Пептид miPEP-156a капусты повышает уровень накопления собственной мРНК в трансгенном мхе Physcomitrium patens

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

МикроРНК – это эндогенные небольшие некодирующие РНК, которые регулируют экспрессию генов на посттранскрипционном уровне путем расщепления мРНК-мишеней. Зрелые микроРНК образуются в результате процессинга их первичных транскриптов (pri-miRNA). Установлено, что продуктами трансляции некоторых pri-miRNA растений являются также молекулы пептидов (miPEP). Эти пептиды способны взаимодействовать со своими открытыми рамками трансляции (ОРТ) в транскрибирующихся цепях pri-miRNA и положительно регулировать накопление этих РНК и соответствующих зрелых микроРНК. Большинство консервативных микроРНК играют важную роль в развитии растений и их реакции на стресс. В настоящей работе нами получены трансгенные растения мха Physcomitrium patens, геном которых содержит ОРТ miPEP156a капусты Brassica oleracea под контролем сильного 35S промотора вируса мозаики цветной капусты. Проведен анализ влияния экзогенного пептида на транскрипцию этой ОРТ в протонемах двух трансгенных линий мха. Оказалось, что обработка культуры мха химически синтезированным пептидом miPEP156a вызывает усиление накопления собственной мРНК, как это показано ранее для целого ряда пептидов в однодольных и двудольных растениях. Эти данные подтверждают, что участки pri-miRNA за пределами кодирующей области пептида не требуются для активации транскрипции. Более того, нами показано, что наличие специфического промотора гена микроРНК не влияет на феномен активации транскрипции, а сам этот феномен не является видоспецифичным и наблюдается в трансгенных растениях вне зависимости от происхождения miPEP.

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

pri-miRNA – первичные транскрипты генов микроРНК; miPEP – пептид, кодируемый первичным транскриптом генов микроРНК; ОРТ – открытая рамка трансляции; ПЦР – полимеразная цепная реакция.

ВВЕДЕНИЕ

Известно, что гены микроРНК транскрибируются в виде крупных первичных транскриптов (pri-miRNA) и становятся зрелыми миРНК только после нескольких этапов созревания [1]. Как и любой белок-кодирующий ген, гены микроРНК транскрибируются РНК-полимеразой II с образованием первичного транскрипта pri-miRNA, состоящего из нескольких сотен или тысяч оснований. Во внутренней области этого первичного транскрипта находится характерная шпилечная структура, включающая биспиральную последовательность микроРНК, которая превращается в зрелую форму после действия белка DCL1, кодируемого геном Dicer [1]. Этот фермент сначала отщепляет 5′- и 3′-концевые области первичного транскрипта, превращая его в шпилькообразную миРНК-предшественник (pre-miRNA), а затем расщепляет pre-miRNA для высвобождения дуплекса miRNA-miRNA*. Этот дуплекс затем транслоцируется в цитоплазму, где одна из цепей (соответствует микроРНК) включается в рибонуклеопротеидную частицу, образованную нуклеазой Argonaute для формирования комплекса RISC, который затем обеспечивает микроРНК-опосредованный сайленсинг генов [1].

Десять лет назад обнаружили, что некоторые pri-miRNA содержат небольшие открытые рамки трансляции (ОРТ), которые могут кодировать регуляторные пептиды, называемые микроРНК-кодируемые пептиды (miPEP) [2]. Механизм действия miPEP в растениях заключается в усилении транскрипции и накопления соответствующей pri-miRNA, что является примером положительной обратной связи. Это приводит к повышению накопления зрелых микроРНК и усилению подавления генов-мишеней для микроРНК [3, 4]. Сверхэкспрессия miPEP в трансгенных растениях или обработка листьев и корней экзогенными химически синтезированными пептидами могут приводить, например, к значительным изменениям в развитии корней, к увеличению накопления антоцианинов и повышению устойчивости к биотическим и абиотическим видам стресса [4–7]. Важно, что целый ряд таких эффектов может успешно использоваться для улучшения хозяйственно значимых свойств растений [4, 5, 7, 8].

Ранее мы использовали биоинформатический подход для сравнительного анализа последовательностей ОРТ из генов pri-miRNA в геномах растений и идентифицировали новую группу miPEP (пептиды miPEP156a), кодируемых pri-miR156а, у нескольких десятков видов семейства Brassicaceae [9]. Экзогенные химически синтезированные пептиды miPEP156a могут эффективно проникать в проростки растений через корневую систему и системно распространяться в листья. Пептиды оказывают явный морфологический эффект, ускоряя рост первичных корней. Параллельно пептиды miPEP156a усиливают экспрессию собственной pri-miR156a [9]. Важно отметить способность пептида быстро проникать в ядро клетки и связываться с хроматином. В этой работе нами установлены общие свойства вторичной структуры miPEP156a и обнаружены ее изменения, вызванные образованием пептидного комплекса с нуклеиновыми кислотами [9].

