Возрастные различия лейкоцитарного состава крови обыкновенной гадюки Vipera berus (Reptilia: Serpentes: Viperidae)

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Разрушение биоразнообразия идет по трем основным компонентам: генам, видам и экосистемам (Бродский, Сафронова, 2017), что ведет к утрате биологических ценных ресурсов, к которым относят ядовитых змей. Эти пресмыкающиеся имеют важное значение в качестве ядопродуцентов для медицины. Все наземные ядовитые змеи фауны России относятся к гадюковым змеям (Ананьева, Орлов, 2005). В адаптации гадюковых змей к изменяющимся условиям среды, возникающим при воздействие экстремальных естественных и антропогенных факторов, самым непосредственным образом участвует ключевая гомеостатическая иммуногематологическая система, определяющая резистентность и устойчивость организма (Хайрутдинов, Соколина, 2010; Павлов, 2019; Романова и др., 2017). При значительном объеме исследований по экологической физиологии ограничены работы по возрастным особенностям системы крови (Павлов, 1998; Романова и др., 2018) и фрагментарны данные по анализу адаптивных реакций системы крови гадюковых змей разных локалитетов в зависимости от видовой, половой и возрастной принадлежности. Ранее проведенными исследованиями выявлены незначительные различия лейкоцитарного профиля крови самок и родившихся от них в условиях серпентария сеголетков гадюк Vipera berus berus (Linnaeus, 1758) и V. b. nikolskii Vedmederja, Grubant et Rudaeva, 1986 (Романова и др., 2018). Находясь в неволе, в условиях, значительно отличающихся от привычной среды обитания, дикие животные испытывают значительный стресс, и нам представляется актуальным провести сравнительный анализ приспособительной изменчивости важнейшей иммуногематологической системы организма сеголетков по сравнению с половозрелыми особями природной популяции гадюки обыкновенной.

Цель настоящей работы – сравнительный анализ лейкоцитарного профиля крови взрослых особей гадюки обыкновенной Vipera berus (Linnaeus, 1758), обитающих в естественных условиях лесопарковой городской зоны Самары, и молодых особей этого вида, родившихся в неволе.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Обыкновенных гадюк Vipera b. berus (Linnaeus, 1758) (62 особи: самцы – 26, самки – 36) из природной популяции отловили в Красноглинском районе г. Самара в 2014 – 2015 гг. В 2014 г. отловили 19 самцов и 30 самок, в 2015 г. – 7 и 2 соответственно. Беременные самки этой популяции (4 особи) были добыты 15 – 20 июля 2017 г., и в условиях серпентария Института экологии Волжского бассейна РАН (г. Тольятти) они принесли потомство (13 особей).

Для получения образцов крови животных обездвиживали путём захвата и делали пункцию верхнечелюстной вены для взятия крови и приготовления мазков. Дифференцированный подсчёт лейкоцитов проводили с иммерсией (×1500) после фиксации и окрашивания препаратов по Романовскому – Гимзе. С учетом морфологических особенностей определяли шесть типов лейкоцитарных клеток (в %): гранулоциты (гетерофилы, базофилы, эозинофилы) и мононуклеарные клетки (агранулоциты): азурофилы, моноциты, лимфоциты (Хайрутдинов, Соколина, 2010; Павлов, 2019; Campbell, 2006). На основании лейкоцитарной формулы крови были рассчитаны интегральные лейкоцитарные индексы (отн. ед): индекс сдвига лейкоцитов (ИСЛ); индекс соотношения лимфоцитов/эозинофилов (ИСЛЭ); индекс соотношения гетерофилов/эозинофилов (ИСГЭ); лимфоцитарно-гранулоцитарный индекс (ИЛГ); индекс соотношения гетерофилов/лимфоцитов (ИСГЛ).

Критериями согласия оценивали нулевую гипотезу о соответствии анализируемых показателей нормальному распределению. С учетом вида распределения центральные тенденции и рассеяние изученных показателей описывали медианой (Ме) и интерквартильным размахом (IQR) (значения 25-го и 75-го процентилей). Анализ данных проводили методами непараметрической статистики с расчетом критериев: медианного (82), Краскела – Уоллиса (H) (при сравнении нескольких независимых групп по одному признаку); Данна (z) (при попарном сравнении групп). Все расчеты, построение ординационных диаграмм проводили с использованием пакетов программ Microsoft Excel 2013, STATISTICA 8 (Реброва, 2006; Халафян, 2007). За величину уровня статистической значимости принимали α = 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Опубликованные данные по различию в составе лейкоцитов у самцов и самок обыкновенной гадюки из Пермского края неоднозначны (Воробьева, 2007; Ганщук и др., 2008). На наших выборках из лесопарковой городской зоны г. Самара статистически значимых половых различий по лейкоцитарному составу крови в 2014 и 2015 гг. мы не выявили (табл. 1).

