Сервер PepString для поиска коротких аминокислотных подпоследовательностей: определение возможных мишеней бета-амилоида

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Белок-белковые взаимодействия играют принципиальную роль практически во всех клеточных процессах. Особый интерес для биомедицины и фармацевтики имеют белок-белковые интерфейсы, в которых участвуют молекулы, ассоциированные с развитием патологических состояний. Нейродегенеративные заболевания ассоциированы с агрегацией определенных белков в упорядоченные надмолекулярные структуры, при этом инициирование патологической агрегации происходит по зародышевому механизму, в котором ключевую роль играют повторяющиеся белок-белковые взаимодействия с одинаковыми межмолекулярными интерфейсами. Одной из ведущих стратегий разработки болезнь-модифицирующих лекарственных средств для терапии нейродегенеративных заболеваний является использование агентов различной природы (например, антител, пептидов, пептидомиметиков), способных специфически разрушать образование болезнь-ассоциированных межмолекулярных интерфейсов и за счет этого предотвращать нежелательную агрегацию [1]. Cоответственно, критически важна идентификация аминокислотных остатков, образующих такие интерфейсы.

Болезнь Альцгеймера (БА) – наиболее распространенное нейродегенеративное заболевание и ведущая причина деменции в мире [2]. БА характеризуется конформационной трансформацией молекул эндогенного амилоида-β (Aβ) из мономерного состояния в растворимые олигомеры и нерастворимые агрегаты [3], которые инициируют нейровоспаление и другие патологические процессы, связанные с развитием БА [4]. Нерастворимые агрегаты Aβ присутствуют в мозге как в виде диффузных агрегатов на стенках кровеносных сосудов, так и в виде фибриллярных агрегатов (амилоидных бляшек) на поверхности нейронов [5], и такие агрегаты находятся в динамическом равновесии с растворимыми олигомерами Aβ [6].

Аβ – это небольшая полипептидная молекула, состоящая из 38–43 аминокислотных остатков (а.о.) [7]. Aβ образуется в результате протеолиза белка-предшественника амилоида (APP) [8]. Аминокислотная последовательность наиболее часто встречающейся в амилоидных бляшках изоформы Aβ, Aβ42, содержит 42 а.о. [9, 10]. Пептид Aβ присутствует как в тканях мозга, так и в периферических органах [11]. В крови Aβ образуется в основном в тромбоцитах [12] и проходит через гематоэнцефалический барьер [11]. В крови как здоровых людей, так и пациентов с диагнозом спорадической формы болезни Альцгеймера Aβ находится в пикомолярном диапазоне концентраций [13]. Физиологические функции Aβ заключаются в подавлении микробных инфекций, регуляции синаптической пластичности, содействии восстановлению после травмы мозга, герметизации гематоэнцефалического барьера и, возможно, в подавлении пролиферации опухолевых клеток [14, 15].

Агрегация молекул Aβ in vivo инициируется межмолекулярными взаимодействиями, в которых критическую роль играют металлсвязывающий домен (Aβ16), расположенный на участке 1–16 Aβ, и ионы цинка. Соответственно, данные о трехмерной структуре Aβ16 и молекулярном механизме цинкзависимой олигомеризации Aβ используются для рационального поиска и конструирования молекул-кандидатов в рамках антиамилоидной стратегии [16]. Определена пространственная структура Aβ16 нескольких природных вариантов Aβ в свободном и связанном с ионами цинка состоянии [17–21]. Имеются также экспериментальные данные о структуре Aβ16 в амилоидных фибриллах, выделенных из мозга пациентов с диагнозом БA [22]. На основании этих данных было установлено, что участок 11-EVHH-14 Aβ человека имеет такую структуру основной полипептидной цепи, которая остается практически неизменной как в свободной молекуле Aβ16, так и в комплексе Aβ16 с ионом цинка, а также в N-концевой части фибрилл Aβ, выделенных из ткани мозга больных БА.

