Корреляционные закономерности коэкспрессии микроРНК с таргетными мРНК – транскриптами при глиоме у пациентов с диким и мутированным типом генов изоцитратдегидрогеназы

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГНСЗ – глиомы низкой степени злокачественности; ЗНО – злокачественные новообразования; IDH – изоцитратдегидрогеназа.

ВВЕДЕНИЕ

Частота заболеваемости глиомами составляет около 6.6 на 100000 населения и почти у половины пациентов диагностируют глиобластому. Данные по заболеваемости злокачественными новообразованиями (ЗНО) головного мозга в Российской Федерации довольно противоречивы. По разным оценкам частота подобных ЗНО может достигать 23 человек на 100000 населения, при этом заболеваемость глиомами составляет 10–13 человек на 100000 населения [1]. С возрастом вероятность возникновения этой патологии резко возрастает: с 0.15 в детском возрасте до 15 на 100000 населения у пожилых людей в возрасте 75–84 лет [2].

Причины увеличения частоты заболеваемостью глиомами остаются не до конца выясненными. Возможно, это связано с массовым внедрением высокотехнологичных методов диагностики ЗНО головного мозга в клиническую практику, таких, как магнитно-резонансная и позитронно-эмиссионная томография [2]. В качестве причины возникновения глиом изучено множество внешних факторов окружающей среды, однако статистически значимое увеличение риска возникновения глиом на текущий момент связывают только с воздействием ионизирующего излучения [3–5].

микроРНК – это небольшие некодирующие молекулы РНК, которые регулируют экспрессию генов путем связывания с мРНК-мишенями, что приводит к их деградации или ингибированию трансляции [6]. Многочисленные исследования выявили значительное изменение экспрессии микроРНК в процессе злокачественной трансформации. С учетом этих результатов микроРНК в настоящее время активно позиционируются в качестве потенциальных диагностических или прогностических биомаркеров. Экспрессия микроРНК нарушается при ЗНО человека через различные механизмы, такие, как амплификация или делеция генов микроРНК, аномальный контроль транскрипции микроРНК, эпигенетические изменения и дефекты в механизмах процессинга микроРНК. микроРНК могут классифицироваться как онкогены или гены-супрессоры опухолей.

Генетические особенности глиом активно используют для классификации опухолей и выбора оптимальной стратегии лечения пациента. Ранее было предпринято несколько попыток характеризации глиом низкой степени злокачественности с генами изоцитратдегидрогеназы (IDH) дикого и мутированного типов с помощью сигнатур микроРНК [7–9]. В данном исследовании изучены корреляционные закономерности коэкспрессии микроРНК со своими потенциальными таргетными транскриптами в группах пациентов c глиомами низкой степени злокачественности с диким и мутированным геном IDH.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Источники данных

В качестве исходных данных для анализа ГНСЗ использовали когорту TCGA-LGG (https://portal.gdc.cancer.gov/projects/TCGA-LGG), содержащую разнообразные данные как по секвенированию геномов отдельных пациентов с ГНСЗ, так и данные по экспрессии генов и микроРНК.

Программное обеспечение

Анализ проводили с использованием стандартных инструментов для работы с транскриптомными данными для языка Python 3.10. Для нормализации и предобработки данных использовали пакеты RNAnorm 2.1.0 и PyDESeq2 0.4.4. Коэффициенты корреляции вычисляли пакетом SciPy v1.12.0. Кривые выживаемости построены в пакете Lifelines 0.28.0.

Блок-схема

 

Рис. 1. A – блок-схема использованного биоинформатического алгоритма. Б – кривая выживаемости пациентов TCGA-LGG, разделенных на два молекулярных подтипа: IDHwt (группа без мутаций в генах IDH) и IDHmut (группа с мутациями в генах IDH)

 

Блок-схема алгоритма приведена на рис. 1А. Последовательность шагов включает фильтрацию по уровню экспрессии генов, фильтрацию по базе данных TargetScan с определенным уровнем достоверности (порог context++score < -0.2), корреляционный анализ и отбор пар по критерию уровня коэффициента корреляции.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Ранее было показано, что продолжительность жизни пациентов с ГНСЗ коррелирует с наличием/отсутствием мутации в генах IDH и наличием/отсутствием делеции в 1p и 19q. На основании полученных данных ГНСЗ предложено разделить на три молекулярных подтипа: IDHwt – не мутированные гены IDH, IDHmut-no-codel – мутация в генах IDH и отсутствие делеции в 1p и 19q, IDHmut-codel – мутации в генах IDH и делеции в 1p и 19q [10]. В данном исследовании мы остановились на двух группах: группа без мутаций в генах IDH (IDHwt) и группа с мутациями в генах IDH (IDHmut). Используя данные о продолжительности жизни отдельных пациентов и ранее опубликованные данные о молекулярных подтипах ГНСЗ, мы провели анализ выживания пациентов в когорте. Полученные нами кривые Каплана–Майера хорошо соотносятся с ранее опубликованными данными и показывают, что пациенты без мутаций в гене IDH имеют существенно более низкую продолжительность жизни, чем пациенты с мутацией генов IDH (рис. 1Б).

