Морфологические изменения в гиппокампе головного мозга крыс при ишемии и в условиях комбинированного прекондиционирования

Полный текст

ОБОСНОВАНИЕ

На протяжении последних десятилетий среди основных причин смертности и инвалидности в мире остается церебральная ишемия [1]. Один из эффективных способов повышения толерантности организма к гипоксии/ишемии, в том числе церебральной ишемии, — прекондиционирование. Прекондиционирование представляет собой способ мобилизации физиологических резервов организма под действием предварительных условий, таких как кратковременные и повторяющиеся эпизоды сублетальной ишемии или гипоксии [2, 3]. Инициировать прекондиционирование возможно лекарственными средствами различных фармакологических групп [4–8]. Однако по выраженности развития защитного эффекта фармакологическое прекондиционирование уступает физическим методам [9]. Вместе с тем фармакологические средства можно использовать для потенцирования эффекта физических методов прекондиционирования, что позволит уменьшить нагрузки физическими факторами [8–10]. Так, в наших экспериментальных исследованиях показано, что использование соединения пQ-4 в комбинации с умеренной гипобарической гипоксией значительно увеличивает выживаемость крыс при церебральной ишемии и снижает неврологический дефицит в постишемическом периоде [11].

Цель данного исследования состояла в оценке морфологических изменений в наиболее чувствительных к гипоксии полях гиппокампа CA1 и CA3 при ишемии головного мозга у крыс и в условиях моделирования ишемии после комбинированного фармакологически-гипоксического прекондиционирования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена на 38 белых крысах линии Вистар массой 200–230 г, полученных из филиала «Столбовая» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России. Исследования проводили в соответствии с Правилами лабораторной практики (приказ Минздрава России № 199н от 01.04.2016).

Метод комбинированного прекондиционирования (КПреК) включал поочередное применение двух прекондиционных факторов — фармакологического и гипоксического. В 1-й, 3-й и 5-й день эксперимента животным внутрибрюшинно вводили амтизол в дозе 25 мг/кг. Во 2-й, 4-й и 6-й день крыс подвергали умеренной гипобарической гипоксии (410 мм рт. ст., время экспозиции — 60 мин) [11, 12]. После заключительного сеанса КПреК крысам моделировали ишемию головного мозга под наркозом (8 % раствор хлоралгидрата в дозе 400 мг/кг) путем двусторонней перевязки общих сонных артерий. Экспериментальные животные были разделены на четыре группы: ложнооперированные с ишемией (группа с ишемией), две опытные группы КПреК с ишемией через час после прекондиционирования — ранний период (КПреК Иш через час) и через 48 ч после прекондиционирования — поздний период (КПреК Иш через 48 ч).

Степень повреждения головного мозга оценивали через сутки после операции с помощью морфометрии. Головной мозг фиксировали в 10 % нейтральном забуференном формалине. Готовили срезы головного мозга толщиной 5 мкм (3,8 ± 0,2 мм позади от брегмы [13]) после стандартной заливки в парафине, окрашивали гематоксилином и эозином и толуидиновым синим по методу Ниссля. Нормальные (неизмененные), обратимо поврежденные (гипохромные) и необратимо поврежденные нейроны — апоптотические (гиперхромные) и некротические клетки (клетки-тени) подсчитывали в полях гиппокампа CA1 и CA3 на увеличении ×400 (Carl Zeiss, Германия) в 10 неперекрывающихся полях зрения. Кроме того, аналогичным образом подсчитывали клетки микроглии и эндотелиоциты.

Статистический анализ полученных результатов проводили с помощью программы Stat Plus Pro 7.0.1.0. Для выявления различий между исследуемыми показателями в сравниваемых двух независимых выборок использовали критерий Манна – Уитни (U), а при сравнении большего количества независимых выборок — ранговый дисперсионный анализ Краскела – Уоллиса (H-критерий) (p ≤ 0,05). Описательная статистика по группам представлена в виде медианы (Me) и процентилей (Q₁; Q₃).