В совокупности перечисленные свойства характеризуют сайт 11-EVHH-14 Aβ как структурный инвариант и позволяют предположить, что этот сайт играет важную роль во взаимодействии Aβ с другими биологическими молекулами. Действительно, установлено, что сайт 11-EVHH-14 Aβ: (1) является основным центром распознавания и связывания ионов цинка; (2) находится на межмолекулярном интерфейсе в комплексах между Aβ и никотиновым ацетилхолиновым рецептором подтипа α4β2 [23, 24]; (3) образует симметричный цинкзависимый интерфейс как в димерах Aβ [25, 26], так и в олигомерах Aβ [17]; (4) участвует в цинкзависимом связывании нуклеиновых кислот [27]. Аминокислотная последовательность металлсвязывающего домена Aβ (Aβ16) находится во внеклеточной мембранной части белка-предшественника амилоида (APP), а также составляет С-концевой фрагмент растворимой α-формы APP (sAPPα) [28], и оба эти белка, APP и sAPPα, выполняют жизненно важные физиологические функции [29]. Более того, и в APP, и в sAPPα область 11-EVHH-14 металлсвязывающего домена Aβ стерически доступна для взаимодействия как с ионами цинка, так и с другими биомолекулами, включая Aβ. Таким образом, оба эти белка могут выступать в качестве потенциальных партнеров для связывания Aβ посредством цинкзависимых взаимодействий через симметричные области 11-EVHH-14 металлсвязывающих доменов из соответствующих молекул.

В патогенезе болезни Альцгеймера взаимодействие Aβ с ионами цинка, которое опосредуется сайтом 11-EVHH-14 Aβ, является ключевым фактором формирования и распространения амилоидных бляшек, поэтому этот сайт представляет собой перспективную лекарственную мишень [16]. Важно отметить, что большинство моноклональных антител, используемых для нейтрализации олигомеров Aβ в терапии БА, блокируют сайт 11-EVHH-14 [30]. Однако моноклональные антитела имеют множество побочных эффектов [31], поэтому актуальным представляется поиск и разработка низкомолекулярных агентов различных химических классов [32], включая пептидомиметики и пептиды природного или искусственного происхождения [33].

Недавно было обосновано использование синтетического аналога сайта 35-HAEE-38 субъединицы α4 никотинового ацетилхолинового рецептора подтипа α4β2 в качестве эффективного средства ингибирования агрегации эндогенных молекул Aβ в патогенезе болезни Альцгеймера [23]. Такой аналог (далее HAEE) специфически связывается с 11-EVHH-14-сайтом Aβ как в отсутствие, так и в присутствии ионов цинка, приводя к образованию стабильных комплексов, которые, в свою очередь, блокируют образование и распространение агрегатов Aβ [34]. Однако неизвестно, может ли HAEE связываться с сайтами EVHH в других белках и как это может повлиять на пациентов при возможном использовании HAEE в качестве лекарственного средства.

Учитывая ключевую роль тетрапептидного участка EVHH в формировании межмолекулярных интерфейсов с участием Aβ, важно идентифицировать все белки протеома человека, которые содержат этот сайт, так как такие белки могут быть потенциальными партнерами для Aβ. Однако к моменту настоящего исследования эффективные биоинформатические инструменты для поиска коротких (3 а.о. и более) подпоследовательностей в известных белках отсутствовали. В настоящей работе представлен оригинальный сервер PepString для поиска точных вхождений коротких фрагментов последовательности белка. Использование ресурсов сервера PepString показано на примере последовательности EVHH бета-амилоида, которая представляет собой перспективную мишень для разработки патогенетических препаратов антиамилоидного действия в терапии болезни Альцгеймера.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Сервер PepString

Сервер PepString (http://pepstring.eimb.ru) разработан на основе PostgreSQL-версии актуальных баз данных UniprotKB и SwissProt. Этот сервер позволяет пользователю искать точные совпадения коротких пептидов в белковых последовательностях. Запрос может быть ограничен определенным таксоном, например, Mammalia, Bacteria или Vertebrata, или всеми видами. Запрос также может быть основан на наличии нескольких фрагментов в одной последовательности (пять или менее фрагментов) или на наличии в последовательности хотя бы одного фрагмента из списка. Снимок начальной страницы показан на рис. 1. Несколько последовательностей могут быть введены с использованием запятой или/и пробела в качестве разделителя, например, «ALC,RADGG», «ALC, RADGG», «ALC RADGG». Каждую из нескольких последовательностей можно разместить на отдельной строке. Один запрос может содержать не более пяти последовательностей. Для поиска можно использовать два оператора: AND и OR. Оператор AND позволяет найти белковые последовательности, включающие все пептиды из запроса. Оператор OR позволяет найти белковые последовательности, включающие хотя бы один пептид из списка запроса. Поиск можно ограничить, выбрав таксон любого уровня, например Vertebrata или Archaea, или Mammalia, или Homo sapiens.