 

Рис. 2. Графики корреляций для 21 пары микроРНК–мРНК. Черный цвет – группа IDHmut, красный – группа IDHwt. Показаны уровни экспрессии в образцах каждого пациента и прямая линейной регрессии для каждой группы. Красным цветом отмечены мРНК и микроРНК, ассоциированные с негативным прогнозом ГНСЗ, зеленым – протективные. RPM (Reads per million mapped reads) – риды на миллион прокартированных ридов, RPKM (Reads per kilobase per million mapped reads) – риды на килобазу экзона на миллион прокартированных ридов

 

Для изучения биологической роли микроРНК традиционно используют анализ дифференциальной экспрессии, выделяя те микроРНК, средние уровни экспрессии которых значительно различаются в группах. Однако эти методы не обнаруживают изменений в случае, если средние уровни экспрессии регуляторных и таргетных РНК не изменяются. В этом случае применим анализ дифференциальной коэкспрессии, который выявляет пары или кластеры, взаимная экспрессия которых изменяется между группами [11]. Такие изменения могут указывать на потерю регуляции между микроРНК и ее мРНК-мишенью из-за мутаций, например, в области связывания. Для численной оценки уровня коэкспрессии используются такие показатели, как параметрическая корреляция Пирсона или ранговая корреляция Спирмена. Сравнивая значения этих показателей в разных группах, можно сделать вывод, что коэкспрессия конкретной пары значительно изменилась. Нами проведен поиск характеристических микроРНК, регуляторная функция которых значимо отличается в группах IDHwt и IDHmut. Разница в регуляции уровня экспрессии генов со стороны потенциально взаимодействующих с их транскриптами микроРНК в зависимости от отсутствия/наличия мутации в генах IDH выявлена с помощью анализа дифференциальной коэкспрессии.

Клинические исследования ГНСЗ ведутся очень интенсивно, однако комплексный анализ больших когорт с секвенированием ДНК опухоли и пациента, анализом экспрессии генов и метилирования ДНК практически отсутствуют. На данный момент в Атлас Опухолевых Геномов (TCGA) (https://portal.gdc.cancer.gov/) депонировано всего одно подобное исследование образцов ГНСЗ от 530 пациентов. Предварительно мы провели фильтрацию всевозможных пар по существующим базам данных по взаимодействию микроРНК и мРНК, полученных как экспериментальным путем, так и in silico. В качестве основной базы данных мы использовали TargetScanHuman 8.0 (https://www.targetscan.org) для определения мРНК-мишеней, с которыми связываются микроРНК. На втором этапе был проведен расчет корреляции экспрессии между белоккодирующими мРНК и всеми микроРНК. Значимыми считали все пары, у которых коэффициент корреляции Спирмена был ниже -0.4 в любой из групп IDHwt или IDHmut, что соответствует сильной негативной корреляции, а именно значимому влиянию данной микроРНК на экспрессию гена. При этом абсолютная разница в коэффициентах корреляции между группами должна быть не менее 0.6.

В результате проведенного анализа получили 169 пар (156 различных мРНК).

На финальном этапе пары отфильтровали по достоверности коэффициента корреляции в каждой группе (p < 0.05), по уровню экспрессии мРНК (≥ 2 в шкале log₂(RPKM)) и по разнице в коэффициентах корреляции (≥ 0.6). На рис. 2 показаны данные зависимости для 21 пары микроРНК–мРНК-мишень, прошедших через все этапы фильтрации. Приведены значения уровней экспрессии каждой пары микроРНК–мРНК-мишень в каждом образце в виде точки цветом, соответствующим группам IDHwt и IDHmut. Для иллюстрации приведены прямые линейной регрессии для групп IDHwt и IDHmut, где виден разнонаправленный характер их регуляции. В названиях микроРНК и мРНК использовали цветовую кодировку: красным цветом отмечены РНК, ассоциированные с негативным прогнозом ГНСЗ, зеленым – протективные. Данные получены из опубликованных источников и более подробно описаны в разделе «Обсуждение».