 

Таблица 1. Лейкоцитарный состав периферической крови самцов и самок Vipera berus из г. Самара

Table 1. Leukocyte composition of the peripheral blood of males and females of Vipera berus from Samara Cit

Показатель лейкограммы / Leukogram indicators	Самцы / Males		Самки / Females		Критерий Манна - Уитни (и, р) / Mann- Whitney test (и, р)
	Me	IQR	Me	IQR
1	2	3	4	5	6
2014
Лейкоцитарная формула крови, % / WBC (white blood cells), %
Гетерофилы / Heterophils	9.00	5.00	8.50	4.00	0.09, 0.92
Эозинофилы / Eosinophils	9.00	3.00	8.00	3.00	0.58, 0.55
Базофилы / Basophils	5.00	5.00	4.00	4.00	0.41,0.68
Азурофилы / Azurophils	12.00	5.00	13.00	5.00	1.24, 0.21
Моноциты / Monocytes	7.00	4.00	7.00	5.00	0.22, 0.82
Лимфоциты / Lymphocytes	61.00	6.00	60.5	90.00	0.11,0.91
Суммарное содержание клеток, % / Total cell count from all white cells, %
Гранулоциты / Granulocytes	22.00	6.00	20.00	5.00	0.77, 0.43
Агранулоциты /Agranulocytes	78.00	6.00	80.00	5.00	0.78. 0.44
Лейкоцитарные индексы, отн. ед. / Leukocyte indices, arb. un.
ИСЛ / Leukocyte shift index	0.28	0.09	0.25	0.07	0.78, 0.44
ИСЛЭ / Index of the lymphocytes and eosinophils ratio	6.77	14.37	7.71	11.50	0.78, 0.44
ИСГЭ / Index of the heterophils and eosinophils ratio	1.20	0.88	1.19	4.00	1.89, 037
ИЛГ / Lymphocyte - granulocyte index	28.18	9.69	29.27	13.23	1.26, 0.20
ИСГЛ / Index of the heterophils and lymphocytes ratio	0.15	0.09	0.14	0.08	0.24, 080
2015
Лейкоцитарная формула крови, % / WBC (white blood cells), %
Гетерофилы / Heterophils	8.00	4.50	9.00	5.00	0.22, 0.82
Эозинофилы / Eosinophils	7.00	2.00	6.00	6.00	0.02, 0.97
Базофилы / Basophils	8.50	9.00	8.00	13.00	0.27, 0.78
Азурофилы / Azurophils	10.00	4.00	9.00	5.00	0.63, 0.52
Моноциты / Monocytes	10.50	4.00	9.00	4.00	0.52, 0.59
Лимфоциты / Lymphocytes	52.50	9.50	54.00	7.00	0.69, 0.48
Суммарное содержание клеток, % / Total cell count from all white cells, %
Гранулоциты / Granulocytes	25.00	8.00	25.00	13.00	0.02, 0.97
Агранулоциты / Agranulocytes	75.00	8.00	75.00	13.00	0.02, 0.97
Лейкоцитарные индексы, отн. ед. / Leukocyte indices, arb. un.
ИСЛ / Leukocyte shift index	0.33	0.14	0.33	0.24	0.02, 0.98
ИСЛЭ / Index of the lymphocytes and eosinophils ratio	6.68	5.78	7.00	16.26	0.19, 0.84
ИСГЭ / Index of the heterophils and eosinophils ratio	0.86	0.91	0.75	2.42	0.13, 0.88
ИЛГ / Lymphocyte - granulocyte index	21.96	9.82	22.40	11.73	0.19, 0.84
ИСГЛ / Index of the heterophils and lymphocytes ratio	0.15	0.09	0.18	0.08	0.02, 0.97

Примечание. Me - медиана, IQR - интерквартильный размах. Note. Me - median, IQR - interquartile range.

 

Картина крови сеголетков V. berus представлена в табл. 2.

 

Таблица 2. Лейкоцитарный состав периферической крови сеголетков Vipera berus в условиях серпентария

Table 2. Peripheral blood leukocyte composition of Vipera berus underyearlings under serpentarium conditions

