Модифицированный метод количественного определения уровней TREC и KREC в периферической крови у больных с иммунодефицитными состояниями

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Введение. Иммунный статус представляет собой комплексный показатель состояния иммунной системы, это количественная и качественная характеристика состояния функциональной активности органов иммунной системы и некоторых неспецифических механизмов противомикробной защиты. В качестве суррогатных маркеров созревания Т- и В-клеток может служить содержание в периферической крови, соответственно, Т-рецепторных эксцизионных колец (TREC) и B-клеточных эксцизионных колец (KREC). В настоящее время к недостаткам представленных на рынке диагностических наборов следует отнести два фактора: направленность наборов на диагностику иммунодефицитных состояний только у новорожденных и детей, в то время как взрослые пациенты остаются не охвачены; существенным недостатком является использование для нормирования данных одного эталонного нормировочного гена, в результате чего повышается вариабельность и снижается чувствительность результатов анализа. Цель: разработать высокочувствительный метод лабораторной оценки состояния иммунитета пациентов с использованием ПЦР в режиме реального времени на основе определения концентрации TREC и KREC у детей и взрослых. Материалы и методы. В работе использованы образцы цельной крови и сухой капли крови, полученные от новорожденных и взрослых людей, в том числе от условно здоровых лиц, а также от пациентов с диагностированными ПИД и ВИЧ-инфицированных больных. Общий объем выборки — 2577 человек. В качестве методов сравнения использовали коммерческие наборы. Результаты. Проводили мультиплексную ПЦР, анализируя количество целевых молекул TREC и KREC, а также фрагментов нормировочных генов HPRT и RPP30 с использованием разработанной серии плазмидных калибраторов. Аналитический диапазон измерений ДНК TREC/KREC составил от 103 до 109 копий/мл. Точность измерений на приборе планшетного типа (CFX) составила 95,84%, на приборе роторного типа (Rotor-Gene 3000) — 95,11%, что соответствует нормативному показателю. Показана эквивалентность получаемых результатов при работе с цельной кровью и сухими каплями крови. Анализ результатов исследуемой выборки позволил определить 100%-ную диагностическую специфичность и чувствительность метода. Заключение. Метод позволяет диагностировать снижение Т- и/или В-клеточного иммунитета у детей и взрослых, и может быть применен для детекции молекул TREC и KREC как в образцах цельной периферической крови, так и в сухой капле крови с использование карт Гатри. При этом возможно применение единых значений референсных норм, независимо от анализируемого клинического материала. Результаты испытаний свидетельствуют о возможности эффективного использования мультиплексной ПЦР-диагностики как для комплексного первичного тестирования/скрининга новорожденных, так и для оценки состояния иммунитета в целях выявления взрослых больных ПИД и в рамках диагностики пациентов со вторичными иммунодефицитами, например, с инфекцией ВИЧ.

Об авторах

М. А. Сайтгалина

ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера

Email: Sajgalinam@mail.ru

младший научный сотрудник лаборатории молекулярной иммунологии

Россия, Санкт-Петербург

Ю. В. Останкова

ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера

Автор, ответственный за переписку.
Email: shenna1@yandex.ru

к.б.н., зав. лабораторией иммунологии и вирусологии ВИЧ-инфекции; старший научный сотрудник лаборатории молекулярной иммунологии

Россия, Санкт-Петербург

Н. Е. Любимова

ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера

Email: natelu@mail.ru

к.б.н., научный сотрудник лаборатории молекулярной иммунологии

Россия, Санкт-Петербург

А. В. Семенов

Екатеринбургский НИИ вирусных инфекций ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора

Email: alexvsemenov@yahoo.com

д.б.н., директор

Россия, Екатеринбург

Р. Н. Кузнецова

ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера; ФГБОУ ВО Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: kuznetzova.rais@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1668-6716

к.м.н., врач-иммунолог-аллерголог, доцент кафедры иммунологии 

Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург

А. А. Тотолян

ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера; ФГБОУ ВО Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: totolian@spbraaci.ru