 

Рис. 1. Форма запроса для поиска последовательностей белков, содержащих точные вхождения коротких пептидов, с помощью сервера PepString (http://pepstring.eimb.ru)

 

На рис. 2 приведен пример вывода результатов. Результаты отсортированы по названию организма. Пользователь может сохранить результат запроса в форматах FASTA или CSV. Поиск 3-аминокислотного фрагмента в базе данных SwissProt занимает несколько секунд, в то время как в базе данных UniprotKB – от 10 мин до нескольких часов.

 

Рис. 2. Результат поиска двух пептидов ALC RADGG сервером PepString среди белков из видов Mammalia

 

Для создания базы данных белковых последовательностей на основе UniprotKB (SwissProt+TrEMBL) были использованы Python и PostgreSQL. Схема структуры базы данных приведена в Приложении, рис. S1. База данных обновляется автоматически практически в то же время, что и официальная база данных UniProtKB, то есть примерно 1 раз в 8 недель. Веб-интерфейс написан с использованием фреймворка Django.

Таксономия в нашей базе данных идентична таксономии NCBI. Обратите внимание, что идентификаторы NCBI и названия организмов могут не совпадать с данными из базы данных UniProt. Причина в том, что UniProt обновляет свою таксономию также 1 раз в 8 недель. Однако наша база данных использует базу данных NCBI Taxonomy, которая получает новые обновления ежедневно, поэтому может случиться так, что версия, которую мы использовали для обновления, отличается от версии UniProt.

Результат выполнения запроса пользователя хранится в таблице django_celery_results_taskresult в течение 24 ч, а затем удаляется.

Расчеты консервативности с помощью BLAST

Консервативность сайта EVHH рассчитывали по гомологичным белковым последовательностям других видов среди челюстноротых позвоночных с помощью программы BLAST [35]. Для каждого идентификатора белка Uniprot из табл. 1 найдено 1000 гомологичных последовательностей. Количество последовательностей, содержащих сайт EVHH (первое число в колонке Консервативность в табл. 1), делили на количество последовательностей со всеми вариантами этого сайта (второе число в колонке Консервативность в табл. 1) и умножали на 100, чтобы получить значение Консервативности в %.

 

Таблица 1. Консервативность фрагмента EVHH в белках человека, определенная с помощью BLAST*

Консервативность	Идентификатор Uniprot	Белок	Локализация EVHH
885/985 (89.8%)	P05067	Белок-предшественник амилоида-бета	682–685, YEVHHQ
683/800 (85.4%)	Q13634	Кадгерин-18	46–49, TEVHHR
667/930 (71.7%)	P78310	Рецептор коксакивируса и аденовируса	272–275, KEVHHD
437/995 (43.9%)	Q06124	Тирозин-протеинфосфатаза нерецепторного типа 11	441–444, EEVHHK
405/950 (42.6%)	Q9H8M1	Митохондриальный гомолог В коэнзим-Q-связывающего белка COQ10	234–237, HEVHHT
276/965 (28.6%)	Q9Y2E6	E3-убиквитин-протеинлигаза DTX4	575–578, NEVHHK
168/779 (21.6%)	Q03001-11	Нейрональная изоформа дистонина	101–104, VEVHHQ
154/844 (18.2%)	Q58FF7	Предполагаемый белок теплового шока HSP90-beta-3	4–7, EEVHHG
133/859 (15.5%)	P08238	Белок теплового шока HSP 90-beta	4–7, EEVHHG
134/990 (13.5%)	Q6ZSZ5	Фактор обмена гуаниновых нуклеотидов Rho 18	459–462, TEVHHV
105/1000 (10.5%)	O75676	Киназа рибосомного белка S6 альфа-4	471–474, HEVHHD
100/991 (10.1%)	Q86SQ4	Адгезионный G-белок-связанный рецептор G6	797–800, QEVHHP
81/872 (9.6%)	Q7Z3D6	D-глутаматциклаза, митохондриальная	273–276, PEVHHI
47/522 (9.0%)	Q9Y4G2	Член 1 семейства М, содержащего домен гомологии плекстрина	233–236, IEVHHS
87/974 (8.9%)	Q53F39	Металлофосфоэстераза 1	309–312, CEVHHG
60/1000 (6.0%)	P54296	Миомезин-2	751–754, REVHHK
48/959 (5.0%)	O76064	E3-убиквитин-протеинлигаза RNF8	229–232, TEVHHE
48/1000 (4.8%)	Q5TG30	Белок 40, активирующий Rho GTPaзу	392–395, DEVHHN
43/998 (4.3%)	Q2M3C7	А-киназный якорный белок SPHKAP	682–685, DEVHHK
25/960 (2.7%)	P10912	Рецептор гормона роста	71–74, DEVHHG
26/999 (2.6%)	Q8NH48	Обонятельный рецептор 5B3	171–174, NEVHHF
4/262 (1.5%)	Q9H0D2	Белок с цинковыми пальцами 541	218–221, YEVHHG
9/949 (0.9%)	Q5VT97	Активирующий Rho GTPазу белок SYDE2	567–570, REVHHT
4/998 (0.4%)	P41226	Убиквитин-подобный модификаторактивирующий фермент 7	283–286, QEVHHA

