Extracellular vesicles secreted by the ТНР-1 cells influence on the inflammation gene expression in zebrafish

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Системное воспаление представляет собой сложную реакцию организма в ответ на серьезные повреждающие факторы, такие как обширные травмы, инфекции, хирургические вмешательства, ишемические и реперфузионные повреждения и др. Несмотря на то что развитие системной воспалительной реакции направлено на защиту организма, формирующийся нерегулируемый цитокиновый шторм способен вызвать массивный воспалительный каскад, приводящий к нарушению функций многих органов или даже к смерти [1–3]. Выраженность эффектов цитокинов, а также их направленность (протективная или повреждающая) связана, в первую очередь, со степенью дисбаланса про- и противовоспалительных факторов. При этом важнейшими оказываются дистантные эффекты цитокинов. Так, фактор некроза опухолей α (TNFα), интерлейкин-1 (IL-1), IL-6, воздействуя на центр терморегуляции, вызывают повышение температуры тела с лихорадкой, стимулируют продукцию лейкоцитов в костном мозге, усиливают продукцию белков острой фазы (С-реактивный белок и др.) клетками печени и т. д. [4]. Вместе с тем возможны и негативные эффекты цитокинов: высокий уровень TNF приводит к снижению сердечного выброса, повышению проницаемости сосудов, усилению тромбообразования, метаболическим нарушениям, связанным с изменением резистентности к инсулину, и т. д. [4–6]. Таким образом, дисбаланс цитокинов является одним из наиболее важных патогенетических звеньев развития системного воспалительного ответа (СВО). Гиперпродукция провоспалительных цитокинов оказывается важнейшей составляющей фазы первичного флогогенного удара СВО [7]. Считается, что в этих процессах ключевую роль играет врожденная иммунная система и активность ее клеток (моноцитов, макрофагов, нейтрофилов и т. д.) [5]. Вместе с тем продуцентами провоспалительных цитокинов могут выступать клетки других органов и тканей (эндотелиоциты, кардиомиоциты, гепатоциты и т. д.). При этом, вне зависимости от того, в каком органе было инициировано воспаление, происходит вовлечение отдаленных органов, что получило название компартментализации воспаления [8].

Таким образом, вопросы, связанные с регуляцией цитокинового шторма и компартментализации воспаления, оказываются очень важными в изучении патогенеза СВО. Поскольку на начальных этапах формирования системного воспаления ведущая роль отводится клеткам врожденной иммунной системы и, в первую очередь, клеткам моноцитарно-макрофагального ряда, то традиционно используемой моделью является культура клеток THP-1 (human leukemia monocytic cell line – моноцитоподобная клеточная линия), полученная от пациента с острым моноцитарным лейкозом [9]. В литературе описаны разные варианты активации ТНР-1 клеток, например, форбол-миристат-ацетат (phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), фактор некроза опухолей, перекись водорода, инфицирование микроорганизмами и др. [10, 11], при этом для дальнейшей поляризации в направлении M1 (классически активированных) макрофагов используют интерферон γ (IFNγ) и липополисахарид (ЛПС), а для поляризации в M2 (альтернативно активированные) макрофаги – интерлейкин-4 (IL-4) и интерлейкин-13 (IL-13) [12, 13].

В настоящее время большое внимание уделяется внеклеточным везикулам как инструменту регуляции активности клеток, межклеточных взаимодействий, а также компартментализации воспаления [14–16]. В зависимости от своего происхождения внеклеточные везикулы могут нести различные клеточные компоненты, включая мРНК, микроРНК, длинные некодирующие РНК, ДНК, метаболиты, белки и липиды [17, 18], и влиять на активность как соседних, так и отдаленных клеток, потенциально вызывая системные эффекты [18].

Традиционно, говоря о внеклеточных везикулах, по размеру объектов и механизмам их формирования выделяют три группы: экзосомы, микровезикулы и апоптотические тельца. Последние имеют размеры от 50 до 5000 нм (чаще баланс смещен в сторону более крупных объектов) и образуются в результате программируемой клеточной гибели. Экзосомы от 30 до 150 нм в диаметре образуются путем внутреннего отпочкования от пограничной мембраны ранних эндосом, которые во время этого процесса созревают в мультивезикулярные тельца. Поскольку экзосомы образуются внутри клетки, вне зависимости от их клеточного происхождения, они оказываются насыщенными вспомогательными белками – Alix, TSG101, HSC70, HSP90β [19]. Собственно внеклеточные везикулы (микровезикулы) имеют размеры 100–1000 нм в диаметре и образуются путем отпочкования от плазматической мембраны клетки. В результате они содержат белки, ассоциированные с цитозолем и плазматической мембраной (например, тетраспанины) [20]. Уникальность микровезикул заключается в том, что они обладают способностью упаковывать активный груз (белки, нуклеиновые кислоты и липиды) и доставлять его в другую клетку, соседнюю или отдаленную, а также изменять функции клетки-реципиента при его доставке [19, 20].

В настоящее время все больше исследований, моделирующих патологические состояния, проводят на маленьких тропических пресноводных рыбах Danio rerio. Они имеют более 70% общих генов-ортологов с Homo sapiens, в частности, гены, участвующие в органоспецифических генетических программах регуляции пролиферации, воспаления и т. д. [21]. Это предопределяет возможность использования рыб для изучения различных патологических процессов и заболеваний человека [22, 23].

Таким образом, исследование механизмов регуляции воспаления является важным для понимания патогенеза системного воспалительного ответа, а рыбы Danio rerio представляются удобной моделью для изучения участия внеклеточных везикул в регуляции и компартментализации СВО. Цель работы: изучить регуляторное влияние внеклеточных везикул, продуцированных активированными моноцитоподобными клетками линии THP-1, на уровень экспрессии генов воспаления в органах рыб Danio rerio.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Дизайн исследования представлен на рис. 1. На первом этапе для получения различных популяций внеклеточных везикул осуществляли активацию моноцитоподобных клеток линии ТНР-1 посредством воздействия различных стимулов. После чего проводили фенотипическую характеристику внеклеточных везикул, секретируемых клетками THP-1. Полученные внеклеточные везикулы вводили в целомическую полость рыбам Danio rerio и по истечении суток проводили биобанкирование жизненно важных органов (печень, сердце и мозг). На следующем этапе оценивали уровень органной экспрессии генов провоспалительных и противовоспалительных цитокинов.