Недавно было доказано взаимодействие пептида Mt-miPEP171b из бобовых с транскрибируемыми (в основном недостроенными) молекулами pri-miR171b, входящими в комплекс с матричной цепью хромосомной ДНК. Было высказано предположение, что это новый вид связывания белка с РНК, который полностью зависит от наличия определенного линейного набора кодонов в матрице, кодирующей данный miPEP, а эти пептиды могут выполнять специфические регуляторные функции только в отношении своих матричных pri-miRNA [10]. Исходя из особенностей взаимодействия между miPEP и их pri-miRNA, предложена следующая схема активации транскрипции pri-miRNA кодируемыми пептидами: 1) miPEP транслируется в цитоплазме из полноразмерной pri-miRNA или ее фрагмента, содержащего ОРТ, кодирующую miPEP; 2) затем этот пептид мигрирует в ядро, где связывается с синтезируемой pri-miRNA в области его кодирующей последовательности; 3) такое взаимодействие усиливает накопление микроРНК на уровне транскрипции [4, 10]. Существующий экспериментальный опыт не позволяет нам сделать вывод о том, связывает ли miPEP рибонуклеотидные цепочки pri-miRNA (или РНК в форме РНП) или РНК-ДНК-гибриды. Очевидно, нельзя исключать, что miPEP обладают потенциалом взаимодействия не только с РНК, но и, как показано нами ранее [3], с ДНК (и/или хроматином) в областях генов микроРНК. Таким образом, miPEP могут регулировать активность РНК-полимеразы II и/или медиаторного комплекса на стадиях инициации и/или элонгации транскрипции [8].

В нашей работе на модели miPEP156a капусты (Brassica oleracea) мы поставили задачи выяснить: 1) насколько важны участки pri-miRNA за пределами кодирующей области пептида для активации транскрипции; 2) роль специфического промотора гена микроРНК в феномене активации транскрипции; 3) является ли феномен активации транскрипции видоспецифичным, т.е. может ли пептид miPEP одного вида растений функционировать в других таксономически удаленных видах. С этой целью нами получены трансгенные растения мха Physcomitrium patens, содержащие в геноме ОРТ miPEP156a капусты брокколи под контролем сильного 35S промотора вируса мозаики цветной капусты, и проанализировано влияние экзогенного пептида на транскрипцию этой ОРТ в протонемах мха.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Кодирующая область ОРТ miPEP156a, включающая инициирующий и терминирующий кодоны, была амплифицирована с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) на матрице хромосомной ДНК B. oleracea. Для этого использовали пару ДНК-затравок: mir156r (5’-CTTTCTTTATGGCTCTTGTCGCTT) и mir156f (5’- AAATGTTCTGTTCAATTCAATGC) [9]. Полученный продукт амплификации клонировали в вектор pPLV27, используя метод LIC (ligation-independent cloning) [11]. После клонирования плазмиду pPLV27-miPEP156a (рис. 1) накапливали в клетках Escherichia coli, очищали с помощью Qiagen Plasmid Maxi Kit (Qiagen, ФРГ) и секвенировали.

 

Рис. 1. Схема плазмиды pPLV27-miPEP156a, несущей вставку кодирующей области miPEP156a (отмечена фиолетовой стрелкой) и ген устойчивости к гигромицину, которые экспрессировали в целевых трансгенных растениях

 