РЕЗУЛЬТАТЫ

При морфометрическом исследовании в гиппокампе головного мозга крыс с ишемией в сравнении с ложнооперированными животными наблюдались выраженные распространенные патоморфологические изменения через сутки после операции. У животных с ишемией нормальных пирамидных нейронов в полях гиппокампа CA1 и CA3 было крайне мало в отличие от поврежденных нейронов (H = 15,41; p = 0,002 и H = 21,68; p < 0,001 соответственно для полей), преимущественно некротических (табл. 1, рис. 1). Гипохромных нейронов в поле CA1 было меньше в сравнении с группой ложнооперированных животных (U = 14; p = 0,032), но их количество значимо не отличалось в поле CA3 (U = 32; p = 0,116). Преобладали морфологически измененные нейроны. Так, количество гиперхромных нейронов было значимо больше в обоих исследуемых полях гиппокампа в сравнении с ложнооперированной группой (U = 45,5; p = 0,042 для CA1 и U = 6,5; p = 0,038 для CA3). Кроме того, клеток-теней было значимо больше в сравнении с ложнооперированной группой в полях CA1 (U = 56; p = 0,001) и СА3 (U = 0; p = 0,002). Клеток нормальной макроглии в контроле с ишемией становилось значимо меньше в сравнении с ложнооперированным контролем в полях CA1 (U = 7,5; p = 0,017) и СА3 (U = 37; p = 0,022). В то же время не было выявлено статистически значимых различий в количестве клеток дистрофически измененной макроглии как в поле CA1 (U = 18; p = 0,247), так и в поле СА3 (U = 27; p = 0,391). Количество клеток микроглии, реактивности которой уделяют большое внимание при ишемических повреждениях головного мозга, увеличилось как в поле CA1 (U = 44; p = 0,05), так и в поле СА3 (U = 4,5; p = 0,018) в сравнении с группой ложнооперированных животных. Количество эндотелиоцитов через сутки после ишемии было меньше, чем в группе ложнооперированных крыс, в поле гиппокампа СA1 (U = 10; p = 0,037), а в поле гиппокампа CA3 не отличалось от ложнооперированных (U = 31; p = 0,153).

 

Таблица 1. Морфометрические изменения в гиппокампе при ишемии мозга и под действием прекондиционирования

Table 1. Morphometric changes in the hippocampus during cerebral ischemia and under preconditioning

Поле гиппокампа	Клетки	Группы животных
		ложнооперированные	ишемия	прекондиционирование с амтизолом + ишемия
				ранний период	поздний период
СА1	НН	19 (15,3; 28,6)	0 (0; 0)*	0 (0; 3,5)*	3 (0; 4)*
	ГН	8,2 (5,8; 12,7)	1 (0; 11)*	15,7 (12,6; 24,5)#	29 (22,7; 35)#
	ГРН	1,2 (0,3; 2,2)	16,5 (7,5; 18,5)*	2,2 (2; 2,8)#	0 (0; 0,2)#+
	К-Т	2 (1,6; 2,1)	20 (18,2; 28,2)*	15,8 (6; 18,0)*	14 (10,7; 14,5)*#
	МГН	17,5 (12,8; 26)	6 (1; 12)*	15 (12; 15)	9,5 (8; 11,5)*
	МГДИ	6,5 (4,7; 7,3)	3 (0,5; 8,2)	7,8 (6,3; 8,8)	7,5 (5,5; 8,0)
	МкГ	3,5 (2,3; 4)	12,5 (4; 20)*	3,8 (3,5; 4)	5,5 (4,5; 10)
	ЭЦ	11 (7,8; 14,1)	6 (3,7; 6,5)*	15 (12; 15,4)#	17 (13; 19)#
СА3	НН	23,7 (20; 26,2)	0 (0; 0,5)*	7,5 (3,3; 9,7)*#	8,5 (3,2; 26,5)#
	ГН	5,0 (4,2; 8,3)	0 (0; 4,2)	11,2 (8,7; 13,3)*#	13,5 (3,5; 30,5)#
	ГРН	2 (0,6; 3,3)	15 (11,2; 16,5)*	1,5 (0,6; 2)#	2 (1; 3)#
	К-Т	0 (0; 2,6)	27 (26,5; 28,5)*	8 (6,2; 13,5)*#	8 (4,7; 10,5)*#
	МГН	14,7 (11; 15,8)	6 (2,5; 8,7)*	11,2 (10,2; 11,8)#	8 (6,2; 14,7)
	МГДИ	5,2 (4,2; 5,8)	4,5 (2; 5,5)	8 (6,2; 9,7)*#	7 (4,2; 8)
	МкГ	2,5 (1,6; 3)	12 (7,7; 22,5)*	5,5 (5; 8,2)*	5,5 (4,7; 7)*#
	ЭЦ	7,2 (5,8; 10,1)	6 (4; 7)	14 (10,2; 17)*#	13 (12; 15,5)*#

