Получение колониеформирующих клеток из крови человека и оценка чистоты популяции методом проточной цитометрии

Колониеформирующие эндотелиальные клетки (ECFCs, КФЭК) – редкая популяция циркулирующих эндотелиальных клеток-предшественников (EPC), которая представляет интерес для тканевой инженерии, клеточной терапии и изучения патогенеза заболеваний, связанных с нарушением функции эндотелия. Реализация данных направлений подразумевает использование чистых культур эндотелиальных колониеформирующих клеток, которые могут быть получены из мононуклеарной фракции периферической крови человека. Достаточно точным методом оценки фенотипа и чистоты клеточной культуры может являться проточная цитометрия.

Цель данного исследования заключалась в том, чтобы получить популяцию колониеформирующих эндотелиальных клеток, и с помощью метода проточной цитометрии подтвердить фенотип и оценить чистоту популяции.

Для получения КФЭК использовали гепаринизированную донорскую кровь из периферической вены. Выделяли мононуклеарную фракцию на градиенте плотности Histopaque 1077. Полученные клетки культивировали в полной питательной среде EGM-2 MV c 5% FBS. На 11-е, 15-е и 18-е сутки культивирования клетки снимали трипсином, часть из которых отбирали для анализа на проточном цитометре, а оставшиеся переносили в планшет для дальнейшего культивирования до достижения 70%-ной конфлюентности. Фенотип полученных колоний оценивали с помощью метода проточной цитометрии. Пробоподготовку цельной периферической крови, мононуклеарной фракции и культуры клеток проводили по двум панелям флуорохром-меченых моноклональных антител. Методом фазово-контрастной микроскопии визуально оценивали рост колоний. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0.

До 9-х суток колонии клеток не были визуально обнаружены. При дальнейшем культивировании формировались разрастающиеся колонии типа «булыжной мостовой». С помощью проточной цитометрии детектировали две популяции: CD45⁺ и CD45^-. В ходе исследования было выявлено, что при увеличении длительности культивирования популяция CD45⁺ уменьшалась, а CD45^- прогрессивно увеличивалась, что может быть связано с постепенным вытеснением клеток гемопоэза эндотелиальными колониеформирующими клетками.

В результате нашего исследования, обнаруженная популяция CD45⁺ соответствовала фенотипу клеток линии гемопоэза, тогда как популяции CD45^- соответствовал эндотелиальный фенотип – CD31⁺CD309⁺vWF⁺CD146⁺. К 18-м суткам степень чистоты культуры составляла 97,6%.