Для получения трансгенов протонему мха P. patens Gransden 2004 выращивали на 9-см чашках Петри на твердой среде Кнопа, содержащей 1.5% агара (Helicon, Россия) и 500 мг/л аммония тартрата (Helicon), при освещении белым светом от люминесцентных ламп (Sanyo Plant Growth Incubator MLR-352H (Panasonic, Япония)) с фотонным потоком 61 мкмоль/м2 в условиях 16-часового светового дня при 24°C и относительной влажности 50%. Протопласты получали из пятидневной протонемы. Протонему собирали с поверхности агара с помощью шпателя, отжимали и помещали в 0.5% раствор драйзелазы (Sigma-Aldrich, США) в 0.48 М маннитоле на 45 мин при непрерывном покачивании в темноте. Затем суспензию фильтровали через металлическое ситечко (100 мкм). Затем протопласты осаждали в 50 мл пластиковых пробирках центрифугированием при 150 g в течение 5 мин. Далее протопласты дважды отмывали 0.48 М маннитолом с последующим центрифугированием в тех же условиях. Затем супернатант сливали, а полученные протопласты трансформировали согласно протоколу PEG-трансформации [11]. Протопласты в концентрации 1.5 × 106 /мл ресуспензировали в растворе MMg (0.48 M маннитол, 15 мM MgCl2, 0.1% MES, pH 5.6), инкубировали в течение 20 мин, затем добавляли 10 мкг плазмиды pPLV27-miPEP156a (рис. 1) и раствор 33% PEG, инкубировали в течение еще 30 мин. После отмывки протопласты высевали в верхнем агаре в чашки Петри на твердую среду поверх пленки. Затем чашки помещали в темноту на сутки. Далее их культивировали в обычных условиях для регенерации протопластов.

Для отбора клонов, имеющих вставку с целевым геном, регенерировавшие протопласты культивировали на селективной среде с гигромицином. В результате выявили пять устойчивых трансгенных линий мха P. patens: 2450, 2451, 2453, 2456 и 2483. Из растительных тканей этих линий экстрагировали суммарную ДНК с помощью DNeasy Plant Kit в соответствии с инструкциями производителя (Qiagen). С помощью ПЦР показали, что специфические продукты реакции, несущие вставку с ОРТ miR156a размером 700 п.н. и полученные с помощью затравок p35Sf (5’-AACAAAGGATAATTTCGGGAAAC) и tNOSr (5’-TCGCGTATTAAATGTATAATTGC), комплементарных областям плазмиды pPLV27 с 35S промотором и терминатором транскрипции соответственно (рис. 1), образовывались лишь в случае линий 2450 и 2483 (рис. 2). Специфичность вставок подтвердили секвенированием продуктов ПЦР. Интересно, что колонии мха этих линий имеют существенно разную скорость роста. Если скорость роста у линии 2483 близка к скорости у растений дикого типа, то развитие колоний у 2450 было существенно замедлено. В этой связи важно отметить, что в трансгенных растениях P. patens, сверхэкспрессирующих ряд эндогенных пептидов, в большинстве случаев также наблюдается снижение скорости роста колоний [11].

 

Рис. 2. Проверка наличия целевой вставки в ДНК отобранных линий P. patens, устойчивых к гигромицину (линии 2450, 2451, 2483, 2456, 2453), с помощью ПЦР. Геномную ДНК исходной линии мха (WT) использовали в качестве контроля. А – контрольная проверка качества выделенной ДНК референсного гена мха EF1-alpha (фактор элонгации трансляции 1а). Дорожка 1 – маркеры длины ДНК; 2 – WT; 3 – линия 2450; 4 – линия 2451; 5 – линия 2483; 6 – линия 2456; 7 – линия 2453. Б – ПЦР геномной ДНК с праймерами p35Sf и tNOSr. Расположение дорожек как на панели А. В – повторная проверка вставки в медленнорастущей линии мха 2450 с праймерами p35Sf и tNOSr. Дорожка 1 – маркеры длины ДНК (размеры фрагментов указаны слева), 2 – линия 2450, 3 – ДНК плазмиды pPLV27-miPEP156a

 

Для изучения влияния пептида miPEP156a на экспрессию мРНК в трансгенных растениях с помощью количественного ПЦР-анализа протонему линий 2450 и 2483 P. patens выращивали в 100 мл жидкой среды Кнопа, содержащей 500 мг/л тартрата аммония (Helicon, Россия), на качалках при освещении белым светом от люминесцентных ламп Sanyo Plant Growth Incubator MLR-352H (Panasonic, Япония) с фотонным потоком 61 мкмоль/м2 в условиях 16-часового светового дня при 24°C и относительной влажности 50%. Для анализа семидневную протонему обрабатывали раствором пептида в воде (5 мкг/мл) в конечном объеме 50 мл. Образцы инкубировали в течение ночи, а затем нити протонемы отделяли от среды, отжимали от лишней влаги с помощью фильтровальной бумаги и замораживали в жидком азоте. Из замороженных тканей экстрагировали тотальную РНК с помощью TRIzol™ реагента (Invitrogen, США) в соответствии с инструкциями производителя. После определения концентрации 2 мкг РНК обрабатывали ДНКазой I (Thermo Fisher Scientific, США). Затем проводили обратную транскрипцию c праймером со случайной последовательностью с использованием набора Mini kit («Евроген», Россия). Полученную кДНК добавляли к смеси для проведения количественной ПЦР, используя реактивы и инструкции производителя («Евроген»). Количественную ПЦР проводили с использованием готовой смеси qPCRmix HS («Евроген») на амплификаторе DT prime («ДНК-Технологии», Россия). Реакционная смесь (25 мкл) содержала 10 пмоль каждого праймера и интеркалирующий краситель Eva Green 1х. Использовали следующую программу амплификации: 95°С – 5 мин; 95°С – 15 с, 60°С – 15 с*, 72°С –15 с, 45 циклов (* – детекция флуоресценции в канале FAM). После обработки данных значения Cq использовали для расчета нормализованной экспрессии в программе Q Gene [12] (рис. 3).