академик РАН, д.м.н., профессор, директор, зав. кафедрой иммунологии 

Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург

Список литературы

  1. Гордукова М.А., Корсунский И.А., Чурсинова Ю.В., Бяхова М.М., Оскорбин И.П., Продеус А.П., Филипенко М.Л. Определение референсных интервалов TREC и KREC для скрининга новорожденных с иммунодефицитными состояниями в РФ // Медицинская иммунология. 2019. Т. 21, № 3. C. 527–538. [Gordukova M.A., Korsunsky I.A., Chursinova Yu.V., Byakhova M.M., Oscorbin I.P., Prodeus A.P., Filipenko M.L. Determining reference ranges for TREC and KREC assays in immune deficiency screening of newborns in Russian Federation. Meditsinskaya immunologiya = Medical Immunology (Russia), 2019, vol. 21, no. 3, рр. 527–538. (In Russ.)] doi: 10.15789/1563-0625-2019-3-527-538
  2. Гордукова М.А., Оскорбин И.П., Мишукова О.В., Зимин С.Б., Зиновьева Н.В., Давыдова Н.В., Смирнова А.С., Никитина И.А., Корсунский И.А., Филипенко М.Л., Продеус А.П. Разработка набора реагентов для количественного определения молекул ДНК TREC и KREC в цельной крови и сухих пятнах крови методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени // Медицинская иммунология. 2015. Т. 17, № 5. С. 467–478. [Gordukova M.A., Oskorbin I.P., Mishukova O.V., Zimin S.B., Zinovieva N.V., Davydova N.V., Smirnova A.S., Nikitina I.A., Korsunsky I.A., Filipenko M.L., Prodeus A.P. Development of real-time multiplex PCR for the quantitative determination of TREC’s and KREC’s in whole blood and in dried blood spots. Meditsinskaya immunologiya = Medical Immunology (Russia), 2015, vol. 17, no. 5, pp. 467–478. (In Russ.)] doi: 10.15789/1563-0625-2015-5-467-478
  3. Евгина С.А., Савельев Л.И. Современные теория и практика референтных интервалов // Лабораторная служба. 2019. T. 8, № 2. С. 36–44. [Evgina S.A., Saveliev L.I. Сurrent theory and practice of reference interval. Laboratornaya sluzhba = Laboratory Service, 2019, vol. 8, no. 2, pp. 36–44. (In Russ.)] doi: 10.17116/labs2019802136
  4. Корсунский И.А., Гордукова М.А., Мунблит Д.Б., Козлов И.Г., Продеус А.П., Корсунский А.А. Клинические и эпидемиологические аспекты первичных иммунодефицитных состояний и их раннего обнаружения // Медицинская иммунология. 2017. Т. 19, № 5. С. 505–512. [Korsunskiy I.A., Gordukova M.A., Munblit D.B., Kozlov I.G., Prodeus A.P., Korsunskiy A.A. Clinical and epidemiological aspects of primary immunodeficiency diseases (PID) and early diagnosis options. Meditsinskaya immunologiya = Medical Immunology (Russia), 2017, vol. 19, no. 5, pp. 505–512. (In Russ.)] doi: 10.15789/1563-0625-2017-5-505-512
  5. Латышева Т.В., Латышева Е.А., Мартынова И.А., Аминова Г.Э. Пульмонологические проявления у взрослых пациентов с дефектом гуморального звена иммунитета // Терапевтический архив. 2016. Т. 88, № 8. С. 127–134. [Latysheva T.V., Latysheva E.A., Martynova I.A., Aminova G.E. Pulmonary manifestations in adult patients with a defect in the humoral link of immunity. Terapevticheskii arkhiv = Therapeutic Archive, 2016, vol. 88, no. 8, pp. 127–134. (In Russ.)] doi: 10.17116/terarkh2016888127-134
  6. Патент № 2756979 Российская Федерация, МПК C12Q 1/686 (2018.01), C12Q 1/6876 (2018.01). Способ лабораторной персонифицированной диагностики состояния иммунитета новорожденных и набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченных зондов: № 2019142752; заявлено 17.12.2019: опубликовано 07.10.2021 / Семенов А.В., Останкова Ю.В., Любимова Н.Е., Тотолян Арег А. Патентообладатель: ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера. 20 с. [Patent No. 2756979 Russian Federation, Int. Cl. C12Q 1/686 (2018.01), C12Q 1/6876 (2018.01). A method for laboratory personalized diagnosis of the state of immunity in newborns and a set of oligodeoxyribonucleotide primers and fluorescently labeled probes: No. 2019142752; application: 17.12.2019: date of publication 07.10.2021 / Semenov A.V., Ostankova Yu.V., Liubimova N.E., Totolian Areg A. Proprietor: FBUN NII epidemiologii i mikrobiologii imeni Pastera. 20 p. (In Russ.)]
  7. Тузанкина И.А., Каракина М.Л., Власова Е.В. Анализ клинических проявлений дебюта первичных иммунодефицитов у взрослых // Медицинская иммунология. 2014. Т. 4, № 16. C. 367–374. [Tuzankina I.A., Karakina M.L., Vlasova E.V. Analysis of the clinical manifestations of the onset of primary immunodeficiencies in adults. Meditsinskaya immunologiya = Medical Immunology (Russia), 2014, vol. 4, no. 16, pp. 367–374. (In Russ.)] doi: 10.15789/1563-0625-2014-4-367-374
  8. Arismendi M.I., Kallas E.G., Santos B.A., Carneiro-Sampaio M.M., Kayser C. Thymopoiesis and regulatory T cells in healthy children and adolescents. Clinics, 2012, vol. 67, no. 5, pp. 425–429. doi: 10.6061/clinics/2012(05)04
  9. Baker M.W., Grossman W.J., Laessig R.H., Hoffman G.L., Brokopp C.D., Kurtycz D.F., Cogley M.F., Litsheim T.J., Katcher M.L., Routes J.M. Development of a routine newborn screening protocol for severe combined immunodeficiency. J. Allergy Clin. Immunol., 2009, vol. 124, no. 3, pp. 522–527. doi: 10.1016/j.jaci.2009.04.007