 

Рис. 1. Дизайн исследования.

 

Получение и характеристика внеклеточных везикул

В работе использовали культуру опухолевых моноцитоподобных клеток линии ТНР-1 (“Российская коллекция клеточных культур института цитологии РАН”, Россия), которую культивировали в питательной среде RPMI-1640 (“Биолот”, Россия) с добавлением L-глутамина (“Биолот”, Россия), 50 мкг/мл сульфата гентамицина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Hyclone, США) по стандартной методике в СО₂-инкубаторе (при 37°C и 5% СО₂) со сменой культуральной среды каждые 3 дня согласно протоколу, описанному ранее [24, 25].

Для получения популяций внеклеточных везикул 200 мкл суспензии клеток в концентрации 1 × 10⁵ переносили в лунки 96-луночного планшета (Sarstedt, Германия) и активировали посредством воздействия стимулами: фактором некроза опухоли (TNF) (Biolegend, Калифорния, США) в конечной концентрации 10 и 20 нг/мл или форбол-12-миристат-13-ацетатом (PMA) (Sigma Aldrich, Миссури, США) в конечной концентрации 16 и 50 нг/мл. В качестве контроля в среду вносили раствор DPBS (р-р Дульбекко без Ca и Mg, “Биолот”, Россия). ТНР-1 клетки культивировали в течение 24 ч в стандартных условиях [24, 25]. Внеклеточные везикулы получали методом последовательного центрифугирования, для чего суспензию клеток осаждали в течение 20 мин при 330g, далее надосадочную жидкость двукратно центрифугировали в течение 20 мин при 1500g и однократно – при 3000, каждый раз удаляя осадок. Надосадок пропускали через фильтр Millex с диаметром пор 800 нм (Merck-Millipore, Массачусетс, США). Далее концентрирование внеклеточных везикул производили посредством центрифугирования надосадка 30 мин при 16 000g. В результате надосадок удаляли, а осадок ресуспендировали в 100 мкл DPBS без Ca и Mg (“Биолот”, Россия).

Иммунофенотипирование ВВ проводили с использованием следующих моноклональных антител, конъюгированных с флюорофорами: anti-CD54-PE (Beckman Coulter, Калифорния, США), Annexin V-FITC (Biolegend, Калифорния, США), anti-CD14-KromeOrange (Beckman Coulter, Калифорния, США), anti-CD9-PE/Cy7 (Beckman Coulter, Калифорния, США), anti-CD63-APC (Beckman Coulter, Калифорния, США) согласно протоколу, опубликованному ранее [26–28]. Анализ осуществляли на проточном лазерном цитометре CytoFLEX S (Beckman Coulter, Калифорния, США), оснащенном фиолетовым (405 нм), голубым (488 нм), красным (638 нм) и желто-зеленым (561 нм) лазерами, с помощью программной среды Cytexpert 2.4 (Beckman Coulter, Калифорния, США) и Kaluza 2.1 (Beckman Coulter, Калифорния, США). Калибровку и настройку прибора проводили с использованием стандартных калибровочных частиц известного размера от 100 до 1000 нм (Cytometry Sub-Micron Particle Size Reference Kit, Molecular probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Массачусетс, США). Начальный сигнал регистрировали по каналу бокового светорассеяния с фиолетового лазера, по которому применяли дискриминатор. Исследование объектов проводили по соответствующим каналам флуоресценции. Гейты строили на основании контрольных образцов, включающих только моноклональные антитела, внесенные в PBS. Для анализа логически формировали единую популяцию объектов, позитивных хотя бы по одному из использованных маркеров. Данные с проточного цитометра представляли в виде количества положительных событий в микролитре, а также удельного веса позитивных событий по таргетному маркеру, выраженному в процентах. Все контроли, в том числе контроль наличия мембран с использованием детергентов, контроль ложноположительных и ложноотрицательных результатов, были выполнены в соответствии с требованиями MISEV2018 [29–31]. Для исключения эффекта наложения использовали разведения образцов 1:100. Показатель получали в результате проведенных исследований серий последовательных разведений.

Исследование размеров внеклеточных везикул и их дисперсности оценивали с использованием метода динамического рассеяния света на приборе Nanolink SZ902M (Linkoptik, Китай). Исследование проводили при следующих параметрах: температура – 25°C, рефрактерный индекс растворителя – 1.330, позиция измерения – 4.65 мм, аттенюатор – 0. Исследование проводили в трех повторах по 100 с в каждом. Для анализа полученных результатов использовали программное обеспечение Linkoptik Ver. 2.0.0.7. Образцы внеклеточных везикул оценивали по параметрам размеров объектов (peak size, nm), средняя Z (average Z, nm), индекс полидисперсности (polydispersity index – PdI), стандартное отклонение (St. deviation, nm).

Определение белкового состава исследуемых ВВ осуществляли методом вестерн-блот. Разделение белков проводили методом SDS-PAGE гель-электрофореза. Образцы предварительно прогревали 5 мин при 95°C в буфере Laemmli sample buffer (Bio-Rad, Калифорния, США), содержащим 2-меркаптоэтанол (Bio-Rad, Калифорния, США). В качестве стандарта молекулярных масс использовали PageRuler^TM (Thermofisher Scientific, Массачусетс, США). В качестве положительного белкового контроля использовали лизат клеток THP-1 (THP-1 total). После прохождения электрофореза разделенные белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Bio-Rad, Калифорния, США) в течение 1 ч при постоянном напряжении 100 В. Для контроля переноса белков мембрану окрашивали Ponseau S (Thermofisher Scientific, Массачусетс, США). После переноса мембрану промывали Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST) буфером и блокировали в 5%-ном растворе молока в 1х TBST буфере в течение 90 мин при комнатной температуре. После чего мембрану инкубировали с первичными антителами HSP70 (D69) Antibody 4876 (1:1000), CD9 (D8O1A) Rabbit mAb 13174 (1:1000) (Cell Signaling Technology, Массачусетс, США) в течение ночи при 4°C, далее после отмывки в TBST буфере с вторичными антителами Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody 7074 (1:2000) (Cell Signaling Technology, Массачусетс, США) в течение 1 ч при комнатной температуре. Для визуализации использовали проявитель SuperSignal^TM (Thermofisher Scientific, Массачусетс, США). Снимки мембран осуществляли с помощью системы гель-документации Fusion FX Vilber Lourmat.