 

Рис. 3. Уровни экспрессии 21 пары микроРНК–мРНК, сгруппированные по данным позитивного (А) и негативного (Б) влияния микроРНК на протекание заболевания. Красным отмечены мРНК и микроРНК, ассоциированные с негативным прогнозом ГНСЗ, зеленым – протективные. Черные диаграммы – группа IDHmut, красные диаграммы – группа IDHwt

 

На рис. 3 приведены уровни экспрессии в этих парах. Пары микроРНК–мРНК сгруппированы в три группы по прогнозу их влияния на протекание заболевания (согласно опубликованным данным), цветовая кодировка названий аналогична использованной на рис. 2. Приведены уровни экспрессии каждой пары в образцах каждого пациента с указанием их медианного значения в группах, а также уровень значимости дифференциальной экспрессии между группами IDHwt и IDHmut, посчитанный по критерию Манна–Уитни. Детальный анализ роли уровней экспрессии в парах приведен в разделе «Обсуждение».

Интересно, что в подавляющем большинстве случаев наблюдается картина сильной отрицательной корреляции между белоккодирующими мРНК и микроРНК в группе без мутаций в генах IDH, при этом либо отсутствие корреляции, либо позитивная корреляции в группе с мутацией в генах IDH, что потенциально указывает на потерю функциональной связи микроРНК и мРНК-мишеней.

Численные данные для полученных пар приведены в табл. 1.

 

Таблица 1. Список пар микроРНК–мРНК, отсортированных по разнице в коэффициентах корреляции

мРНК	микроРНК	Корреляция (IDHmut)	Корреляция (IDHwt)	Разница в коэффициентах корреляции	TargetScan context+ + score
DDX18	hsa-mir-767	0.365	-0.432	0.797	-0.325
PINK1	hsa-mir-767	-0.453	0.316	0.769	-0.239
ELN	hsa-mir-767	0.322	-0.442	0.764	-0.222
FKBP9	hsa-mir-218-2	0.319	-0.441	0.76	-0.243
CREB3L4	hsa-mir-186	-0.507	0.247	0.754	-0.25
ASCC1	hsa-mir-487a	-0.402	0.338	0.74	-0.217
ST3GAL6	hsa-mir-767	-0.406	0.308	0.714	-0.247
MCM6	hsa-mir-140	0.199	-0.508	0.707	-0.319
RANBP3L	hsa-mir-455	0.298	-0.405	0.703	-0.361
PSMB2	hsa-mir-891a	-0.405	0.297	0.702	-0.319
MCM4	hsa-mir-140	0.176	-0.512	0.688	-0.311
GRPEL2	hsa-mir-29c	0.208	-0.478	0.686	-0.306
ZNF12	hsa-mir-767	0.144	-0.521	0.665	-0.215
ARL4C	hsa-mir-490	0.237	-0.42	0.657	-0.241
ZCCHC17	hsa-mir-27a	0.111	-0.532	0.643	-0.221
PLAT	hsa-mir-491	0.195	-0.439	0.634	-0.252
CRISPLD1	hsa-mir-767	0.12	-0.51	0.63	-0.314
CISD1	hsa-mir-16-1	0.114	-0.51	0.624	-0.451
ARID1A	hsa-mir-223	0.147	-0.469	0,616	-0.232
C9orf64	hsa-mir-346	0.178	-0.438	0.616	-0.231
TMEM229A	hsa-mir-182	0.129	-0.474	0.603	-0.264

 

ОБСУЖДЕНИЕ

микроРНК – небольшие одноцепочечные некодирующие РНК (20–23 нуклеотида), которые путем регуляции большого количества транскриптов вовлечены в процессы онкогенеза, а также прогрессирования и метастазирования различных опухолей [12]. Экспрессия множества микроРНК изменена во многих опухолях головного мозга, включая как глиомы низкой степени злокачественности, так и самые распространенные и злокачественные подтипы глиобластомы [13]. микроРНК ассоциированы с ключевыми процессами в глиомах, такими, как пролиферация клеток, апоптоз и инвазия [14].

Мутации в генах IDH служат основным генетическим маркером, который характеризует агрессивность глиом. Пациенты с IDH дикого типа имеют негативный прогноз, в то время как мутации в генах IDH ассоциированы с повышенной выживаемостью [15–17]. В настоящем исследовании оценивали потенциальную дисрегуляцию физиологической функции микроРНК в группах IDHwt и IDHmut. Большая часть из 21 обнаруженной пары (микроРНК–мРНК) с дифференциальной коэкспрессией (16/21) имеет слабую или средней степени положительную корреляцию между белоккодирующими мРНК и микроРНК в образцах IDHmut и отрицательную корреляцию в образцах с IDHwt.