  10. Dar N., Gothelf D., Korn D., Frisch A., Weizman A., Michaelovsky E., Carmel M., Yeshayahu Y., Dubnov-Raz G., Pessach I.M., Simon A.J., Lev A., Somech R. Thymic and bone marrow output in individuals with 22q11.2 deletion syndrome. Pediatr. Res., 2015, vol. 4, no. 77, pp. 579–585. doi: 10.1038/pr.2015.14
  11. Dyavar S.R., Ye Z., Byrareddy S.N., Scarsi K.K., Winchester L.C., Weinhold J.A., Fletcher C.V., Podany A.T. Normalization of cell associated antiretroviral drug concentrations with a novel RPP30 droplet digital PCR assay. Sci. Rep., 2018, vol. 8, no. 1: 3626. doi: 10.1038/s41598-018-21882-0
  12. Esber R., Theresa S., Hjort M., Wiley V. Newborn screening for primary immunodeficiencies — a method evaluation. Twin Res. Hum. Genet., vol. 21, no. 5: Special Section: Abstracts for the 42nd Human Genetics Society of Australasia Annual Scientific Meeting, Sydney, New South Wales, 2018, pp. 429–476. doi: 10.1017/thg.2018.52
  13. Hazenberg M.D., Borghans J.A., de Boer R.J., Miedema F. Thymic output: a bad TREC record. Nat. Immunol., 2003, vol. 4, no. 2, pp. 97–99. doi: 10.1038/ni0203-97
  14. Kamae C., Nakagawa N., Sato H., Honma K., Mitsuiki N., Ohara O., Kanegane H., Pasic S., Pan-Hammarström Q., van Zelm M.C., Morio T., Imai K., Nonoyama S. Common variable immunodeficiency classification by quantifying T-cell receptor and immunoglobulin -deleting recombination excision circles. J. Allergy Clin. Immunol., 2013, vol. 5, no. 131, pp. 1437–1440. doi: 10.1016/j.jaci.2012.10.059
  15. Klein S.L., Flanagan K.L. Sex differences in immune responses. Nat. Rev. Immunol., 2016, vol. 16, pp. 626–638. 10.1038/nri.2016.90
  16. Kwok J.S.Y., Cheung S.K.F., Ho J.C.Y., Tang I.W.H., Chu P.W.K., Leung E.Y.S., Lee P.P.W., Cheuk D.K.L., Lee V., Ip P., Lau Y.L. Establishing simultaneous T cell receptor excision circles (TREC) and K-deleting recombination excision circles (KREC) quantification assays and laboratory reference intervals in healthy individuals of different age groups in Hong Kong. Front. Immunol., 2020, vol. 11: 1411. doi: 10.3389/fimmu.2020.01411
  17. Laitala V., Ylikoski A., Raussi H.M., Ollikka P., Hemmilä I. Time-resolved detection probe for homogeneous nucleic acid analyses in one-step format. Anal. Biochem., 2007, vol. 361, no. 1, pp. 126–131. doi: 10.1016/j.ab.2006.11.015
  18. Pido-Lopez J., Imami N., Aspinall R. Both age and gender affect thymic output: more recent thymic migrants in females than males as they age. Clin. Exp. Immunol., 2001, vol. 125, pp. 409–413. doi: 10.1046/j.1365-2249.2001.01640.x
  19. Profaizer T., Slev P. A multiplex, droplet digital PCR assay for the detection of T-cell receptor excision circles and kappa-deleting recombination excision circles. Clin. Chem., 2019, vol. 66, pp. 229–238. doi: 10.1373/clinchem.2019.308171
  20. Quiros-Roldan E., Serana F., Chiarini M., Zanotti C., Sottini A., Gotti D., Torti C., Caimi L., Imberti L. Effects of combined antiretroviral therapy on B- and T-cell release from production sites in long-term treated HIV-1+ patients. J. Transl. Med., 2012, vol. 10, no. 94. doi: 10.1186/1479-5876-10-94
  21. Rechavi E., Lev A., Simon A.J., Stauber T., Daas S., Saraf-Levy T., Broides A., Nahum A., Marcus N., Hanna S., Stepensky P., Toker O., Dalal I., Etzioni A., Almashanu S., Somech R. First year of israeli newborn screening for severe combined immunodeficiency-clinical achievements and insights. Front. Immunol., 2017, vol. 8: 1448. doi: 10.3389/fimmu.2017.01448
  22. Resino S., Seoane E., Pérez A., Ruiz-Mateos E., Leal M., Muñoz-Fernández M.A. Different profiles of immune reconstitution in children and adults with HIV-infection after highly active antiretroviral therapy. BMC Infect. Dis., 2006, vol. 6: 112. doi: 10.1186/1471-2334-6-112
  23. Serana F., Chiarini M., Zanotti C., Sottini A., Bertoli D., Bosio A., Caimi L., Imberti L. Use of V(D)J recombination excision circles to identify T- and B-cell defects and to monitor the treatment in primary and acquired immunodeficiencies. J. Transl. Med., 2013, vol. 11: 119. doi: 10.1186/1479-5876-11-119
  24. Sottini A., Serana F., Bertoli D., Chiarini M., Valotti M., Vaglio Tessitore M., Lmberti L. Simultaneous quantification of T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) by real-time PCR. J. Vis. Exp., 2014, vol. 94: 52184. doi: 10.3791/52184
  25. Tessitore M.V., Sottini A., Roccaro A.M., Ghidini C., Bernardi S., Martellosio G., Serana F., Lmberti L. Detection of newly produced T and B lymphocytes by digital PCR in blood stored dry on nylon flocked swabs. J. Transl. Med., 2017, vol. 15, no. 1: 70. doi: 10.1186/s12967-017-1169-9
  26. Ye P., Kirschner D.E., Kourtis A.P. The thymus during HIV disease: role in pathogenesis and in immune recovery. Curr. HIV Res., 2004, vol. 2, no. 2, pp. 177–183. doi: 10.2174/1570162043484898
  27. Van Zelm M., Van der Burg M., Langerakand A., Van Dongen J. PID comes full circle: applications of V(D)J recombination excision circles in research, diagnostics and newborn screening of primary immunodeficiency disorders. Front. Immunol., 2011, vol. 2, no. 12, pp. 1–9. doi: 10.3389/fimmu.2011.00012