Исследование размера и концентрации ВВ проводили с использованием технологии анализа траектории наночастиц (Nanoparticle tracking analysis – NTA) с видеофиксацией в течение 60 с в режиме равномерной потоковой подачи на приборе NanoSight NS300 (Malvern Panalytical, UK). Для каждого образца выполняли 5 технических повторов. Полученные изображения оценивали визуально с использованием программного обеспечения NTA 3.4 NanoSight (Malvern Panalytical, UK). Анализ проводили в диапазонах размерности объектов 30–150 и 150–400 нм, результаты представляли в виде количества частиц в миллилитре.

Дизайн эксперимента in vivo

Протокол эксперимента был одобрен Комиссией по контролю содержания и использования лабораторных животных НМИЦ им. В. А. Алмазова (выписка № 8 из протокола № 22-8/1 от 31 августа 2022 г.).

Исследование эффектов внеклеточных везикул проводили на рыбах Danio rerio обоего пола в возрасте 4–5 месяцев. Животных содержали в стандартных условиях: светотемновой режим 14:10, кормление готовыми рационами Tetra mini granules 2 раза в сутки, температура воды 28.0°C с рН 6.8–7.4.

Всего было сформировано семь групп рыб: 1-я группа – контроль (рыбы интактные, без введения препарата); 2-я группа – DPBS (введение раствора DPBS); 3-я группа – V_NA (введение ВВ, секретированных неактивированными клетками THP-1); 4-я группа – V_PMA1 (введение ВВ, секретированных клетками THP-1 после активации PMA в концентрации 16 нг/мл); 5-я группа – V_PMA2 (введение ВВ, секретированных клетками THP-1 после активации PMA в концентрации 50 нг/мл); 6-я группа – V_TNF1 (введение ВВ, секретированных клетками THP-1 после активации TNF в концентрации 10 нг/мл); 7-я группа – V_TNF2 (введение ВВ, секретированных клетками THP-1 после активации TNF в концентрации 20 нг/мл). В каждую группу было включено не менее 10 рыб.

Во всех случаях интрацеломическую инъекцию образца в объеме 2 мкл осуществляли в состоянии медикаментозного сна, достигаемого путем помещения рыбы в анестезирующий раствор (пропофол 2.5 мг/л + лидокаин 50 мг/л). Использовали микроинъектор InjectMan 4 (Eppendorf, Великобритания) и одноразовые боросиликатные стеклянные капилляры с филаментной нитью (O.D. 1.5 mm, I.D. 0.86 mm) (Sutter instrument, Калифорния, США). После манипуляций каждую рыбу помещали в индивидуальный аквариум с добавлением метиленового синего. Спустя сутки рыб подвергали эвтаназии передозировкой пропофола (25 мг/л). Препаровку проводили стерильным микрохирургическим инструментом с использованием стереоскопического микроскопа (АО “ЛОМО”, Россия) и забирали внутренние органы (печень, мозг, сердце). Полученный материал помещали в отдельные стерильные пробирки, содержащие 800 мкл реагента ExtractRNA (“Евроген”, Россия), замораживали и хранили при –80°C до последующего использования.

Выделение тотальной РНК

Выделение тотальной РНК из тканей печени, мозга и сердца проводили с использованием реагента ExtractRNA (“Евроген”, Россия) согласно инструкции производителя. Кратко, к замороженным образцам добавляли дополнительно 200 мкл ExtractRNA, гомогенизировали пипетированием, инкубировали 40 мин при комнатной температуре и центрифугировали 10 мин при 13 000 g при комнатной температуре. После центрифугирования 1 мл супернатанта отбирали в чистые пробирки и добавляли 200 мкл хлороформа с последующей инкубацией в течение 5 мин при комнатной температуре. Далее образцы центрифугировали 15 мин при 13 000 g при 4°C. К верхней фазе добавляли 1 мкл голубого гликогена и 500 мкл изопропанола, перемешивали и оставляли при –20°C на ночь. Далее центрифугировали 15 мин при 13 000 g при 4°C, осадок промывали дважды 75%-ным этиловым спиртом (центрифугировали 5 мин при 20 000 g при 4°C). Осадок сушили на льду до полного испарения спирта и элюировали в 15 мкл свободной от нуклеаз воде. Качество и количество выделенной тотальной РНК оценивали с помощью спектрофотометра NanoDrop 1000 UV Visible Spectrophotometer (Thermofisher Scientific, Массачусетс, США).

Обратная транскрипция

Обратную транскрипцию осуществляли с использованием 500 нг выделенной тотальной РНК, 20 мкМ случайного праймера (“Евроген”, Россия) и фермента MMLV RT kit (“Евроген”, Россия) при 37°C в течение 60 мин согласно протоколу производителя. Синтезированную кДНК хранили при –80°C.

Оценка уровня экспрессии генов

Относительный уровень экспрессии генов il-1β, il-6, tnf-α, ifn-γ, mpeg1.1, mpeg1.2, mpx и il-10 в клетках органов рыб Danio rerio определяли методом ПЦР в реальном времени, как описано ранее [32]. Последовательности праймеров исследованных генов представлены в дополнительных материалах, таблица S1. ПЦР в реальном времени проводили с использованием набора реагентов qPCRmix-HS SYBR+LowROX (“Евроген”, Россия) согласно протоколу производителя. ПЦР осуществляли на приборе LightCycler 480 (“Roche”, Швейцария) при следующих условиях: 45 циклов 95°C в течение 15 с, 60°C в течение 30 с, 70°C в течение 30 с. Для анализа ПЦР использовали программное обеспечение к амплификатору LightCycler^®480 Software version 1.5.1.62 SP3 (Roche, Швейцария). Детекция накопления флуоресцентного сигнала проводилась на стадии элонгации в каждом цикле амплификации. Пороговый цикл (Ct) для каждого образца определяли на основании цикла, при котором кривая флюоресценции пересекала пороговую линию. Пороговая линия, представляющая собой фоновый уровень флюоресценции, рассчитывалась программным обеспечением. В качестве референсного гена для нормализации данных использовали ген домашнего хозяйства eef1a1|1 [32]. Для относительной количественной оценки экспрессии генов использовали метод 2^–ΔΔCt. Выбросы значений 2^–ΔΔCt определяли с помощью метода ROUT (Q = 5%) и исключали из дальнейшего анализа.

