DETERMINATION OF THE TOTAL CONTENT OF PHENYLPROPANOIDS IN THE GRASS FAGOPYRUM RUBRICAULIS, GROWING IN THE PENZA REGION

Full Text

Введение На территории Российской Федерации широко культивируются растения, характеризующиеся активным синтезом вторичных метаболитов, в частности, полифенольных соединений, обладающих широким спектром действия [1, 8]. Одним из перспективных растений является гречиха красностебельная (Fagopyrum rubricaulis), семейство гречишные (Polygonаceae). Согласно данным исследований, в надземной части гречихи красностебельной содержатся флавоноиды (рутин, кверцетин, изокверцетин и др.), фенилпропаноиды (хлорогеновая и кофейная кислоты), фенолкарбоновые (протокатеховая и галловая), органические кислоты, каротиноиды, белки, витамины группы В [10-11]. Кроме того, в сырье гречихи сорта Башкирская красностебельная обнаружены флаванолы и проантоцианидины [12]. Экстракты гречихи оказывают ангио-, кардиопротективное, адаптогенное, антиоксидантное, противовоспалительное, антибактериальное, гипогликемическое действие [14]. Широкий спектр фармакологических эффектов характеризирует гречиху красностебельную как перспективный источник сырья для разработки лекарственных средств, но для этого необходимо определить нормируемые показатели и разработать методы количественного определения биологически активных соединений. Основная проблема при количественном определении фенилпропаноидов в сырье гречихи красностебельной заключается в содержании разных классов полифенольных соединений. Они имеют сходные полосы поглощения в ультрафиолетовой области спектра, что затрудняет их идентификацию методом прямой спектрофотометрии. [3, 4, 9]. Для получения достоверного результата необходимо использовать модификации спектрофотометрического метода: предварительная твердофазная экстракция [13], хромато-спектрофотометрия [4], экстракционная спектрофотометрия, метод Фирордта в спектрофотометрии и спектрофотометрия с использованием реактива Арнова [5, 7]. При анализе известных модификаций в научной литературе было обнаружено, что предварительная твердофазная экстракция является одним из доступных, простых, быстрых и дешевых методов предварительной очистки суммарного извлечения. Цель исследования - идентификация, и количественное определение суммарного содержания фенилпропаноидов в надземной части гречихи красностебельной. Методика Материалом для исследования служила собранная в фазу массового цветения и начала плодоношения гречихи красностебельной трава. Сбор проходил в Камешкирском районе Пензенской области в период с 26.07.24 по 01.08.24. Траву гречихи красностебельной сушили в сушильных шкафах (ШС-80-02 СПУ) при температуре не превышающей 40°C. Сырье измельчали на лабораторных мельницах (ML-08B, Китай). Экстракцию фенилпропаноидов из травы гречихи красностебельной проводили с использованием этилового спирта различных концентраций (40%, 70% и 95%). Процесс экстракции проводился методом мацерации при температуре 90°C. Наличие фенилпропаноидов в водно-спиртовых экстрактах было подтверждено с помощью тонкослойной хроматографии на пластинах марки «Sorbifil» ПТСХ-П-В-УФ (Россия). Элюирование проводили с использованием системы н-бутанол-ледяная уксусная кислота-вода (4:1:2). После полного высыхания детекцию проводили с использованием 1%-ного раствора хлорида железа(III). Для разработки метода количественного определения содержания фенилпропаноидов в траве гречихи красностебельной был использован спектрофотометрический метод с предварительной твердофазной очисткой. Для твердофазной очистки использовали нейтральный оксид алюминия (Al2O3). Определение оптической плотности проводили на спектрофотометре СФ-102 (ЗАО «НПКФ Аквилон», Россия). Для расчета суммарного содержания фенилпропаноидов в пересчете на хлорогеновую кислоту в сырье гречихи красностебельной использовали удельный показатель поглощения при 330±2 нм равный 497 [6]. Статистическая обработка результатов исследования и валидация методики проводились в соответствии с ОФС.1.1.0012 «Валидация аналитических методов» и ОФС.1.1.0013 «Статистическая обработка результатов физических, физико-химических и химических испытаний» Государственной фармакопеи Российской Федерации XV издания [2] с использованием компьютерных программ Microsoft Office Excel 2019. Результаты исследования и их обсуждение В экстрактах гречихи красностебельной методом тонкослойной хроматографии в системе растворителей n-бутанол-ледяная уксусная кислота-вода (4:1:2) было обнаружено несколько зон адсорбции со значениями Rf 0,28-0,82. После высыхания зона с Rf 0,28 при просмотре в ультрафиолетовом свете имела голубое окрашивание при 365 нм и светло-коричневое при 254 нм, а зоны адсорбции от 0,41-0,82 имели желто-коричневый цвет (предположительно флавоноиды). После обработки пластины 1% раствором железа хлорида (III) пятно с Rf 0,28 окрашивалось в светло-зеленый цвет, что соответствовало величине Rf и окраске стандартного образца хлорогеновой кислоты. Анализ результатов, полученных прямой УФ-спектрометрией извлечений гречихи красностебельной травы, показал наличие максимума поглощения в виде плеча при длине волны 330-350 нм. Учитывая, что максимум поглощения в диапазоне 330-350 нм имеют не только фенилпропаноиды, но и другие фенольные соединения, в частности флавоноиды, необходима предварительная пробоподготовка извлечений. Для снижения влияния флавоноидов на спектральные характеристики извлечений