*Записи перечислены в порядке убывания консервативности.

 

Варианты сайтов EVHH

Была написана короткая программа на C++ для разбора файлов последовательности fasta и подсчета всех вариантов сайтов EVHH. Текст программы доступен по запросу.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Сервером PepString в протеоме человека найдены 63 последовательности изоформ 24 белков, содержащих фрагмент EVHH. Если взять 1000 гомологичных белков из базы данных Uniprot и подсчитать, сколько из них содержат фрагмент, гомологичный EVHH, и в скольких случаях этот фрагмент именно EVHH, то можно получить некоторое представление о консервативности этого фрагмента в белке у разных видов организмов. В табл. 1 мы собрали информацию о консервативности фрагмента EVHH в белковых последовательностях и положении этого фрагмента в последовательности. Более длинная версия таблицы, в которой перечислены все изоформы, содержащие фрагмент EVHH, и структурная информация, представлена в табл. S1 Приложения. Фрагмент EVHH в белке APP является наиболее консервативным (89.8%) (табл. 1). Несколько менее консервативны участки EVHH в последовательностях белка кадгерин-18 и рецептора вируса Коксаки и аденовирусов – 85.4 и 71.7% соответственно. Нейрональная изоформа дистонина также заслуживает внимания, поскольку, помимо консервативной формы EVHH, найденной в 168 из 779 последовательностей (21.6%), 315 из 779 последовательностей (40.4%) гомологичных белков из разных видов содержат очень похожую по физико-химическим свойствам последовательность этого сайта EAHH.

В последовательности белка-предшественника амилоида человека (APP) EVHH находится в пептиде Aβ, может связывать ион Zn²⁺ и образовывать димеры и олигомеры [17, 21, 25]. Анализ последовательностей белка APP других видов челюстноротых позвоночных показал, что у всех птиц, рептилий, амфибий, рыб и почти у всех млекопитающих последовательности APP содержат высококонсервативный вариант EVHH, за некоторыми исключениями (табл. 2). Например, обе изоформы APP синих и полосатых китов содержат последовательность EVRH, хотя у других морских млекопитающих мы видим консервативный вариант EVHH. Тот же вариант EVRH встречается у некоторых грызунов – мышей, крыс, кротов, сусликов, дегу и голого землекопа (полный список см. в табл. 2). Замена встречается не у всех грызунов. Например, мы обнаружили консервативный вариант EVHH в последовательностях APP Oryctolagus cuniculus (кролик) и Chrysochloris asiatica (капский золотистый крот). Другим исключением является Puma concolor (горный лев), который имеет единственную изоформу APP, содержащую в этом месте совершенно непохожий сайт RGGW.

 

Таблица 2. Варианты сайтов EVHH, найденные среди гомологов человеческого белка APP (P05067) у разных видов челюстноротых позвоночных