 

Рис. 3. Результаты кПЦР по измерению уровня экспрессии матрицы для miPEP156a в трансгенных растениях мха P. patens линий 2450 (А) и 2483 (Б). Для каждого из пяти независимых повторов РНК выделяли из пяти проб мха, выросших в разные периоды времени. Указаны средние статистические значения в виде столбчатой диаграммы и стандартные отклонения. Статистическая значимость различий сумм значений в контрольных экспериментах (без инкубации с пептидом) и опытных экспериментов (с добавлением пептида miPEP156a) составляла для этих двух выборок p < 0.05 согласно критерию Стьюдента (расчет на основе программы GraphPad Prism 7.0 – (https:// graphpad_prism.software.informer.com/7.0/))

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В результате количественного ПЦР-анализа (рис. 3) было выяснено, что обработка культуры мха экзогенным, химически синтезированным пептидом miPEP156a в питательном растворе вызывает усиление накопления собственной мРНК в трансгенной культуре мха. В линии 2483 увеличение накопления РНК-матрицы для пептида miPEP156a составляет около 60%. В случае линии 2450 этот эффект выражен даже сильнее: накопление РНК-матрицы для пептида капусты увеличивается на 240%, что выше эффекта, наблюдаемого при обработке проростков капусты [9].

В ходе исследования нами получены трансгенные растения мха P. patens, содержащие в геноме ОРТ miPEP156a капусты брокколи под контролем сильного 35S промотора вируса мозаики цветной капусты, и проведен анализ влияния экзогенного пептида на транскрипцию этой ОРТ в протонемах двух трансгенных линий мха. Оказалось, что экзогенный, химически синтезированный пептид miPEP156a вызывает усиление накопления в культуре мха собственной мРНК, как показано ранее для целого ряда пептидов в однодольных и двудольных растениях [3–5]. Наши текущие данные указывают, что участки pri-miRNA за пределами кодирующей области пептида не требуются для активации транскрипции. Более того, специфический промотор гена микроРНК не участвует в феномене активации транскрипции, а сам феномен активации транскрипции не является видоспецифичным, т.е. пептид miPEP156а капустных может функционировать в других таксономически удаленных видах растений, таких как мох. Таким образом, полученные нами данные находятся в согласии со схемой действия miPEP, где связывание пептида со своей транскрибируемой pri-miRNA-матрицей обеспечивает активацию синтеза этих РНК [10].

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 24-24-00016, https://rscf.ru/project/24-24-00016/.

×

Об авторах

Т. Н. Ерохина

Государственный научный центр Российской Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ГНЦ ИБХ РАН)

Автор, ответственный за переписку.
Email: tne@mx.ibch.ru
Россия, Москва, 117997

Е. В. Рябухина

Государственный научный центр Российской Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ГНЦ ИБХ РАН)

Email: tne@mx.ibch.ru
Россия, Москва, 117997

И. С. Ляпина

Государственный научный центр Российской Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ГНЦ ИБХ РАН)

Email: tne@mx.ibch.ru
Россия, Москва, 117997

Д. Ю. Рязанцев

Государственный научный центр Российской Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ГНЦ ИБХ РАН)

Email: tne@mx.ibch.ru
Россия, Москва, 117997

С. К. Завриев

Государственный научный центр Российской Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ГНЦ ИБХ РАН)

Email: tne@mx.ibch.ru
Россия, Москва, 11799

С. Ю. Морозов

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: tne@mx.ibch.ru
Россия, Москва, 117997