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рисунок 1. Кривые флуоресценции, отражающие динамику образования продуктов реакции в ходе амплификации

Скачать (78KB)
Метаданные
3. Рисунок 2. Кривые флуоресценции и калибровочные графики, отражающие динамику образования продуктов реакции амплификации при анализе серии разведений калибраторов

Скачать (635KB)
Метаданные
4. Рисунок 3. Анализ in silico фрагментов нуклеотидных последовательностей генов человека

Скачать (368KB)
Метаданные
5. Рисунок 4. ROC-кривые, построенные при сравнении результатов анализа с использованием модифицированного нами метода выборок условно здоровых новорожденных и детей с диагностированными первичными иммунодефицитами по параметрам TREC (А) и KREC (Б)

Скачать (72KB)
Метаданные
6. Рисунок 5. ROC-кривые, построенные при сравнении результатов анализа с использованием модифицированного нами метода выборок взрослых условно здоровых лиц и больных с диагностированными первичными иммунодефицитами по параметрам TREC (А) и KREC (Б)

Скачать (72KB)
Метаданные
7. Рисунок 6. ROC-кривые, построенные при сравнении результатов анализа с использованием модифицированного нами метода выборок взрослых условно здоровых лиц и ВИЧ-инфицированных больных: с вирусологической неэффективностью АРТ по параметрам TREC (А) и KREC (Б); с недавно выявленной инфекцией ВИЧ по параметрам TREC (В) и KREC (Г)

Скачать (127KB)
Метаданные

© Сайтгалина М.А., Останкова Ю.В., Любимова Н.Е., Семенов А.В., Кузнецова Р.Н., Тотолян А.А., 2022

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».