проводили очистку через слой алюминия оксида. Как видно на рис. 1, пики спектра поглощения очищенного экстракта гречихи красностебельной соответствуют максимуму поглощения СО хлорогеновой кислотой. Поэтому при количественном определении суммы фенилпропаноидов в экстрактах травы гречихи красностебельной пересчет производили на хлорогеновую кислоту. Рис. 1. Электронные спектры стандартного образца хлорогеновой кислоты (2) и 40% спиртового извлечения из надземной части Fagopyrum rubricaulis после очистки через слой алюминия оксида (1) На начальных этапах разработки методики количественного определения фенилпропаноидов были определены оптимальные условия экстрагирования сырья гречихи красностебельной. Результаты эксперимента представлены в таблице 1. Таблица 1. Оптимальные параметры экстракции гречихи красностебельной травы Исследуемый параметр извлечения Содержание суммы фенилпропаноидов в пересчете на хлорогеновую кислоту, % Степень измельчения, мм 1 2 3 1,62±0,10 1,75±0,05 1,69±0,21 Экстрагент Спирт этиловый 40% 70% 95% 2,81±0,09 2,14±0,12 1,62±0,09 Соотношение «сырье-экстрагент» 1:25 1:50 1:100 2,18±0,13 2,39±0,05 2,30±0,11 Время экстракции, мин 30 60 90 2,98±0,16 2,71±0,10 2,55±0,09 В результате пяти параллельных определений установлено среднее значение (Хср=2,75%), стандартное отклонение (S=0,08), дисперсия (S2=0,007), полуширина доверительного интервала (ΔX=0,06). Погрешность единичного определения (ε, %) суммы фенилпропаноидов с доверительной вероятностью (Р, %) 95% в сырье гречихи красностебельной составила ±2,18%. Валидацию методики проводили в соответствии с ОФС.1.1.0012 «Валидация аналитических методик» Государственной Фармакопеи РФ XV издания по показателям: специфичность, линейность, прецизионность. Специфичность методики оценивали по соответствию максимумов поглощения экстракта из гречихи красностебельной травы и раствора стандартного образца хлорогеновой кислоты (рис. 1). Линейность методики определяли для серии аналитических проб с концентрацией фенилпропаноидов от 16 до 74 мг/мл). По полученным данным построили график зависимости значений оптической плотности раствора извлечения от концентрации хлорогеновой кислоты, а затем рассчитали уравнение линейной регрессии (рис. 3). Коэффициент корреляции составил 0,9873. Рис. 3. Зависимость значений оптической плотности проб от содержания суммы фенилпропаноидов в гречихе красностебельной траве Прецизионность методики (уровень повторяемости) оценивали путем анализа исследуемого образца гречихи красностебельной в 5-кратной повторности при одинаковых условиях. Согласно полученным результатам среднее значение составило 2,84%, ошибка единичного определения с доверительной вероятностью 95% составляет ±2,44%. Для оценки внутрилабораторной прецизионности количественный анализ спиртового экстракта проводился другим аналитиком в другие дни с использованием того же оборудования пятикратно (табл. 3). Выявлено, что ошибка единичного определения с доверительной вероятностью 95% составляет не более 2,2% при определении суммы фенилпропаноидов методом спектрофотометрии в пересчете на хлорогеновую кислоту. Следовательно, дисперсии результатов анализа обоих химиков статистически эквивалентны и различия между полученными значениями являются случайными. Таблица 3. Валидацонная оценка внутрилабораторной прецизионности методики определения суммы фенилпропаноидов в гречихи красностебельной траве (Р=95; n=5) Аналитик 1 Аналитик 2 С,% Метрологические характеристики С,% 2,79 X,% = 2,83 X,% = 2,71 2,62 2,72 S2 = 0,0050 S2 = 0,0045 2,68 2,88 S = 0,0709 S = 0,0672 2,74 2,85 ΔX,% = 0,0621 ΔX,% = 0,0589 2,80 2,89 ε,% = 2,19 % ε,% = 2,17 2,70 Полученные данные свидетельствуют об отсутствии систематической ошибки разработанной нами методики и позволяют предложить ее для количественного определения суммарного содержания фенилпропаноидов в гречихи красностебельной траве в пересчете на хлорогеновую кислоту. С помощью разработанной методики была проанализирована биологически активная добавка к пище «Гречиха красностебельная. Кулясово & Мамадыш» производства ООО «Парафарм» (Серия: 0424). Содержание суммы фенилпропаноидов, в пересчете на хлорогеновую кислоту, варьировало от 2.62±0.14-2.98±0.16%. Заключение С помощью тонкослойной хроматографии были идентифицированы фенилпропаноиды в экстрактах гречихи красностебельной. Разработан метод количественного определения суммы фенилпропаноидов методом дифференциальной спектрофотометрии после твердофазной очистки с использованием удельного показателя поглощения хлорогеновой кислоты (497) при 330 нм. Определено содержание фенилпропаноидов в пересчете на хлорогеновую кислоту в водно-спиртовых экстрактах гречихи красностебельной: от 2,62±0,14% до 2,98±0,16%. Установлены оптимальные параметры экстракции фенилпропаноидов из травы гречихи красностебельной: экстрагент - спирт этиловый 40%; соотношение «сырье-экстрагент» - 1:50; продолжительность - 30 мин.; температура - 90°С. Проведена валидационная оценка разработанной методики. На основании результатов валидационной оценки эксперимента можно сделать вывод, что данный метод может быть использован для количественного определения содержания фенилпропаноидов в сырье гречихи красностебельной в пересчете на хлорогеновую кислоту. Полученные результаты имеют важное значение для дальнейших исследований гречихи красностебельной в качестве потенциального источника биологически активных соединений.