Экспрессия протективной при глиоме микроРНК-767 в глиомах высокой степени злокачественности значительно ниже, чем в глиомах низкой степени злокачественности и здоровых тканях [18, 19]. По нашим данным, уровень микроРНК-767 понижен в группе IDHwt в сравнении с IDHmut и отрицательно коррелирует с транскриптами генов DDX18 (РНК-хеликаза), ELN (белок соединительной ткани, отвечающий за эластичность), ZNF12 (репрессор транскрипции) и CRISPLD1 (белок внеклеточных везикул) и положительную с мРНК генов PINK1 (киназа, участвующая в фосфорилировании митохондриальных белков) и ST3GAL6 (сиаловая трансфераза) в образцах с IDH1 дикого типа. Важно отметить, что повышенная экспрессия генов ELN [20] и ST3GAL6 [21] ассоциирована с более агрессивным типом глиом и, соответственно, более низкой выживаемостью. В то же время глиомы с пониженной экспрессией проективного гена PINK1 коррелируют с низкой выживаемостью пациентов, получавших химио- и лучевую терапию [22]. Информация о роли генов DDX18, ZNF12 и CRISPLD1 при глиомах и при глиомах низкой степени злокачественности, в частности, на настоящий момент отсутствует.

Согласно опубликованным данным, экспрессия микроРНК-218-2 [23], 487a [24], 891a [25], 29c [26], 27a [27], 182 [28], 455 [29] повышена в агрессивных подтипах глиом и ассоциирована с отрицательным прогнозом, в то время как микроРНК-140 [30], 490 [31], 346 [32], 223 [33] способствуют ингибированию пролиферации опухолей. Данные об экспрессии микроРНК-16-1 весьма противоречивы: ее количество снижено в глиомах с мутированным IDH1 по сравнению с тканями с IDH1 дикого типа, но в то же время сниженная экспрессия данной микроРНК способствует пролиферации опухоли [34, 35]. О роли микроРНК-186 при глиомах достоверной информации найти не удалось. Статистически значимое различие в исследованных группах IDHwt и IDHmut в терминах экспрессии вышеуказанных микроРНК мы наблюдали в случае микроРНК-182, микроРНК-455 и микроРНК-891а, уровень которых был достоверно снижен в образцах глиомы группы IDHwt. Уровень микроРНК-455, наоборот, был увеличен в группе IDHwt в сравнении с образцами глиомы IDHmut.

В более агрессивных типах глиом наблюдается сверхэкспрессия генов, транскрипты которых потенциально служат мишенью для дисрегулированных микроРНК в группах IDHmut и IDHwt, FKBP9 [36] – CREB3L4 [37], MCM4, MCM6 [38], PSMB2 [39], ARID1A [40], ARL4C [41], GRPEL2 [42], C9orf64 [43]. Не найдено информации об участии генов ASCC1, ZCCHC17 (участвует в биогенезе рибосомной ДНК), PLAT, CISD1, TMEM229a и RANBP3L в развитии и распространении любых типов глиом. Проведенный анализ выявил достоверное повышение уровня мРНК, кодирующих белки ELN, ARL4C, C9orf64, PLAT, FKBP9 в образцах IDHwt в сравнении с группой IDHmut.

ВЫВОДЫ

Наши исследования показали, что анализ дифференциальной коэкспрессии может быть успешно применен к поиску физиологически значимых пар микроРНК–мРНК в группах пациентов с ГНСЗ различного мутационного фенотипа IDH. Выявленные закономерности свидетельствуют, что в группе IDHwt повышен уровень мРНК, что характерно для агрессивного течения глиомы. Вместе с тем, уровень микроРНК, ассоциированных с негативным прогнозом при глиоме, в целом повышен в группе IDHmut, которая характеризуется значительно большей выживаемостью, что в очередной раз свидетельствует о сложности формирования регуляторных транскрипционных сетей. Тем не менее на уровне корреляционных связей между микроРНК и их потенциальными мРНК-мишенями образцы глиом из группы IDHmut с положительным прогнозом обладают в значительной степени менее выраженной способностью к регуляции. Подобные физиологические нарушения могут приводить к сниженной жизнеспособности опухоли и, как следствие, к повышенной способности организма сопротивляться распространению злокачественной трансформации.

 

Работа выполнена при финансовой поддержке субсидии Минобрнауки России проект № 13.2251.21.0111 (075-15-2021-1033).

Об авторах

А. А. Бондарев

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: belogurov@mx.ibch.ru
Россия, Москва, 117997

А. С. Евпак

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: belogurov@mx.ibch.ru
Россия, Москва, 117997

А.. Л. Новоселов

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: belogurov@mx.ibch.ru
Россия, Москва, 117997

А. А. Кудряева

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: belogurov@mx.ibch.ru
Россия, Москва, 117997

А. А. Белогуров

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Российский университет медицины Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: belogurov@mx.ibch.ru
Россия, Москва, 117997; Москва, 127473

Список литературы

Дополнительные файлы