Статистический анализ

Статистическую обработку результатов выполняли с использованием программы GraphPad Prism 8.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Результаты представлены в виде медианы и интерквартильного размаха (Ме (25; 75). Различия между группами рассчитывали с помощью непараметрического U-критерия Манна – Уитни. Корреляционные связи между изучаемыми показателями определяли с помощью критерия Спирмена. Различия считали достоверными при р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Характеристика образцов внеклеточных везикул

Все образцы ВВ продемонстрировали умеренную полидисперсность при исследовании методом динамического рассеяния света (рис. 2, а, б). Образцы ВВ, продуцируемые клетками THP-1 при стимуляции TNF, имели наибольшие размеры, тогда как образцы ВВ, полученные в результате стимуляции клеток PMA, имели наибольший диапазон размерности (примерно до 110 нм и пиком, приходящимся на 36 нм).

 

Рис. 2. Характеристика внеклеточных везикул, секретируемых клетками THP-1. Размер внеклеточных везикул (а) и дисперсность (б), оцененные по результатам использования метода динамического рассеяния света. Результаты вестерн-блот анализа (в), выполненного с антителами к белку теплового шока 70 (HSP70) и мембранному гликопротеину семейства тетраспанинов CD9. Обозначения: V_NA – ВВ, секретируемые неактивированными клетками THP-1; V_РМА2 – ВВ, секретируемые клетками THP-1 при стимуляции РМА в концентрации 50 нг/мл; V_TNF2 – ВВ, секретируемые клетками THP-1 при стимуляции TNF в концентрации 20 нг/мл; THP-1 total – лизат клеток.

 

При исследовании концентраций ВВ методом NTA достоверных отличий между образцами выявлено не было (рис. 3). При анализе везикул в разных диапазонах размерностей были выявлены следующие закономерности. Достоверных различий в размерах внеклеточных везикул, а также в концентрациях частиц в диапазоне 150–400 нм при использовании разных стимулов не наблюдалось как в сравнении с контролем, так и между собой. Достоверные различия были выявлены при сравнении частиц в диапазоне размеров 30–150 нм. Так, было отмечено увеличение концентрации внеклеточных везикул, продуцируемых клетками THP-1 при стимуляции TNF в дозах 10 и 20 нг/мл, а также PMA в дозах 16 и 50 нг/мл по сравнению с таковыми, продуцированными нестимулированными клетками (р < 0.01).

 

Рис. 3. Средние размеры и концентрация ВВ, секретируемых клетками ТНР-1, рассчитанные по результатам анализа траектории наночастиц в диапазонах 30–150 и 150–400 нм: а – таблица размер/концентрация продуцируемых внеклеточных везикул в диапазоне 30–150 и 150–400 нм; б – графики размер/концентрация ВВ, секретируемых THP-1 клетками при активации TNF и PMA в разных концентрациях. Обозначения: V_NA – ВВ, секретируемые неактивированными клетками THP-1; V_РМА1 – ВВ, секретируемые клетками THP-1 при стимуляции РМА в концентрации 16 нг/мл; V_РМА2 – ВВ, секретируемые клетками THP-1 при стимуляции РМА в концентрации 50 нг/мл; V_TNF1 – ВВ, секретируемые клетками THP-1 при стимуляции TNF в концентрации 10 нг/мл; V_TNF2 – ВВ, секретируемые клетками THP-1 при стимуляции TNF в концентрации 20 нг/мл.

* p < 0.05 – достоверность отличий с группой V_NA.

 

Качественный состав продуцированных под воздействием различных активаторов ВВ оценивали посредством фенотипирования методом высокочувствительной проточной лазерной цитометрии (рис. 4). Уровень Annexin V-позитивных ВВ был достоверно повышен во всех образцах, полученных от активированных клеток по сравнению с таковыми от неактивированных. Количество CD54+ ВВ было достоверно повышено в образцах ВВ, полученных при активации THP-1 клеток обоими стимулами во всех дозировках. При этом в большей степени уровень CD54-позитивных событий был повышен в образцах, полученных посредством активации клеток TNF в дозах 10 и 20 нг/мл. Во всех образцах ВВ после активации клеток обоими стимулами был отмечен повышенный уровень CD9+ и CD63+ объектов по сравнению с образцами от неактивированных клеток.

 

Рис. 4. Иммунофенотипирование внеклеточных везикул, секретируемых клетками THP-1, исследованные методом высокочувствительной проточной лазерной цитометрии. Репрезентативные двухпараметровые псевдоцветные графики результатов иммунофенотипирования – с anti-CD54-PE и Annexin V-FITC антителами (a); с anti-CD63-APC и anti-CD9-PE/Cy7 антителами (б); в – концентрации позитивных по маркерам внеклеточных везикул. Результаты представлены в количестве событий в мкл, Ме (25; 75). Обозначения групп аналогичны рис. 3.

* p < 0.05 – достоверность отличий с группой V_NA.

 

Вестерн-блот анализ продемонстрировал, что во фракции внеклеточных везикул присутствовал везикулярный мембранный маркер CD9 и маркер внутреннего содержимого – белок теплового шока 70 (HSP70) (рис. 2, в).