Мотив	Число видов	Организм
EVHH	885	Все птицы, рептилии, амфибии, угри и костистые рыбы Albula goreensis, Aldrovandia affinis (галозавр Гильберта), Latimeria chalumnae (Коморская латимерия), Megalops atlanticus (атлантический тарпон), Clupea gigantea (ископаемая гигантская сельдь), рыбы, такие как Salmonidae и другие, и почти все млекопитающие
EVRH	64	Balaenoptera acutorostrata scammoni (кит северный малый полосатик), Balaenoptera musculus (синий кит), Castor canadensis (американский бобр), длиннохвостая шиншилла (Chinchilla lanigera), Dipodomys ordii (кенгуровая крыса Орда), Fukomys damarensis (дамараландская кротовая крыса), Haplochromis burtoni (ротан Бертона), голый землекоп (Heterocephalus glaber), Ictidomys tridecemlineatus (полосатый суслик), Jaculus jaculus (малый египетский тушканчик), Marmota marmota marmota (альпийский сурок), Mesocricetus auratus (золотистый хомяк), Microtus ochrogaster (прерийная полевка), Mus musculus (мышь), Mus spicilegus (степная мышь), Nannospalax galili (североизраильский слепыш), Octodon degus (дегу), Peromyscus maniculatus bairdii (олений хомячок), Rattus norvegicus (серая крыса), Sciurus vulgaris (евразийская рыжая белка), Urocitellus parryii (арктическая земляная белка), Pundamilia nyererei (пундамилия Найерера), Maylandia zebra (зебровая мбуна), Atractosteus spatula (крокодиловый гар), Lepisosteus oculatus (пятнистый гар), Oreochromis aureus (израильская тиляпия), Oreochromis niloticus (нильская тиляпия)
EVYH	24	Cyprinus carpio carpio (сазан), Cirrhinus molitorella (илистый карп), Onychostoma macrolepis, Sinocyclocheilus rhinocerous, Sinocyclocheilus anshuiensis, Danio rerio (полосатый данио), Sinocyclocheilus grahami (дианчинская золотая рыбка), Triplophysa rosa (пещерный вьюн)
AVHH	7	Oryzias javanicus (яванская рисовая рыба), Oryzias latipes (японская рисовая рыба), Oryzias melastigma (морская медака), Oryzias sinensis (китайская медака)
-VHH	1	Clupea harengus (атлантическая сельдь)
EVHP	1	Denticeps clupeoides (зубастая сельдь)
EV-H	1	Astyanax mexicanus (cлепая пещерная рыба)
EVYP	1	Triplophysa tibetana (тибетский голец)
RGGW	1	Puma concolor (горный лев)

 

Далее рассмотрим, что известно про функцию каждого найденного белка. Белок кадгерин-18 аннотирован в Uniprot как участвующий в кальцийзависимой межклеточной адгезии, клеточной миграции и морфогенезе. В последовательности кадгерина-18 фрагмент EVHH расположен в пропептиде 25–53, который выщепляется из белка во время созревания. В модели AlphaFold-структуры этого белка сайт EVHH расположен в неупорядоченной петле, на поверхности белка (табл. S1 Приложения). Функция этого пропептида пока не известна. По данным Uniprot, остаток аспарагина 36 может быть гликозилирован, что делает пропептид чувствительным к уровню глюкозы в крови. Известно, что кадгерин-18 ассоциирован с болезнью Альцгеймера. Экспериментально показано, что кадгерин взаимодействует с пресенилином-1, роль которого в болезни Альцгеймера доказана [36].

Рецептор вирусов Коксаки и аденовируса является компонентом комплекса эпителиального апикального соединения, который может функционировать как гомофильная молекула клеточной адгезии и необходим для поддержания плотного контакта [37]. Также он участвует в трансэпителиальной миграции лейкоцитов через адгезивные взаимодействия с JAML – трансмембранным белком плазматической мембраны лейкоцитов. После связывания с эпителиальным рецептором вируса Коксаки и аденовируса (CXADR), JAML вызывает последующие сигнальные события в гамма-дельта Т-клетках через PI3-киназу и MAP-киназу. Это приводит к пролиферации и выработке Т-клетками цитокинов и факторов роста, которые, в свою очередь, стимулируют восстановление эпителиальных тканей [38]. Фрагмент EVHH расположен в домене 269–285 этого рецептора, аннотированном как домен, обогащенный заряженными аминокислотами. Это означает, что данный фрагмент очень подвижен и может изменять свою конформацию в зависимости от структуры партнера по взаимодействию. Рецептор вируса Коксаки и аденовируса ассоциирован с болезнью Альцгеймера. Показано, что инфицирование вирусами Коксаки [39] и аденовирусами [40] может служить пусковым моментом начала болезни Альцгеймера у пожилых людей, поскольку провоцирует экспрессию прионного белка.

Следующий по консервативности фрагмента EVHH белок – это тирозиновая фосфатаза нерецепторного типа 11, которая участвует в каскадах различных рецепторных и цитоплазматических тирозинкиназ, участвуя в передаче сигнала с поверхности клетки в ядро. Активация киназы подавляет функцию интегринов и вызывает дефосфорилирование киназы фокальной адгезии [41]. Она является одним из важных негативных регуляторов ядерного экспорта теломеразной обратной транскриптазы [42]. Мутации в этом белке связаны с рядом заболеваний, которые развиваются при нарушении регуляции внутриклеточной сигнализации через путь RAS/MAPK, таких как синдром LEOPARD [43] или синдром Нунана [44]. Данные про ассоциацию с болезнью Альцгеймера в настоящее время отсутствуют.

