеток с аберрацией в среднем на 57% по сравнению с ложным воздействием.

В ряде работ также были выявлены генотоксические эффекты ИМП при воздействии на клетки грибов и животных. Исследования на животных показали, что электромагнитные поля могут оказывать генотоксическое воздействие и приводить к значительному увеличению повреждения ДНК у крыс после воздействия магнитных полей с частотой 60 Гц и магнитной индукцией 10 Тл в течение 24 или 48 часов (Singh, Lai, 1998). Импульсные магнитные поля при длительном воздействии (частота – 25 Гц, магнитная индукция в импульсе – 1.5 мТл, при воздействии 8 ч/сут в течение 16 сут) приводило к увеличению спонтанной деградации ДНК геномной ДНК дрожжей (López-Díaz et al., 2014).

Гамма-облучение в наших экспериментах приводило к четкой линейной зависимости частоты клеток с аберрациями от дозы. Следует отметить, что генотоксические эффекты ИМП в наших экспериментах были сопоставимы с генотоксическими эффектами острого гамма-облучения в дозах 0.05–0.5 Гр (p = 0.25).

В работах С. А. Гераськина (Geras’kin et al., 2007) и А. А. Удаловой (Удалова и др., 2016) было показано, что взаимосвязь между частотой аберрантных клеток в меристеме проростков ячменя и поглощенной дозой является нелинейной. Начиная с дозы гамма-облучения 0.05 Гр до 0.5 Гр, частота клеток с аберрациями была резко увеличена и в этом диапазоне была одинаковой, не зависела от дозы; этот участок авторы обозначили как “плато”; в дальнейшем с увеличением дозы гамма-облучения частота клеток с ХА линейно увеличивалась с увеличением дозы гамма-облучения (Oudalova et al., 2002; Geras’kin et al., 2007). Результаты, полученные в наших экспериментах по изучению влияния гамма-излучения на частоту клеток с аберрациями в клетках меристемы лука, не противоречат этим данным. Авторы объясняют плато в диапазоне от 0.05 до 0.5 Гр эффективной системой адаптивного ответа и конститутивной репликативной репарацией.

В наших экспериментах одинаковый уровень частоты аберраций при воздействии ИМП (в диапазоне от 10 с до 30 мин), напоминающий “плато” в зависимости дозы – эффект, выявленная в эксперименте С. А. Гераськина (Geras’kin et al., 2007), позволяет предположить, что ИМП, гамма-облучение в дозах 0.05–0.5 Гр и, возможно, другие неблагоприятные факторы индуцируют в клетках растения неспецифическую, одинаковой степени выраженности реакцию, которая сопровождается и повреждением ДНК, и включением адаптационных систем репарации. Так, в работе было показано, что электрические поля и ИМП могут индуцировать в клетках оксидативный стресс (Panagopoulos et al., 2021).

Для сравнения механизмов действия ИМП и гамма-облучения был проведен анализ спектра аберраций, регистрируемых в аллиум-тесте. В группах воздействия ИМП основной вклад в спектр нарушений вносили хроматидные аберрации. Следует отметить, что данные эффекты ИМП в наших экспериментах были сопоставимы с действием острого гамма-облучения в дозах 0.05–0.5 Гр. При сравнении показателей в группах ИМП и гамма-облучения в дозах 0.05–0.5 Гр не было выявлено статистически значимых отличий частоты хроматидных (p = 0.2), хромосомных (p = 0.5) и геномных (p = 0.6) аберраций. Эти результаты не противоречат высказанной выше гипотезе о том, что ИМП и малые дозы ИИ индуцируют в клетках оксидативный стресс.

Анализ частоты клеток в меристеме с микроядрами является широко используемым приемом при проведении аллиум-теста (Синовец, 2009; Bolsunovsky et al., 2018). Микроядра в клетках формируются в результате повреждения ДНК или как следствие геномной нестабильности (Ильинских и др., 1992; Sommer et al., 2020). Механизмы формирования микроядер хорошо известны и описаны в литературе (Fenech, Morley, 1985; Sommer et al., 2020). Основными механизмами являются: формирование микроядер из ацентрических фрагментов хромосом (Ильинских и др., 1992; Цховребова и др., 2017); нарушение расхождения хромосом в результате дисфункции центромер, кинетохор, веретена деления (Sommer et al., 2020); дицентрический разрыв хромосом (Fenech et al., 2011); нестабильность хромосом (Terradas et al., 2009); агрегирование двойных мини-хромосом (Кисурина-Евгеньева и др., 2016, Sommer et al., 2020). Воздействие радиации вызывает образование в том числе двунитевые разрывы ДНК, что в дальнейшем проявляется в возникновении клеток с микроядрами (Terradas et al., 2009).