Примечание. * — показатели [медиана (Q1; Q3)] статистически значимо отличаются от группы ложнооперированных (контроль), ^# — от группы контроля с ишемией, ⁺ — от группы комбинированного прекондиционирования с амтизолом в ранний период при р < 0,05; U-критерий Манна – Уитни. НН — нормальные нейроны; ГРН — гиперхромные нейроны; ГН — гипохромные нейроны; К-Т — клетки-тени; МГН — макроглия нормальная; МГДИ — макроглия дистрофически измененная; МкГ — микроглия; ЭЦ — эндотелиоцит.

Note: *, indices [median (Q₁; Q₃)] are significantly different from the sham-operated group (control); ^#, from the control group with ischemia; ⁺, from the group of combined preconditioning with amtisol in the early period at p < 0.05; Mann–Whitney U-criterion. НН — normal neurons; ГРН — hyperchromic neurons; ГН — hypochromic neurons; К-Т — shadow cells; МГН — normal macroglia; МГДИ — dystrophically altered macroglia; МкГ — microglia; ЭЦ — endotheliocyte.

 

Рис. 1. Зоны СА1 (a, c, e) и СА3 (b, d, f) полей гиппокампа головного мозга крысы с моделированной ишемией. Гистоархитектоника прослеживается нечетко, клеточность резко снижена, выраженный перицеллюлярный отек, очаги деструкции в ткани головного мозга. В обеих зонах нормальные нейроны отсутствуют, практически все нейроны гиперхромные, сморщенные, уменьшенные в размере, лишены отростков; определяются единичные резко набухшие клетки макроглии; капилляры не определяются; количество клеток микроглии максимально (e, f). Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение для a, b, c — ×200, для d — ×100, для e, f — ×400

 

При ишемии, моделируемой через час (ранний период) и 48 ч (поздний период) после КПреК с амтизолом (КПреК-Амт), наблюдались положительные морфологические изменения в полях гиппокампа СA1 и CA3 в сравнении с контролем с ишемией (см. табл. 1, рис. 2).

 

Рис. 2. Зоны СА1 (a, c) и СА3 (b, d) полей гиппокампа головного мозга крысы (комбинированное прекондиционирование с амтизолом, ранний период). Гистоархитектоника прослеживается, клеточность относительно сохранена, выраженный периваскулярный, а местами перицеллюлярный отек. В обеих зонах присутствуют единичные нормальные нейроны (больше в поле СА3), а также гиперхромные нейроны, в поле СА1 много клеток-теней и гипохромных нейронов; макроглия сохранена частично; капилляры определяются, но их эндотелий местами отсутствует; появляются единичные клетки микроглии. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение для a, b — ×200, для c, d — ×400

 