About the authors

A. V Mitishev

Penza State University

Email: span2361@rambler.ru
старший преподаватель кафедры «Общая и клиническая фармакология» ФГБОУ ВО «Пензенский государственный университет» 40, Krasnaya St., 440026, Penza, Russia

M. G Makartseva

Penza State University

Email: makartsevamm@mail.ru
студентка лечебного факультета ФГБОУ ВО «Пензенский государственный университет» 40, Krasnaya St., 440026, Penza, Russia

V. S Pogodina

Penza State University

Email: lerapogodina25@gmail.com
студентка лечебного факультета ФГБОУ ВО «Пензенский государственный университет» 40, Krasnaya St., 440026, Penza, Russia

E. V Polyakova

Penza State Agrarian University

Email: bio_vetsan@pgau.ru
кандидат биологических наук, доцент, заведующий кафедры «Биология, биологические технологии и ветеринарно-санитарная экспертиза» ФГБОУ ВО «Пензенский государственный аграрный университет» 30, Botanicheskaya St., 440014, Penza, Russia

O. M Hishova

Vitebsk State Order of Peoples' Friendship Medical University

Email: olg.khishova@yandex.ru
доктор фармацевтических наук, профессор, заведующий кафедры «Фармацевтических технологий с курсом ФПК и ПК» УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет» 210009, Frunze Av., 27, Vitebsk, Republic of Belarus

E. E Kurdyukov

Penza State University

Email: e.e.kurdyukov@mail.ru
кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры «Общая и клиническая фармакология» ФГБОУ ВО «Пензенский государственный университет» 40, Krasnaya St., 440026, Penza, Russia

References

Supplementary files