Митохондриальный гомолог В коэнзим Q-связывающего белка COQ10 (Q9H8M1) необходим для функционирования коэнзима Q10 в дыхательной цепи и может служить шапероном или участвовать в переносе Q10 от места его синтеза к каталитическим сайтам дыхательных комплексов. Сайт EVHH, согласно модели AlphaFold, расположен на поверхности белка в составе β-стренда (см. табл. S1 Приложения). В научном сообществе существует мнение, что введение коэнзима Q10 увеличивает концентрацию митохондрий в мозге и оказывает нейропротекторное действие [45, 46], однако в клинических исследованиях II стадии эффект не был показан убедительно, поэтому клинические исследования III стадии было решено не проводить [47].

E3-убиквитинлигаза DTX4 (Q9Y2E6) участвует в негативной регуляции интерферонового сигналинга I типа посредством NLRP4, направляя киназу TBK1 на деградацию [48]. В дополнение к 276/965 (28.6%) встречающимся консервативным последовательностям EVHH, в 687/965 (71.2%) последовательностях был обнаружен фрагмент EIHH с очень похожими физико-химическими свойствами. Гомологичная убиквитинлигаза DTX2 ассоциирована с повреждением мелких сосудов на ранних стадиях болезни Альцгеймера [49].

Нейрональная изоформа дистонина (Q03001-11), помимо варианта сайта EVHH, найденного в 168 из 779 последовательностей (21.6%), встречается также в виде очень похожего по физико-химическим свойствам варианта сайта EAHH в 315 из 779 последовательностей (40.4%). Мутации в гене этого белка приводят к прогрессирующей дегенерации сенсорных нейронов у мышей. Такие мыши страдают сенсорной атаксией и погибают к возрасту отъема [50], у них развивается тяжелое двигательное расстройство, приписываемое дегенерации сенсорных нейронов [51].

Нами рассмотрено расположение сайта EVHH в структуре белков и его конформацию. Конформации сайтов EVHH в структурах белков человека образуют четыре кластера (рис. 3). Самую близкую к структуре цинксвязывающего домена Aβ конформацию имеет сайт EVHH миомезина. Найдена также ассоциация миомезина-2 с болезнью Альцгеймера. Изучение кардиомиопатии у трансгенных мышей показало, что агрегаты, присутствующие в больных сердцах и образованные небольшим белком теплового шока α-B-кристаллином (CryAB), содержат амилоидный олигомер, который может представлять собой основной токсичный вид при болезни Альцгеймера и других дегенеративных заболеваниях, связанных с амилоидом [52]. Известно, что α-B-кристаллин взаимодействует с миомезином-2 [53].

 

Рис. 3. Конформации сайтов EVHH в структурах белков человека образуют четыре кластера. A – развернутая (O76064, Q9H8M1, Q5VT97, Q13634, Q7Z3D6, Q9Y4G2, P08238, Q58FF7, P10912, O75676, Q53F39). B – неструктурированная (Q9Y2E6, Q5TG30, Q8NH48, Q86SQ4). C – свернутая (P54296, 1ze9). D – α-спираль (Q2M3C7 (сайт EVHH внутри глобулы), Q9H0D2, 3B7O, P78310, Q6ZSZ5 (сайт EVHH внутри глобулы), P41226). Только сайты EVHH из Q6ZSZ5 и Q2M3C7 утоплены в белковую глобулу и недоступны

 

В 21 структуре из 24 сайт EVHH расположен на поверхности белковой структуры. Для последовательности дистонина (Q03001-11) не существует модели AlphaFold, в модели структуры фактора обмена гуаниновых нуклеотидов Rho 18 (Q6ZSZ5) сайт EVHH расположен внутри белковой глобулы, а в модели структуры якорного белка А-киназы SPHKAP (Q2M3C7) сайт EVHH окружен неструктурированными петлями.