При сравнении четырех независимых выборок, а именно группы ложнооперированных животных, контроля с ишемией и двух опытных групп КПреК-Амт, было выявлено различие в количестве нормальных нейронов (для сравнения результатов в группах использован ранговый Н-критерий Краскела – Уоллиса — H = 87,4; df = 3; p < 0,001). Больше всего нормальных нейронов в поле гиппокампа СA1 наблюдалось в группе ложнооперированных животных, затем в поздний период прекондиционирования (группа КПреК-Амт Иш через 48 ч), затем в ранний период прекондиционирования (КПреК-Амт Иш через час), меньше всего их было в контрольной группе с ишемией. В поле гиппокампа СA3 отмечены аналогичные значимые различия в количестве нормальных нейронов в исследуемых группах (H = 54,7; df = 3; p < 0,001). При попарном сравнении количества сохраненных нормальных нейронов между группами (использован U-критерий Манна – Уитни) обнаружено, что в поле CA3 их количество значимо больше в сравнении с контролем с ишемией (U = 41,5; p = 0,030 и U = 5,0; p = 0,012 для КПреК-Амт Иш через час и КПреК-Амт Иш через 48 ч соответственно), а в поле СA1 значимых различий не наблюдалось.

В поле гиппокампа СA1 отмечены значимые различия в количестве гипохромных нейронов в исследуемых группах (H = 15,7; df = 3; p = 0,014). Больше всего обратимо поврежденных гипохромных нейронов выявлено в группе КПреК-Амт Иш через 48 ч, затем в группе КПреК-Амт Иш через час, затем у ложнооперированных животных, меньше всего — в контроле с ишемией. В поле гиппокампа СA3 больше всего гипохромных нейронов определялось в группе КПреК-Амт Иш через 48 ч, затем в группе КПреК-Амт Иш через час, затем в группе ложнооперированных крыс и очень мало в группе контроля с ишемией (H = 25,7; df = 3; p < 0,001). При попарном сравнении относительно большое количество гипохромных нейронов при сопоставлении с контролем с ишемией отмечено как для группы КПреК-Амт Иш через час в полях CA1 (U = 34,5; p = 0,05) и CA3 (U = 38,0; p = 0,015), так и для группы КПреК-Амт Иш через 48 ч в полях CA1 (U = 4,0; p = 0,008) и CA3 (U = 6,0; p = 0,018). Статистически значимых различий между этими опытными группами КПреК с амтизолом выявлено не было (U = 28; p = 0,317 для CA1 и U = 21; p = 0,715 для CA3).

В полях гиппокампа СA1 и СA3 наблюдались значимые различия в количестве гиперхромных нейронов в исследуемых группах (H = 33,1 и H = 30,1 соответственно для СA1 и СA3; df = 3; p < 0,001). Больше всего апоптотически измененных гиперхромных нейронов выявлено при ишемии, затем в группе КПреК-Амт Иш через час, затем в группе ложнооперированных животных, меньше всего — в группе КПреК-Амт Иш через 48 ч. При попарном сравнении обнаружено, что количество гиперхромных нейронов было значимо меньше в сравнении с контролем с ишемией в группе КПреК-Амт Иш через час только в поле CA3 (U = 0,5; p = 0,003); в группе КПреК-Амт Иш через 48 ч в обоих полях (U = 44,0; p = 0,012 для CA1 и U = 47,0; p = 0,004 для CA3); большее защитное действие против нейронального апоптоза оказывало КПреК-Амт, используемое за 48 ч до операции (U = 40,5; p = 0,005 для поля CA1) в сравнении с группой КПреК-Амт Иш через час.

Различия в количестве клеток-теней в исследуемых группах в поле гиппокампа СA1 носили значимый характер (H = 67,3; df = 3; p < 0,001). Больше всего их определялось в контроле с ишемией, затем в группе КПреК-Амт Иш через час, затем в группе КПреК-Амт Иш через 48 ч, меньше всего — в группе ложнооперированных животных. Такая же ранговость была отмечена для поля СA3 по количеству в нем клеток-теней в исследуемых группах (H = 69,2; df = 3; p < 0,001). Больше всего их было в контрольной группе с ишемией, затем в группе КПреК-Амт Иш через час, затем в группе КПреК-Амт Иш через 48 ч и очень мало в группе ложнооперированных (контроля). При попарном сравнении количество некротических нейронов — клеток-теней в группе КПреК-Амт Иш через час было меньше, чем в группе контроля с ишемией, только в поле CA3 (U = 2,0; p = 0,006), в группе КПреК-Амт Иш через 48 ч в обоих полях гиппокампа (U = 44,0; p = 0,012 для CA1 и U = 48,5; p = 0,002 для CA3).