Органная экспрессия генов

Мозг. В образцах мозга рыб Danio rerio оценивали изменения относительного уровня экспрессии восьми генов, кодирующих семь провоспалительных (il-1β, il-6, tnf-α, ifn-γ, mpeg1.1, mpeg1.2, mpx) и один противовоспалительный (il-10) цитокин. Введение раствора DPBS в целомическую полость рыб (группа DPBS) в качестве контроля реакции на проведение манипуляции вызывало достоверное увеличение уровня экспрессии генов il-1β (р = 0.04), tnf-α (р = 0.04), mpeg1.1 (р = 0.01) и mpeg1.2 (р = 0.04) по сравнению с интактными рыбами (контрольная группа) (рис. 5, таблица S2).

 

Рис. 5. Относительная экспрессия генов il-1β (а), il-6 (б), il-10 (в), tnf-α (г), ifn-γ (д), mpx (е), mpeg1.1 (ж), mpeg1.2 (з) в образцах мозга рыб Danio rerio исследуемых групп: Control – интактные рыбы; DPBS – инъекция раствора DPBS; V_NA – инъекция ВВ, секретируемых неактивированными клетками THP-1; V_РМА1 – инъекция ВВ, секретируемых клетками THP-1 при стимуляции РМА в концентрации 16 нг/мл; V_РМА2 – инъекция ВВ, секретируемых клетками THP-1 при стимуляции РМА в концентрации 50 нг/мл; V_TNF1 – инъекция ВВ, секретируемых клетками THP-1 при стимуляции TNF в концентрации 10 нг/мл; V_TNF2 – инъекция ВВ, секретируемых клетками THP-1 при стимуляции TNF в концентрации 20 нг/мл.

Синий цвет – достоверные отличия между группами Control и DPBS при р < 0.05.

Черный – достоверные отличия между группой DPBS и группами V_NA, V_РМА1, V_РМА2, V_TNF1, V_TNF2 при р < 0.05.

Зеленый цвет – достоверные отличия между группами V_РМА1 и V_РМА2 при р < 0.05.

Красный цвет – достоверные отличия между группами V_TNF1 и V_TNF2 при р < 0.05.

 

Введение ВВ приводило к достоверному снижению уровня экспрессии гена il-1β (рис. 5, a) в группах V_NA (р = 0.05), V_PMA1 (р < 0.01), V_PMA2 (р < 0.01) и V_TNF1 (р < 0.01); к снижению экспрессии гена ifn-γ в группах V_NA (р = 0.04), V_PMA2 (р = 0.04) и V_TNF1 (р = 0.02) (рис. 5, д); к снижению экспрессии гена mpeg1.1 в группах V_NA (р = 0.04), V_PMA2 (р < 0.01) и V_TNF1 (р = 0.01) (рис. 5, ж); гена tnf-α в группах V_PMA1 (р = 0.04) и V_TNF1 (р = 0.02) (рис. 5, г) и гена mpeg1.2 в группах V_NA (р = 0.01) и V_PMA1 (р < 0.01) (рис. 5, з) по сравнению с таковыми в группе DPBS.

ВВ, секретируемые THP-1 клетками под воздействием TNF в дозах 10 нг/мл (группа V_TNF1) и 20 нг/мл (группа V_TNF2), обладали разнонаправленными эффектами на экспрессию гена IL-1β (рис. 5, a) по отношению к таковому в группе DPBS. Под воздействием ВВ в группе V_TNF1 отмечалось снижение уровня экспрессии гена, в то время как в группе V_TNF2 – повышение.

ВВ, полученные при активации клеток одинаковым стимулом, но в разных дозах, демонстрировали достоверные отличия в уровне экспрессии генов в мозге. Так, у рыб в группе V_TNF2 был повышен уровень экспрессии генов il-1β (p = 0.04), il-10 (p = 0.02) и ifn-γ (p = 0.02) по сравнению с таковым в группе V_TNF1, а в группе V_PMA2 – уровень экспрессии гена mpeg 2.2 (p = 0.02) по сравнению с группой V_PMA1 (см. рис. 5).

Корреляционный анализ выявил положительные связи между уровнями экспрессии генов в группе контроля (рис. 6, a); в группе V_NA (рис. 6, в); в группах V_PMA1 (рис. 6, г), V_TNF1 (рис. 6, д) и V_TNF2 (рис. 6, е). Отрицательная корреляция наблюдалась только в группе V_PMA1 между уровнями экспрессии генов il-1β и mpeg1.2.

 

Рис. 6. Тепловая карта корреляции между относительной экспрессией генов в образцах мозга рыб Danio rerio внутри каждой исследуемой группы. Представлены группы рыб только с достоверными корреляциями (р < 0.05): a – е – группы рыб, обозначения которых аналогичны рис. 5. Полоса цветовой шкалы показывает диапазон коэффициента корреляции (r). Красный цвет обозначает высокую положительную корреляцию, уменьшающуюся до синей полосы, которая представляет отрицательную корреляцию.

 

Сердце. В ткани сердца рыб Danio rerio оценивали изменения относительного уровня экспрессии шести генов, кодирующих пять провоспалительных (il-1β, il-6, tnf-α, ifn-γ, mpeg1.1) и один противовоспалительный (il-10) цитокин (рис. 7, таблица S3).

 

Рис. 7. Относительная экспрессия генов il-1β (а), il-6 (б), il-10 (в), tnf-α (г), ifn-γ (д), mpeg1.1 (е) в образцах сердца рыб Danio rerio исследуемых групп. Достоверные отличия между группами при р < 0.05. Обозначения групп рыб аналогичны рис. 5.

 

Под воздействием манипуляции в группе DPBS отмечали увеличение экспрессии генов il-1β (p < 0.01) (рис. 7, a), il-6 (p = 0.02) (рис. 7, б), il-10 (p < 0.01) (рис. 7, в) и tnf-α (p = 0.02) по сравнению с контрольной группой интактных рыб (рис. 7, г).

Введение ВВ приводило к достоверному снижению уровня экспрессии генов il-10 (см. рис. 7, в) в группе V_PMA2 (р < 0.01) и увеличению в группе V_TNF2 (р = 0.02); к снижению экспрессии гена tnf-α (см. рис. 7, г) в группах V_PMA1 (р = 0.03) и V_TNF1 (р = 0.01) и к снижению экспрессии гена mpeg1.1 (рис. 7, е) в группе V_TNF1 (р = 0.04) по сравнению с группой DPBS.