Суммируя, можно сказать, что сайт 11-EVHH-14 в последовательности Aβ является очень консервативным среди всех челюстноротых позвоночных. Челюстноротые составляют более 99% всех видов живых позвоночных, включая человека. Ранее было показано, что замена H13R защищает крыс от болезни Альцгеймера [18]. У Balaenoptera acutorostrata scammoni (кит северный малый полосатик) и Balaenoptera musculus (синий кит), а также у некоторых грызунов, таких как Heterocephalus glaber (голый землекоп) или Nannospalax galili (североизраильский слепыш) (табл. 2), наблюдается именно такая замена, преобразующая EVHH в EVRH, что, по-видимому, делает эти виды защищенными от патологической агрегации Aβ и, таким образом, не подверженными болезни Альцгеймера. Объяснение этому следует из молекулярного механизма Zn-зависимой олигомеризации Aβ [17], который указывает на ключевую роль сайта EVHH в патологическом процессе.

Мы обнаружили, что сайт EVHH присутствует в 63 изоформах 24 белков. Каждый из этих белков может быть потенциальным молекулярным партнером цинкзависимого взаимодействия с молекулой бета-амилоида. Уже известно, что некоторые из них связаны с патогенезом болезни Альцгеймера, однако данные о механизмах действия отсутствуют. Шесть из 24 найденных белков, а именно APP, кадгерин-18, рецептор вируса Коксаки и аденовируса, G-белок адгезии, сопряженный с рецептором G6, рецептор гормона роста и обонятельный рецептор 5B3 расположены в клеточной мембране, являются рецепторами, и, вероятно, осуществляют передачу сигнала внутрь клетки.

Найденные белки являются как потенциальными мишенями для HAEE, так и возможными партнерами Aβ. Как показано ранее [17, 25], остатки сайта 11–14 пептида Aβ (EVHH) образуют цинк-опосредованный интерфейс с аналогичным участком другой молекулы Aβ. Логично предположить, что подобные взаимодействия могут происходить не только между идентичными молекулами бета-амилоида, но и с другими белками, имеющими аналогичный участок, доступный для взаимодействия.

Сделаем несколько предположений. Во-первых, APP функционирует как рецептор клеточной поверхности и выполняет физиологические функции на поверхности нейронов, связанные с ростом нейритов, адгезией нейронов и аксоногенезом [54]. В настоящее время известно, что взаимодействие между молекулами APP на соседних клетках способствует синаптогенезу [54]. Поскольку ионы цинка вовлечены в процесс синаптогенеза, логично предположить, что взаимодействие между молекулами APP происходит через Zn-зависимый интерфейс сайтов EVHH. Это смелое предположение, оно, несомненно, требует дальнейшего экспериментального подтверждения.

Сайты EVHH обнаружены в митохондриальных белках – D-глутаматциклазе и коэнзим-Q-связывающем белке Q9H8M1. Поскольку известно, что пептид Aβ вызывает AGER-зависимый путь, включающий активацию p38 MAPK, что приводит к интернализации пептида Aβ и митохондриальной дисфункции в культивируемых нейронах коры головного мозга [55], второе предположение заключается в том, что пептид Aβ способен проникать через мембрану митохондрий и образовывать цинкзависимые комплексы с одним или обоими белками.

Отметим, что другой из обнаруженных белков с сайтом EVHH, а именно тирозин-протеинфосфатаза нерецепторного типа 11, положительно регулирует путь передачи сигнала MAPK [44]. Третье предположение заключается в том, что Aβ регулирует путь трансдукции сигнала MAPK через цинкзависимый интерфейс с тирозин-протеинфосфатазой нерецепторного типа 11. Еще один белок из этого списка, а именно рецептор вируса Коксаки и аденовируса, также запускает один из путей активации MAPK.

Еще одна группа белков, которая, как мы выяснили, участвует в регуляции активности нейронов, это кадгерин-18, рецептор вируса Коксаки и аденовируса, рецептор адгезии G-белка G6, который взаимодействует с ламинином-2, фактором обмена гуаниннуклеотидов Rho 18 и дистонином. Кадгерины – кальцийзависимые белки клеточной адгезии. Они преимущественно взаимодействуют между собой гомофильным образом при соединении клеток; таким образом, кадгерины могут способствовать сортировке гетерогенных типов клеток. Рецептор вируса Коксаки и аденовируса, помимо своей негативной роли в проникновении вируса, является компонентом комплекса эпителиального апикального контакта, который может функционировать как гомофильная молекула клеточной адгезии и необходим для целостности плотных контактов. G-белок адгезии, сопряженный с рецептором G6, является основным компонентом базальной мембраны. Он соединяется с G(i)-, а также с G(s)-белками и необходим для нормальной дифференцировки промиелинизирующих шванновских клеток и для нормальной миелинизации аксонов [56]. Фактор Rho 18 действует как фактор обмена гуаниннуклеотидов (GEF) для GTPазы RhoA, индуцируя образование актиновых стрессовых волокон и выработку реактивных видов кислорода (ROS). Он может быть активирован субъединицами бета-гамма G-белков [57]. Нейрональная изоформа дистонина изучена плохо, но известно, что мутации в гене этого белка у мышей приводят к прогрессирующей дегенерации сенсорных нейронов. Такие мыши страдают сенсорной атаксией и погибают к возрасту отъема [50]. Четвертое предположение заключается в том, что эти белки являются партнерами G-белка, и взаимодействие с ними через цинкзависимый интерфейс влияет на функцию G-белка и связанные с ним процессы в клетке. Модель структуры фактора обмена гуаниннуклеотидов Rho 18, однако, предполагает, что сайт EVHH находится внутри белковой глобулы и недоступен для растворителя.