Показатель лейкограммы / Leukogram indicators	Me	IQR
Лейкоцитарная формула крови, % / WBC (white blood cells), %
Гетерофилы / Heterophils	6.00	5.00
Эозинофилы / Eosinophils	12.00	3.00
Базофилы / Basophils	10.00	5.00
Азурофилы / Azurophils	8.00	4.00
Моноциты / Monocytes	6.00	3.00
Лимфоциты / Lymphocytes	59.00	17.00
Суммарное содержание клеток, % / Total cell count from all white cells, %
Гранулоциты / Granulocytes	27.00	10.00
Агранулоциты /Agranulocytes	73.00	10.00
Лейкоцитарные индексы, отн. ед. / Leukocyte indices, arb. un.
ИСЛ / Leukocyte shift index, arb. un.	0.36	0.19
ИСЛЭ / Index of the lymphocytes and eosinophils ratio	4.87	2.39
ИСГЭ / Index of the heterophils and eosinophils ratio	0.33	0.44
ИЛГ / Lymphocyte - granulocyte index	23.60	12.59
ИСГЛ / Index of the heterophils and lymphocytes ratio	0.10	0.10

Примечание. Me - медиана, IQR - интерквартильный размах. Note. Me - median, IQR - interquartile range.

 

Лейкоцитарный профиль крови сеголетков V. berus имел выраженные различия с гранулоцитарной составляющей лейкоцитарного профиля крови взрослых особей гадюки обыкновенной, обитающих в естественных условиях лесопарковой городской зоны г. Самара. Критерий Краскела – Уоллиса (Н) и медианный тест (82) подтвердили принадлежность исследованных выборок к разным генеральным совокупностям и статистически значимое различие в лейкоцитарных показателях крови сеголетков и взрослых особей гадюки обыкновенной (табл. 3).

 

Таблица 3. Сравнительный анализ лейкоцитарного состава крови сеголетков (серпентарий) и взрослых особей Vipera berus из природной популяции (г. Самара, Красноглинский район)

Table 3. Comparative analysis of the blood leukocyte composition of Vipera berus underyearlings (serpentarium) and adults from the natural population (Samara region, Krasnoglinsky district)

 

Лейкоциты, % / Leukocyte, %	H	P		P	Самцы / Males		Самки / Females
						P	z	P
Лейкоцитарная формула крови / WBC (white blood cells)
Гетерофилы / Heterophils	12.28	0.01	10.35	0.03	2.92	0.03	3.07	0.02
Эозинофилы / Eosinophils	21.02	0.0003	15.20	0.004	4.30	0.01	3.87	0.01
Базофилы / Basophils	38.57	<0.001	28.91	<0.001	3.92	0.0008	4.56	0.00005
Азурофилы / Azurophils	18.96	0.0008	11.25	0.02	2.67	0.07	3.82	0.001
Моноциты / Monocytes	22.44	0.0002	16.58	0.0023	0.69	1.00	1.04	1.00
Лимфоциты / Lymphocytes	16.34	0.0026	17.52	0.0015	1.03	1.00	0.94	1.00

Примечание. Н - критерий Краскела - Уоллиса, х² - медианный критерий, z - критерий Данна, р - уровень значимости. Жирным шрифтом выделены статистически значимые различия.

Note. Н-Kruskel-Wallis ANOVA, х² - median test, z - Dunn's test, р - significance level. Statistically significant differences appear in bold.

 

Апостериорное сравнение выборок с использованием критерия Данна с применением поправки Бонферрони при оценке значения р выявило в крови сеголетков повышенное содержание суммарных гранулоцитов, за счет повышения доли эозинофилов и базофилов, на фоне снижения числа гетерофилов по сравнению с самками и самцами. Отметим также снижение в крови сеголетков азурофилов по сравнению с самками.

Сдвиг лейкоцитарного профиля сеголетков особенно проявлялся в изменении всех интегральных индексов, кроме ИСГЛ. Отмечено возрастание ИСЛ (по отношению к самкам и самцам) и снижении ИЛГ (по отношению к самкам), что иллюстрировало активацию неспецифической защитной системы крови и отставание в реагировании лимфоцитов как эффекторного звена иммунного ответа организма, что подтверждалось снижением соотношения лимфоцитов/эозинофилов (ИСЛЭ) и гетерофилов/эозинофилов (ИСГЭ) в крови сеголетков (рис. 1).

 

Рис. 1. Возрастные различия в значениях интегральных индексов крови Vipera berus. * статистически значимые показатели

 

Для визуализации различий в лейкоцитарном профиле сеголетков и взрослых особей из той природной популяции, откуда были взяты беременные самки, мы воспользовались методом главных компонент. На основе интегральных лейкоцитарных показателей (сумма гранулоцитов, агранулоцитов, ИСЛ, ИСЛЭ, ИСГЭ, ИЛГ, ИСГЛ) выделили первые наиболее информативные главные компоненты и определили их факторные нагрузки. Первая главная компонента с собственным значением 52.38 объясняла 95.11% общей вариации (изменчивости). Вторая главная компонента для значения 2.42 описывала 4.4% оставшейся информации после выделения первой главной компоненты. В первую главную компоненту наибольший вклад вносили переменные: гранулоциты (сильная положительная корреляция), агранулоциты и лимфоцитарно-гранулоцитарный индекс, ИЛГ (сильные отрицательные корреляции). Поэтому можно субъективно обозначить первую факторную ось как иллюстрацию сбалансированности иммунного ответа организма. Вторая факторная ось имела наиболее сильную отрицательную корреляцию с переменной ИСЛЭ и умеренную положительную – с ИЛГ. Относительный вклад переменной ИСЛЭ (0.69) в дисперсию факторной оси был выше вклада переменной ИСЛ (0.20).