Инъекции ВВ в группах V_TNF1 и V_TNF2 оказывали разнонаправленные эффекты относительно группы DPBS на экспрессию генов il-1β, il-6, il-10. Везикулы группы V_TNF1 приводили к снижению уровня экспрессии, в то время как везикулы V_TNF2 – к повышению. Аналогичную закономерность можно отметить у ВВ из групп V_PMA1 и V_PMA2 в отношении экспрессии генов il-6 и il-10 (см. рис. 7).

Вводимые ВВ, полученные от одинаковых стимулов, но в разных дозах демонстрировали достоверные отличия в эффектах на уровень экспрессии генов в сердце. В группе V_TNF2 был повышен уровень экспрессии генов il-1β (p < 0.01), il-6 (p < 0.01), il-10 (p < 0.01), tnf-α (p = 0.04), mpeg1.1 (p = 0.03) по сравнению с таковыми в группе V_TNF1; в группе V_PMA2 уровень экспрессии гена il-10 был достоверно ниже, чем в группе V_PMA1 (p < 0.01).

Корреляционный анализ выявил положительную связь только в группе V_NA между уровнем экспрессии генов il-1β и tnf-α; отрицательная связь – в группе V_NA между ifn-γ и il-6 и в группе DPBS между ifn-γ и il-10 (рис. 8). В остальных группах V_PMA1, V_PMA2, V_TNF1 и V_TNF2 взаимосвязи между экспрессией генов цитокинов обнаружено не было.

 

Рис. 8. Тепловая карта корреляции между экспрессией генов в образцах сердца рыб Danio rerio. Представлены группы рыб только с достоверными корреляциями (р < 0.05): а – в – группы рыб, обозначения которых аналогичны рис. 5. Полоса цветовой шкалы показывает диапазон коэффициента корреляции (r). Красный цвет обозначает высокую положительную корреляцию, уменьшающуюся до синей полосы, которая представляет отрицательную корреляцию.

 

Печень. В образцах печени рыб Danio rerio оценивали изменения относительного уровня экспрессии восьми генов, кодирующих семь провоспалительных (il-1β, il-6, tnf-α, ifn-γ, mpeg1.1, mpeg1.2, mpx) и один противовоспалительный (il-10) цитокин (рис. 9, таблица S4).

 

Рис. 9. Относительная экспрессия генов il-1β (а), il-6 (б), il-10 (в), tnf-α (г), ifn-γ (д), mpx (е), mpeg1.1 (ж), mpeg1.2 (з) в образцах печени рыб Danio rerio исследуемых групп. Достоверные отличия между группами при р < 0.05. Обозначения групп рыб аналогичны рис. 5.

 

При введении раствора DPBS в образцах печени в отличие от образцов мозга и сердца не наблюдали изменения уровня экспрессии ни одного из исследованных генов по сравнению с интактными рыбами. Инъекция ВВ, полученных от неактивированных клеток, в группе V_NA приводила к достоверному увеличению экспрессии генов il-6 (р = 0.03) (рис. 9, б), mpx (р = 0.02) (рис. 9, е) и mpeg1.1 (р = 0.03) (рис. 9, ж) в сравнении с группой DPBS. В группе V_TNF2 отмечено достоверное повышение экспрессии генов il-1β (p = 0.02), il-6 (p = 0.03), il-10 (p = 0.02) и mpx (p = 0.03); в группах V_PMA1 и V_PMA2 – снижение экспрессии гена il-10 (p = 0.01 и p = 0.03 соответственно) по сравнению с таковыми в группе DPBS.

Разнонаправленными эффектами на экспрессию генов в печени обладали везикулы групп V_TNF1 и V_TNF2 в отношении il-1, il-6, il-10, а также везикулы групп V_PMA1 и V_PMA2 в отношении гена ifn-γ.

В группах V_TNF1 и V_TNF2 в ответ на введение ВВ в образцах печени наблюдали достоверно различающиеся эффекты на уровень экспрессии генов il-1β (p < 0.01), il-10 (p = 0.01), ifn-γ, mpх (p = 0.02) и mpeg1.2 (р = 0.02). Достоверно различающие- ся эффекты были отмечены в группах V_PMA1 и V_PMA2 в отношении гена ifn-γ (p = 0.04).

Корреляционный анализ выявил положительную связь в группе DPBS между уровнем экспрессии генов tnf-α и mpx; в группе V_PMA2 – между il-1β и mpeg1.2 (рис. 10); отрицательная корреляция была установлена в группе V_PMA1 между tnf-α и mpeg1.2, и в группе V_TNF2 – между mpx и mpeg1.2. В контрольной группе, а также в группах V_NA и V_TNF1 взаимосвязи между экспрессией генов про- и противовоспалительных цитокинов обнаружено не было.

 

Рис. 10. Тепловая карта корреляции между экспрессией генов в образцах печени рыб Danio rerio. Представлены группы рыб только с достоверными корреляциями (р < 0.05); а – д – группы рыб, обозначения которых аналогичны рис. 5. Полоса цветовой шкалы показывает диапазон коэффициента корреляции (r). Красный цвет обозначает высокую положительную корреляцию, уменьшающуюся до синей полосы, которая представляет отрицательную корреляцию.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Проводимые с рыбой Danio rerio манипуляции (наркоз, временное извлечение из водной среды, пункция брюшной стенки, интрацеломическое введение DPBS) могут являться триггером активации продукции провоспалительных цитокинов в отдаленных органах. Так, было показано увеличение экспрессии генов il-1β и tnf-α в мозге и сердце, il-6 и il-10 в сердце, а также mpeg1.1 и mpeg1.2 в мозге после интрацеломической инъекции DPBS по сравнению с интактными рыбами. Это демонстрирует ответ иммунной системы на проводимые манипуляции и соотносится с имеющимися представлениями о возможном развитии системного воспаления в ответ на значительные повреждения и вмешательства, а также с дальнейшим вовлечением отдаленных органов в поддержание воспаления [33–35].