Пятое предположение заключается в том, что пептид Aβ может образовывать комплексы с двумя белками теплового шока – HSP 90-beta (P08238) и 90-beta-3 (Q58FF7) через цинкзависимый интерфейс и влияет на созревание, поддержание структуры и правильную регуляцию специфических белков-мишеней. Помимо шаперонной активности, он также играет роль в регуляции механизма транскрипции. HSP90 и его кошапероны модулируют транскрипцию, по крайней мере, на трех различных уровнях. Во-первых, они изменяют стабильные уровни определенных факторов транскрипции в ответ на различные физиологические сигналы. Во-вторых, они модулируют активность некоторых эпигенетических модификаторов, таких как деацетилазы гистонов или ДНК-метилтрансферазы, и реагируют на изменения в окружающей среде. В-третьих, они участвуют в миграции гистонов из промоторной области определенных генов и тем самым включают экспрессию генов [58].

На экспрессию генов также может влиять белок типа «цинковых пальцев» 541 (Q9H0D2). Этот регулятор транскрипции необходим для мужской фертильности и завершения мейотической профазы в сперматоцитах. Упомянутая выше тирозин-протеинфосфатаза нерецепторного типа 11 (Q06124) также задействована в каскаде различных рецепторных и цитоплазматических протеин-тирозинкиназ, участвуя в передаче сигнала с поверхности клетки в ядро. Известно, что белки с цинковыми пальцами [59] и тирозиновые фосфатазы [60] связаны с болезнью Альцгеймера, но точный механизм взаимодействия пока неизвестен.

ВЫВОДЫ

В настоящей работе представлен оригинальный сервер PepString для поиска коротких аминокислотных последовательностей в базах данных UniprotKB и SwissProt. С использованием сервера PepString впервые показано, что тетрапептидный сайт EVHH, который является структурно-функциональной детерминантой бета-амилоида человека как в норме, так и при болезни Альцгеймера, присутствует в 63 изоформах 24 белков. На основании анализа данных об ассоциации этих белков с болезнью Альцгеймера предложена потенциальная роль кадгерина-18, рецептора Коксаки и аденовирусов, E3-убиквитинлигазы DTX4, нейрональной изоформы дистонина и миомезина-2 в патогенезе болезни Альцгеймера.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда № 19-74-30007.

Авторы выражают благодарность Ю.В. Кравацкому за помощь и ценные советы.

Приложения доступны на сайте https://doi.org/10.32607/actanaturae.27630.

Об авторах

С. А. Козин

Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта

Email: anastasia.a.anashkina@mail.ru
Россия, Москва, 119991

А. А. Анашкина

Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта

Автор, ответственный за переписку.
Email: anastasia.a.anashkina@mail.ru
Россия, Москва, 119991

Д. Г. Мацуга

Астраханский государственный медицинский университет; Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет)

Email: anastasia.a.anashkina@mail.ru

кафедра биологической химии и клинической лабораторной диагностики, Астраханский государственный медицинский университет

Россия, Астрахань, 414000; Москва, 119991

Б. С. Суваан

Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет)

Email: anastasia.a.anashkina@mail.ru
Россия, Москва, 119991

В. Г. Туманян

Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта

Email: anastasia.a.anashkina@mail.ru
Россия, Москва, 119991

В. А. Митькевич

Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта

Email: anastasia.a.anashkina@mail.ru
Россия, Москва, 119991

А. А. Макаров

Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта

Email: anastasia.a.anashkina@mail.ru
Россия, Москва, 119991

Список литературы

Дополнительные файлы