Список литературы

  1. Axtell M.J. // Annu. Rev. Plant Biol. 2013. V. 64. № 1. P. 137–159. doi: 10.1146/annurev-arplant-050312-120043
  2. Lauressergues D., Couzigou J.M., Clemente H.S., Martinez Y., Dunand C., Bécard G., Combier J.P. // Nature. 2015. V. 520. № 7545. P. 90–93. doi: 10.1038/nature14346
  3. Erokhina T.N., Ryazantsev D.Y., Zavriev S.K., Morozov S.Y. // Int. J. Mol. Sci. 2023. V. 24. № 3. P. 2114. https://doi.org/10.3390/ijms24032114
  4. Thuleau P., Ormancey M., Plaza S., Combier J.P. // J. Exp. Bot. 2024. erae501. doi: 10.1093/jxb/erae501.
  5. Erokhina T.N., Ryazantsev D.Y., Zavriev S.K., Morozov S.Y. // Plants. 2024. V. 13. № 8. P. 1137. https://doi.org/10.3390/plants13081137
  6. Ormancey M., Guillotin B., Ribeyre C., Medina C., Jariais N., San Clemente H., Thuleau P., Plaza S., Beck M., Combier J.P. // Plant Biotechnol. J. 2024. V. 22. № 8. P. 13–15. doi: 10.1111/pbi.14187
  7. Zhou J., Zhang R., Han Q., Yang H., Wang W., Wang Y., Zheng X., Luo F., Cai G., Zhang Y. // Plant Cell Rep. 2024. V. 44. № 1. P. 9. doi: 10.1007/s00299-024-0338y
  8. Ormancey M., Thuleau P., Combier J.P., Plaza S. // Biomolecules. 2023. V. 13. № 2. P. 206. doi: 10.3390/biom13020206
  9. Erokhina T.N., Ryazantsev D.Y., Samokhvalova L.V., Mozhaev A.A., Orsa A.N., Zavriev S.K., Morozov S.Y. // Biochemistry (Moscow). 2021. V. 86. № 5. P. 551–562. doi: 10.1134/S0006297921050047.
  10. Lauressergues D., Ormancey M., Guillotin B., Gervais V., Plaza S., Combier J.P. // Cell Rep. 2022. V. 38. № 6. P. 110339. doi: 10.1016/j.celrep.2022.110339.
  11. Fesenko I., Kirov I., Kniazev A., Khazigaleeva R., Lazarev V., Kharlampieva D., Grafskaia E., Zgoda V., Butenko I., et al. // Genome Res. 2019. V. 29. № 9. P. 1464–1477. doi: 10.1101/gr.253302.119
  12. Simon P. // Bioinformatics. 2003. V. 19. № 11. P. 1439–1440. doi: 10.1093/bioinformatics/btg157

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Схема плазмиды pPLV27-miPEP156a, несущей вставку кодирующей области miPEP156a (отмечена фиолетовой стрелкой) и ген устойчивости к гигромицину, которые экспрессировали в целевых трансгенных растениях

Скачать (371KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Проверка наличия целевой вставки в ДНК отобранных линий P. patens, устойчивых к гигромицину (линии 2450, 2451, 2483, 2456, 2453), с помощью ПЦР. Геномную ДНК исходной линии мха (WT) использовали в качестве контроля. А – контрольная проверка качества выделенной ДНК референсного гена мха EF1-alpha (фактор элонгации трансляции 1а). Дорожка 1 – маркеры длины ДНК; 2 – WT; 3 – линия 2450; 4 – линия 2451; 5 – линия 2483; 6 – линия 2456; 7 – линия 2453. Б – ПЦР геномной ДНК с праймерами p35Sf и tNOSr. Расположение дорожек как на панели А. В – повторная проверка вставки в медленнорастущей линии мха 2450 с праймерами p35Sf и tNOSr. Дорожка 1 – маркеры длины ДНК (размеры фрагментов указаны слева), 2 – линия 2450, 3 – ДНК плазмиды pPLV27-miPEP156a

Скачать (540KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Результаты кПЦР по измерению уровня экспрессии матрицы для miPEP156a в трансгенных растениях мха P. patens линий 2450 (А) и 2483 (Б). Для каждого из пяти независимых повторов РНК выделяли из пяти проб мха, выросших в разные периоды времени. Указаны средние статистические значения в виде столбчатой диаграммы и стандартные отклонения. Статистическая значимость различий сумм значений в контрольных экспериментах (без инкубации с пептидом) и опытных экспериментов (с добавлением пептида miPEP156a) составляла для этих двух выборок p < 0.05 согласно критерию Стьюдента (расчет на основе программы GraphPad Prism 7.0 – (https:// graphpad_prism.software.informer.com/7.0/))

Скачать (207KB)
Метаданные

© Ерохина Т.Н., Рябухина Е.В., Ляпина И.С., Рязанцев Д.Ю., Завриев С.К., Морозов С.Ю., 2025

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».