Мы продемонстрировали возможность оказывать влияние на выраженность реакций на проводимые манипуляции на модели рыб Danio rerio посредством внеклеточных везикул, секретируемых активированными клетками THP-1. Было показано, что инъекция ВВ в целомическую полость рыб приводила к изменению профиля экспрессии генов, кодирующих семь провоспалительных (il-1β, il-6, tnf-α, ifn-γ, mpx, mpeg1.1, mpeg1.2) и один противовоспалительный (il-10) цитокин, в отдаленных органах, таких как печень, сердце и мозг. Наблюдаемые изменения уровня экспрессии генов цитокинов после введения ВВ могут говорить об их системном воздействии на организм рыб Danio rerio.

Экзогенные внеклеточные везикулы могут присутствовать в кровотоке от нескольких минут до нескольких часов [36]. Их выведение из циркуляции, скорее всего, связано с задержкой и поглощением в органах-мишенях, причем скорость выведения и распределение по органам может в значительной степени зависеть от клеточного происхождения и состава везикул. Например, исследование биораспределения эритроцитарных ВВ показало поглощение печенью (44,9%), костями (22,5%), кожей (9,7%), мышцами (5,8%), селезенкой (3,4%), почками (2,7%) и легкими (1,8%) [37]. ВВ, полученные из клеток злокачественных опухолей простаты, почек, мочевого пузыря, при экспериментальном введении в кровоток распределялись по органам по-разному, в зависимости от вида опухоли (рак простаты: легкие > печень > мозг; рак почки: мозг > легкие > печень; рак мочевого пузыря: легкие > печень > мозг). При этом поглощение экзосом другими органами, кроме легких, печени, головного мозга и селезенки, не было отмечено [38]. В нашем исследовании оценка эффектов введенных везикул оценивалась через сутки после инфузии, что можно считать достаточным для их распределения по органам и реализации возможного эффекта.

Ранее Golnaz Morad et al. продемонстрировали распределение экзосом в организме рыб Danio rerio после их внутрисердечной инъекции [39]. С помощью покадровой визуализации авторы наблюдали процессы трансцитоза объектов в нервную ткань, при этом целостность гематоэнцефалического барьера сохранялась, а его проницаемость для других компонентов крови не увеличивалась. В исследовании in vivo на мышиной модели William A. Banks et al. показали, что вводимые экзосомы способны проникать через гематоэнцефалический барьер [40]. В нашем исследовании была использована фракция микровезикул, обладающая определенной полидисперсностью с включением в свой состав объектов менее 100 нм в диаметре. При этом был отмечен эффект на уровень экспрессии генов цитокинов в клетках головного мозга, что в совокупности с литературными данными может указывать на проходимость исследуемых объектов через гематоэнцефалический барьер.

Модуляция нейровоспаления основана на способности микроглии и моноцитов/макрофагов взаимодействовать и проявлять два противоположных типа реагирования – по фенотипу М1 или фенотипу М2. Как результат, обеспечивается баланс цитотоксических и протективных эффектов в клетках центральной нервной системы [41]. Внеклеточные везикулы, являясь важным инструментом межклеточных взаимодействий и обладая возможностью преодолевать гематоэнцефалический барьер, могут обеспечивать рекрутирование макрофагов в мозг, усугубляя патологический статус [42]. Ранее было показано, что продуцируемые макрофагами ВВ, перенося провоспалительные цитокины, например IL-1β, к астроцитам и нейрональным клеткам, способны вызывать нейровоспаление [43]. Кроме того, продуцируемые макрофагами ВВ способны оказывать влияние на скорость проведения нейроимпульса. Причем эффект отличался у везикул, полученных от М0, М1 и М2 макрофагов [44].

Клетки как врожденного, так и адаптивного иммунитета способны продуцировать внеклеточные везикулы. При этом их функция будет в значительной мере связана с типом клеток [16]. В настоящем исследовании была использована линия моноцитоподобных клеток THP-1, традиционно считающейся релевантной моделью моноцитов/макрофагов. Известно, что внеклеточные везикулы последних обладают различными функциями. Так, они вызывают обусловленную воспалением программированную клеточную гибель гладкомышечных клеток посредством переноса функциональной пироптотической каспазы-1 [45]. Макрофагальные ВВ могут индуцировать дифференцировку наивных моноцитов в макрофаги [46]. Кроме того, эти везикулы содержат микроРНК miR-223, являющуюся важным регулятором пролиферации и дифференцировки миелоидных клеток, а также несут в своем составе молекулы главного комплекса гистосовместимости (MHC II) и костимуляторные молекулы, что позволяет им участвовать в презентации антигена [47].

В данном исследовании продемонстрировано, что внеклеточные везикулы, полученные от клеток ТНР-1, активированных РМА и TNF в разных дозах, обладали различными иммуномодулирующими свойствами в организме рыб Danio rerio. Инъекция ВВ, секретируемых клетками ТНР-1 при воздействии TNF в концентрации 10 нг/мл и PMA в концентрациях 16 и 50 нг/мл, приводила к снижению экспрессии генов провоспалительных цитокинов (il-1β, ifn-γ, tnf-α, mpx, mpeg1.1 и mpeg1.2) в печени, сердце и мозге рыб Danio rerio. Подобные изменения свидетельствуют о потенциальных противовоспалительных эффектах, использованных ВВ.

Также было установлено, что активация клеток ТНР-1 воздействием TNF в концентрациях 10 и 20 нг/мл оказывала дозозависимый эффект на свойства секретируемых этими клетками везикул. Так, внеклеточные везикулы, полученные от клеток ТНР-1, активированных обработкой 20 нг/мл TNF, приводили к большему увеличению экспрессии генов il-10 и il-1β в печени, сердце и мозге по сравнению с таковым от везикул, полученных от дозы TNF 10 нг/мл. Кроме того, достоверно отличался уровень экспрессии генов il-6 в сердце и mpx в печени. В отношении эффектов от везикул, полученных при стимуляции клеток разными дозами PMA, были выявлены достоверные отличия между уровнями экспрессии генов mpeg1.2 в мозге, il-10 в сердце и ifn-γ в печени.