В наших экспериментах, вероятнее всего, повышение частоты клеток с микроядрами при воздействии гамма-излучения было связано с формированием микроядер из фрагментов хромосом или отстающих хромосом в клетках, которые на момент облучения находились на стадии S/G2 клеточного цикла и которые за 24 ч после облучения успели пройти митоз.

Частота клеток с микроядрами после воздействия ИМП статистически значимо не отличалась от значения показателя в группе ложного воздействия. Эти данные соответствуют результатам анализа частоты хромосомных и геномных аберраций: во всех группах воздействия ИМП не было выявлено статистически значимого изменения этих типов аберраций. Наши результаты не противоречат данным, полученным в работе С. Б. Редди (Reddy et al., 2010), которые не выявили изменений частоты клеток с микроядрами в полихроматофильных эритроцитах периферической крови и костного мозга у мышей, подвергшихся воздействию ИМП. Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что ИМП приводит к повышению частоты хроматидных аберраций и не вызывает изменений частоты хромосомных и геномных аберраций, которые могут реализовываться в повышении частоты клеток с микроядрами (Цховребова и др., 2017).

Заключение

Воздействие ИМП на клетки меристемы проростков семян лука, как и гамма-излучение, приводило к увеличению профазного индекса, что в свою очередь было связано с увеличением митотического индекса. Полученные нами результаты позволяют полагать, что ИМП (несущая частота – 1.8 МГц, частотой повторения импульсов – 28 кГц, длительность импульса по уровню 0.7 равной 2.7 мкс с индукцией магнитного поля в месте расположения биологических объектов 75 мТл) так же, как и гамма-облучение, может вызывать задержку клеточного цикла в сверочной точке G2/M.

ИМП приводит к повышению частоты клеток меристемы проростка семян лука на стадии ана-телофазы с аберрациями (при воздействии в течение 10 с, 60 с–30 мин) в среднем на 80%. По выраженности этот эффект в наших экспериментах был аналогичен эффекту гамма-облучения в дозах 0.05–0.5 Гр.

В группах воздействия ИМП основной вклад в спектр нарушений вносили хроматидные аберрации и в меньшей степени хромосомные аберрации и геномные. ИМП по спектру генотоксических эффектов было сопоставимо с эффектами гамма-облучения в дозах 0.05–0.5 Гр и отличалось от эффектов гамма-облучения в дозах 1.0–5.0 Гр.

ИМП не приводило к повышению частоты клеток с микроядрами, что, вероятно, связано с преобладанием хроматидного типа аберраций при таком воздействии, которые не приводят к образованию микроядр. По этому показателю ИМП отличалось от эффектов гамма-облучения, которое приводило к повышению частоты клеток с микроядрами при облучении в дозах больше 0.1 Гр.

Высказано предположение, что ИМП приводит к индукции в клетках оксидативного стресса, сопровождающегося остановкой клеточного цикла в сверочной точке (G2/M) и индукции повреждений ДНК, реализующихся в виде хроматидных аберраций при проведении аллиум-теста. ИМП по индукции такого оксидативного стресса похоже на действие малых доз ионизирующего излучения.

Финансирование

Работа выполнена при поддержке Российского фонда содействия развитию. Фундаментальные исследования, проект №. 19-52-40003.

Этическое одобрение и согласие участвовать

Эта работа не содержит каких-либо исследований с участием человека и тематика животных.

Конфликт интересов

Авторы данной работы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Sobre autores

A. Aldibekova

Urals Research Center for Radiation Medicine

Autor responsável pela correspondência
Email: albinaaes@gmail.com
Rússia, st. Vorovskogo, 68a, Chelyabinsk, 454141

E. Styazhkina

Urals Research Center for Radiation Medicine; Chelyabinsk State University

Email: albinaaes@gmail.com
Rússia, st. Vorovskogo, 68a, Chelyabinsk, 454141; st. Bratiev Kashirinykh, 129, Chelyabinsk, 454001

G. Tryapitsyn

Urals Research Center for Radiation Medicine; Chelyabinsk State University

Email: albinaaes@gmail.com
Rússia, st. Vorovskogo, 68a, Chelyabinsk, 454141; st. Bratiev Kashirinykh, 129, Chelyabinsk, 454001

E. Pryakhin

Urals Research Center for Radiation Medicine

Email: albinaaes@gmail.com
Rússia, st. Vorovskogo, 68a, Chelyabinsk, 454141

Bibliografia

Arquivos suplementares