В поле гиппокампа СA1 наблюдались значимые различия в количестве клеток макроглии нормальной в исследуемых группах (H = 33,5; df = 3; p < 0,001). Лучше всего она была сохранена у ложнооперированных животных, затем в группе КПреК-Амт Иш через час, затем в группе КПреК-Амт Иш через 48 ч, хуже всего — у животных с ишемией. В поле гиппокампа СA3 количество клеток неизмененной макроглии также значимо различалось в группах (H = 12,2; df = 3; p = 0,007). Она лучше была сохранена в группе ложнооперированных (контроля), затем в группе КПреК-Амт Иш через час, затем в группе КПреК-Амт Иш через 48 ч и хуже всего в группе с ишемией. При попарном сравнении количества клеток макроглии нормальной между группами статистически значимое различие выявлено только для группы КПреК-Амт Иш через час при сопоставлении с контрольной группой с ишемией в поле гиппокампа СA3 (U = 37; p = 0,022). При определении клеток макроглии дистрофически измененной значимых различий в исследуемых группах как в поле СA1 (H = 5,4; df = 3; p = 0,142), так и в поле СA3 (H = 11,3; df = 3; p = 0,103) выявлено не было.

В обоих полях гиппокампа отмечены значимые различия в количестве клеток микроглии в исследуемых группах (H = 17,4; df = 3; p = 0,006 для СA1 и H = 29,8; df = 3; p < 0,001 для СA3). Больше всего их обнаружено у крыс группы контроля с ишемией, меньше — в группе КПреК-Амт Иш через 48 ч, затем в группе КПреК-Амт Иш через час и меньше всего у ложнооперированных животных. При попарном сравнении количества клеток микроглии установлено, что в опытной группе КПреК-Амт Иш через час количество клеток микроглии не отличалось от количества клеток микроглии в группе ложнооперированных животных (U = 29,5; p = 0,477), но в то же время не было статистически значимо меньше в сравнении с контролем с ишемией (U = 12,5; p = 0,224) для поля гиппокампа СA1, было больше для поля гиппокампа СA3 в сравнении с группой ложнооперированных животных (U = 4; p = 0,024) и значимо не отличалось от контроля с ишемией (U = 11; p = 0,153). В опытной группе КПреК-Амт Иш через 48 ч количество клеток микроглии было значимо меньше в сравнении с контролем с ишемией для поля гиппокампа СA3 (U = 21; p = 0,03), для поля гиппокампа СA1 таких изменений не обнаружено (U = 18,5; p = 0,443).

В полях гиппокампа СA1 и СA3 наблюдались значимые различия в количестве эндотелиоцитов в исследуемых группах (H = 31; df = 3; p < 0,001 для СA1 и H = 34,2; df = 3; p < 0,001 СA3). Больше всего эндотелиоцитов определено в группе крыс КПреК-Амт Иш через 48 ч, затем в группе КПреК-Амт Иш через час, затем у ложнооперированных животных, меньше всего (больше погибало) — в группе контроля с ишемией. В опытной группе КПреК-Амт Иш через час количество эндотелиоцитов было значимо больше в сравнении с контролем с ишемией в поле СА1 (U = 4,5; p = 0,018), в поле СА3 эндотелиоцитов было больше как в сравнении с контролем с ишемией (U = 2; p = 0,006), так и в сравнении с ложнооперированными животными (U = 6; p = 0,045). Схожие результаты получены и для опытной группы КПреК-Амт Иш через 48 ч. Так, в поле гиппокампа СА1 количество эндотелиоцитов было значимо больше в сравнении с контролем с ишемией (U = 0; p = 0,001), а в поле СА3 — значимо больше как в сравнении с контролем с ишемией (U = 0; p = 0,001), так и в сравнении с ложнооперированными животными (U = 6; p = 0,032).