Изъятые из природной популяции взрослые особи гадюки обыкновенной (самцы и самки) объединялись в общие группы: выборки 2014 г. занимали второй и третий квадрант; выборки 2015 г. – четвертый квадрант (рис. 2). При этом половая изменчивость в лейкоцитарном составе крови змей выражена незначительно. Выборка сеголетков располагалась в первом квадранте факторного пространства, что обусловливалось повышенным значением ИСЛ и пониженными значениями всех других индексов по сравнению со взрослыми особями. Таким образом, адаптивный ответ системы крови сеголетков гадюки обыкновенной характеризовался отставанием в реагировании на комплекс факторов серпентария и несбалансированностью иммунного ответа за счет недостаточности ресурса иммунокомпетентных клеток (агранулоцитов) по сравнению с показателями взрослых особей природной популяции.

 

Рис. 2. График рассеяния выборок Vipera berus в пространстве главных компонент (m – males, самцы; f – females, самки)

 

С другой стороны, невысокий показатель ИСГЛ, рассматриваемый как гематологический параметр стресса (Davis et al., 2008), свидетельствовал об адекватности физиологических механизмов адаптации, протекающих в организме рептилий в специфических условиях серпентария и отсутствии дополнительного стрессового воздействия.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Адаптивный ответ системы крови ядовитых змей к комплексу факторов естественной среды обитания реализуется за счет перераспределения соотношения в крови гетерофилов и лимфоцитов, обеспечивающих реакции иммунного реагирования (Павлов, 1998; Романова и др., 2017; Campbell, 2006; Davis et al., 2008; Arican, Cicek, 2010). В естественной среде обитания в процессе адаптации организма змей изменяются показатели клеточной и гуморальной защиты и сильнее выражены неспецифические иммунные ответы по сравнению с адаптивными реакциями иммунитета, что отражается на морфологическом составе крови.

В условиях серпентария адаптивный ответ системы крови сеголетков гадюки обыкновенной характеризовался отставанием в реагировании на комплекс факторов среды и несбалансированностью иммунного ответа за счет недостаточности ресурса иммунокомпетентных клеток (агранулоцитов) по сравнению с показателями взрослых особей гадюки обыкновенной, обитающих в естественных условиях лесопарковой городской зоны. Отметим, что экологический подход к исследованию ядовитых животных органично интегрирует в себе специфику их биологии (морфологию, распространение, сезонную и суточную активность, питание и др.) и продуцируемых ядов как химических веществ, участвующих в межвидовых (аллелохимических) взаимодействиях (Гелашвили и др., 2015). Логично полагать, что адаптационные стратегии ядовитых змей рода Vipera на ранних стадиях онтогенеза, когда гранулоцитарная составляющая крови, реализующая сильные врожденные иммунные ответы, менее активна, определяются, в том числе, и биологической спецификой действия их яда, имеющего более высокую токсичность для основных пищевых объектов у сеголетков по сравнению со взрослыми половозрелыми особями (Атяшева и др., 2016; Горелов, 2018), обеспечивая резистентность и успешное выживание молодых особей в условиях средового стресса.

Об авторах

Е. Б. Романова

Национальный исследовательский Нижегородский государственный университета им. Н. И. Лобачевского

Автор, ответственный за переписку.
Email: romanova@ibbm.unn.ru
ORCID iD: 0000-0002-1925-7864
Россия, Россия, 603022, г. Нижний Новгород, проспект Гагарина, д. 23

Е. И. Соломайкин

Национальный исследовательский Нижегородский государственный университета им. Н. И. Лобачевского

Email: e7v4gen5iy@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-4030-8272
Россия, Россия, 603022, г. Нижний Новгород, проспект Гагарина, д. 23

А. Г. Бакиев

Самарский федеральный исследовательский центр РАН, Институт экологии Волжского бассейна РАН

Email: herpetology@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-0338-2740
Россия, Россия, 445003, г. Тольятти, ул. Комзина, д. 10

Р. А. Горелов

Самарский федеральный исследовательский центр РАН, Институт экологии Волжского бассейна РАН

Email: gorelov.roman@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0207-2951
Россия, Россия, 445003, г. Тольятти, ул. Комзина, д. 10

Список литературы

Дополнительные файлы