Интересно, что в ряде случаев были отмечены разнонаправленные эффекты ВВ, полученных при использовании разной дозы стимула TNF. В частности, ВВ в группе V_TNF1 вызывали снижение экспрессии il-1β в мозге и сердце, в то время как V_TNF2 – повышение. Аналогичный эффект был в отношении il-10 в сердце и печени, а il-6 – в сердце. Полученные результаты свидетельствуют о том, что под воздействием различных видов стимулов, а также различных доз активаторов, моноцитоподобные клетки продуцируют везикулы, качественно отличающиеся между собой, что приводит к разным эффектам при их инъекции в организм рыб Danio rerio. Эффекты ВВ связаны с составом переносимого ими груза, который может значительно различаться и включать нуклеиновые кислоты, липопротеиды, цитокины, ферменты и т. д. [16, 19, 36, 48]. При этом качественный состав ВВ разного клеточного происхождения зависит от клетки-продуцента [27, 36]. Мало того, Schindler V. с соавторами было показано, что эпителиальные клетки бронхов в одинаковых условиях продуцировали различные по размеру, уровню экспрессии тетраспанинов на поверхности, а также по переносимому набору микроРНК внеклеточные везикулы апикальной и базальной частями клеток [49]. Таким образом, характеристика продуцируемых везикул зависит не только от клеточного происхождения, влияния активаторов или блокаторов, но и от пространственной организации и области самой клетки, где происходит синтез экзосом или микровезикул.

Везикулы, продуцированные клетками THP-1 после стимуляции всеми использованными активаторами, имели преимущественно меньшие размеры, чем таковые от нестимулированных клеток. Кроме того, полидисперсность объектов увеличивалась в направлении неактивированные клетки – стимуляция TNF – стимуляция PMA. Размерность везикул является важным фактором, напрямую связанным с биогенезом объектов и, соответственно, с принадлежностью их к экзосомам или микровезикулам. При этом биологической активностью в отношении регуляции воспаления могут обладать обе категории внеклеточных везикул [16, 50]. Кроме того, несколько больший размер объектов, а также большее содержание аннексин V-позитивных объектов может быть признаком присутствия в образцах V_TNF2 апоптотических телец, которые также обладают высокой биологической активностью [51].

В образцах ВВ, полученных от стимулированных клеток (TNF и PMA), был более высокий уровень CD9+ и CD63+ объектов, т. е. несущих тетраспаниновые рецепторы, по сравнению с таковым от нестимулированных клеток. Кроме того, в образцах, полученных при стимуляции TNF, отмечалось повышенное содержание CD54-позитивных событий. Таким образом, морфология и качественный состав использованных в исследовании внеклеточных везикул различались в образцах в зависимости от использованных активаторов.

CD54 является индуцибельным белком клеточной адгезии, который играет ключевую роль во взаимодействии эндотелия и лейкоцитов и регулирует сосудистую проницаемость. Кроме этого, CD54 используют в качестве маркера активации антигенпрезентирующих клеток [52], а экспрессирующие его внеклеточные везикулы являются активными участниками регуляции воспаления [50]. Ранее было показано, что уровень CD54+ объектов коррелирует со степенью повреждения головного мозга при инсульте [53], а также повышается при субарахноидальном кровотечении [54, 55].

Таким образом, внеклеточные везикулы, секретируемые клетками ТНР-1, обладают разным качественным составом в зависимости от способов активации клеток, способны оказывать влияние на экспрессию генов провоспалительных (il-1β, il-6, tnf-α, ifn-γ, mpeg1.1, mpeg1.2, mpx) и противовспалительных (il-10) цитокинов в тканях и органах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Внеклеточные везикулы, продуцируемые моноцитоподобными клетками THP-1 под воздействием различных стимулов, при интрацеломическом введении рыбам Danio rerio оказывают системный эффект, проявляющийся изменением экспрессии генов про- и противовоспалительных цитокинов в головном мозге, печени и сердце. В зависимости от вида и дозы использованного для активации стимула может меняться качественный состав продуцируемых везикул, что проявляется в силе и направленности детектируемых in vivo эффектов.

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 19-75-20076. https://rscf.ru/project/19-75-20076/

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ НОРМ

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Этическое одобрение. Протокол эксперимента был одобрен Комиссией по контролю содержания и использования лабораторных животных НМИЦ им. В. А. Алмазова (выписка № 8 из протокола № 22-8/1 от 31 августа 2022 г.).

About the authors

D. B. Sambur

Institution “Almazov National Medical Research Center”

Email: golovkin_a@mail.ru
Russian Federation, St. Petersburg

O. V. Kalinina

Institution “Almazov National Medical Research Center”

Email: golovkin_a@mail.ru
Russian Federation, St. Petersburg

A. D. Aquino

Institution “Almazov National Medical Research Center”

Email: golovkin_a@mail.ru
Russian Federation, St. Petersburg

P. V. Tirikova

Institution “Almazov National Medical Research Center”

Email: golovkin_a@mail.ru
Russian Federation, St. Petersburg

M. A. Migunova

Institution “Almazov National Medical Research Center”

Email: golovkin_a@mail.ru
Russian Federation, St. Petersburg

E. E. Koroleva

Institution “Almazov National Medical Research Center”

Email: golovkin_a@mail.ru
Russian Federation, St. Petersburg

A. S. Trulyov

Institution “Institute of Experimental Medicine”

Email: golovkin_a@mail.ru
Russian Federation, St. Petersburg

A. A. Rubinshtein

Institution “Almazov National Medical Research Center”; Institution “Institute of Experimental Medicine”

Email: golovkin_a@mail.ru
Russian Federation, St. Petersburg; St. Petersburg

I. V. Kudryavtsev

Institution “Almazov National Medical Research Center”; Institution “Institute of Experimental Medicine”

Email: golovkin_a@mail.ru
Russian Federation, St. Petersburg; St. Petersburg

A. S. Golovkin

Institution “Almazov National Medical Research Center”

Author for correspondence.
Email: golovkin_a@mail.ru
Russian Federation, St. Petersburg

References

Supplementary files