Таким образом, КПреК (амтизол в сочетании с умеренной гипобарической гипоксией) положительно влияют на морфометрические показатели в полях гиппокампа СА1 и СА3 головного мозга крыс после моделирования ишемии. Полученные результаты свидетельствуют о том, что КПреК с амтизолом оказывает нейропротекторное действие, увеличивая выживаемость нейронов в ранний и поздний периоды моделирования ишемии, препятствуя образованию некротически и апоптотически измененных нейронов, гиперактивации клеток микроглии и способствуя сохранению эндотелиоцитов. В действии КПреК на морфометрические показатели при ишемии следует отметить снижение гиперактивации микроглии, поскольку активация микроглии признана одним из ведущих патогенетических механизмов повреждения мозга и сопровождается структурно-функциональной перестройкой митохондрий, переходом на гликолитическую продукцию АТФ и гиперпродукцию активных форм кислорода [14–16].

Положительный эффект прекондиционных факторов на морфометрические показатели мозга при его ишемии полностью согласуется с ранее полученными нами результатами влияния данного метода КПреК на выживаемость животных в условиях гипоксии/ишемии, функциональную активность центральной нервной системы и неврологический дефицит, про-/антиоксидантный статус и активность биоэнергетических процессов в митохондриях головного мозга животных [10, 17–21].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Через сутки после моделирования ишемии головного мозга у крыс формируются значимые нейродегенеративные изменения диффузного характера с гибелью нейронов в высокочувствительных к ишемии отделах мозга, а именно пирамидных нейронов полей гиппокампа CA1 и СА3, сочетающиеся с уменьшением в них количества нормальной макроглии, эндотелиоцитов, а также с реактивной активацией микроглии. Некоторая вариабельность результатов между полями гиппокампа СА1 и СА3, вероятно, обусловлена тем, что разные поля гиппокампа неодинаково чувствительны к действию ишемии.

В ранний период прекондиционирования (моделирование ишемии через час после КПреК) в гиппокампе количество выживших нормальных нейронов возрастало, особенно в поле СA3. Гипохромных (обратимо поврежденных) нейронов становилось больше, чем в группе контроля. Лучше выживали клетки нормальной макроглии, меньше формировалось дистрофически измененной макроглии. Клеток микроглии насчитывалось меньше, чем в контроле с ишемией, что свидетельствует о меньшем повреждении клеток гиппокампа. Сохранялось количество эндотелиоцитов в обоих полях гиппокампа. В поздний период КПреК с амтизолом (моделирование ишемии через 48 ч) наблюдались схожие изменения, при этом по ряду клеточных показателей позднее КПреК продемонстрировало большую эффективность по сравнению с ранним.

Результаты морфометрического изучения гиппокампа убедительно свидетельствуют, что комбинированное фармакологически-гипоксическое прекондиционирование (амтизол + гипобарическая гипоксия) оказывает нейропротекторное действие при ишемии головного мозга.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

О.С. Левченкова, Ю.С. Корнева — написание статьи, анализ данных; В.Е. Новиков — рецензирование статьи, разработка общей концепции.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

ADDITIONAL INFORMATION

Authors contribution. Thereby, all authors made a substantial contribution to the conception of the study, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the article, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the study.

O.S. Levchenkova, Yu.S. Korneva — manuscript drafting, writing and pilot data analyses; V.E. Novikov — paper reconceptualization and general concept discussion.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Об авторах

В. Е. Новиков

Смоленский государственный медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: nau@sgmu.info
ORCID iD: 0000-0002-0953-7993
SPIN-код: 1685-1028

Профессор, доктор медицинских наук, заведующий кафедрой фармакологии

Россия, 214019, Смоленск, ул. Крупской, д. 28

О. С. Левченкова

Смоленский государственный медицинский университет

Email: os.levchenkova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-9595-6982
SPIN-код: 2888-6150

д-р. мед. наук, доцент

Россия, Смоленск

Ю. С. Корнева

Смоленский государственный медицинский университет

Email: nau@sgmu.info
ORCID iD: 0000-0002-8080-904X
SPIN-код: 5169-7740

канд. мед. наук, доцент

Россия, Смоленск

Список литературы

Дополнительные файлы