Comparative analysis of DNA extraction methods from frozen black currant leaves

Full Text

Введение

Смородина чёрная (Ribes nigrum L.) – урожайная и доходная культура, которая занимает особое место среди широко распространенных ягодных культур садов России. Популярность её объясняется витаминной ценностью плодов, неприхотливостью к условиям возделывания, высокой и стабильной продуктивностью (Жидёхина и др., 2007; Князев и др., 2016; Сазонова, 2017). Урожайность современных сортов смородины чёрной отечественной селекции составляет от 10,5 до 12,5 т/га, максимально до 15,0 т/га (Евдокименко и др., 2022). Смородина чёрная является одним из лидеров среди ягодников по накоплению в плодах витамина С, для обеспечения суточной потребности в аскорбиновой кислоте достаточно всего 15…20 ягод смородины. Кроме аскорбиновой кислоты ягоды содержат каротин, сахара, витамины Р, В, пектиновые вещества, органические кислоты, антоцианы, соли калия, кальция, железа, магния, натрия, марганца и фосфора (Макаркина и др., 2017; Сазонова, 2021). Культивирование смородины чёрной представляет экономический интерес благодаря возможности механизации большинства агротехнических мероприятий при возделывании, включая уборку урожая (Князев и др., 2014; Сазонов, Даньшина, 2016; Panfilova et al., 2021).

Методы молекулярной селекции растений позволяют создавать принципиально новые сорта для решения проблем продовольственной безопасности, повышения уровня жизни и здоровья населения (Куликов и др., 2021). На сегодняшний день для ускорения селекционного процесса большое значение имеют ДНК-технологии для защиты авторских прав оригинаторов сортов. Поэтому, для оценки генетического разнообразия, так важно использовать наиболее эффективные молекулярно-генетические методы, в том числе и метод выделения ДНК. Выделение ДНК является первым этапом оценки генетического разнообразия, от качества проведения которого зависит вся результативность дальнейших исследований (получение и разделение ПЦР фрагментов по длинам). Разрушение клеточной мембраны в классических методах выделения ДНК обычно проводят механическим путем в водных растворах в присутствии детергентов и хелатирующих агентов, подавляющих нуклеазную активность. Удаление белковых примесей осуществляют в ходе экстракции фенолом или с помощью депротеинизирующего препарата с протеиназной. Процедура последующей очистки весьма разнообразна и в большей степени зависит от целей эксперимента (Edwardsetal., 1991; Pomsetal., 2001; Пикунова и др., 2019).

С целью совершенствования метода выделения ДНК нами была проведена оценка эффективности различных способов экстракции ДНК из замороженных листьев смородины черной коллекции ФНЦ Садоводства для дальнейшей оценки генетического разнообразия с помощью SSR-маркеров. Установление уникальных генетических профилей смородины чёрной на сегодняшний день является актуальной задачей, решение которой позволит в дальнейшем проводить точную идентификацию сорта для его паспортизации. Для решения поставленных задач на первом этапе необходимо было определить наиболее эффективный способ выделения ДНК, осуществив подбор и сравнительный анализ различных вариантов выделения ДНК из замороженных листьев смородины чёрной и модифицировать их при необходимости.

 

Материалы и методы

Объектами исследования были 12 сортов смородины черной селекции ФГБНУ ФНЦ Садоводства (Бармалей, Брянский Агат, Дебрянск, Миф, Чародей, Гамаюн, Стрелец, Вера, Кудесник, Фаворит, Каскад, Подарок Ветеранам). Представленные сорта относятся к наиболее перспективным для изучения их генетического разнообразия, так как обладают ценными хозяйственными признаками (зимостойкость, устойчивость к засухе, мучнистой росе, листовым пятнистостям, почковому клещу), но не изучены всесторонне (Сазонов, 2021). Отобранные листья смородины чёрной были заморожены на два месяца в кельвинаторе U535 Innovaс температурой ниже минус 70ºС. Для оценки эффективности способов выделения ДНК из замороженных листьев смородины черной были выбраны четыре различных способа выделения растительной ДНК из замороженных листьев по методике, предложенной D. Puchooa (2004) для растительного материала с высоким содержанием полифенольных соединений с модификациями; способ выделения ДНК из косточковых культур с модификациями, используемый в ФНЦ Садоводства; коммерческий набор для выделения растительной ДНК «СОРБ-ГМО-Б» (ЗАО Синтол); коммерческий набор для выделения растительной ДНК «Plant DNA Isolation Kit» (FOREGENE) (Наборы реагентов для выделения ДНК; Набор для выделения ДНК, FOREGENE, Китай).

На первом этапе были выделены образцы растительной ДНК из 12 сортов смородины чёрной в двух повторностях от каждого сорта четырьмя разными способами в количестве 96 проб с ДНК. Для выделения ДНК смородины во всех случаях брали по 100 мг замороженных листьев на каждую пробу. Выделение ДНК по D. Puchooa (2004) выполнялось в следующем порядке: измельчили пробы в присутствии лизирующего раствора (100mМ Tris pH=8.0, 20mМ EDTA pH=8.0, 2М NaCl, 2% поливинилпироллидон, 5% меркаптоэтанол, 2% СТАВ, 10 mМ AcNH₄); после нагревания при 60°С осадили клеточный дербис с помощью хлороформа; отобрали и перенесли в верхнюю фазу в новую пробирку; повторно добавили хлороформ и повторили процедуру; осадили осадок с помощью изопропанола и слили жидкость; промыли осадок буфером ТЕ, 75% этанолом, 10mМ AcNH4, а затем удалили жидкость; осадок подсушили до исчезновения блеска, затем растворили в ТЕ; повторно осадили ДНК с помощью изопропанола и слили жидкость; повторили отмывку с 70% и 80% растворами этанола; просушили осадок и растворили в воде высокой степени очистки (mQ).

Способ выделения ДНК из косточковых культур с модификациями проводили в следующем порядке: гомогенизировали образцы замороженных листьев в лизирующем CTAB-буфере (1М Трис, 0,5М ЭДТА, 5М NaCl, 2% ЦТАБ, 1,5% ПВП, 5% меркаптоэтанол); после инкубирования при 65°С в течение 60 минут, осадили клеточный дербис с помощью смеси хлороформа с изоамилового спирта (24 : 1); в отобранную и перенесенную в чистую пробирку надосадочную жидкость добавили чистый изопропиловый спирт охлаждённый до минус 20°С и оставили осаждаться при минус 20°С в течение 30…60 минут; осадили ДНК с помощью центрифугирования; провели многократную очистку с помощью 70% раствора этилового спирта и подсушили; растворили ДНК в дистиллированной автоклавированной воде.

Выделение ДНК двумя коммерческими наборами проводились в строгом соответствии с инструкцией к набору. Оценку эффективности выделения ДНК и её качества проводили вначале с помощью изменения концентрации ДНК на спектрофотометре BioSpectrometer Eppendorf fluorescence, а затем провели ПЦР-анализ для определения SSR-маркеров. Оценка результатов измерения на спектрофотометре проводилась по следующим параметрам: общее количество ДНК (нг/мл); отношение поглощения на длинах волн 260 и 280 нм (A260/280) для оценки чистоты препарата оптимальный показатель – 1,8…1,9; отношение поглощения на длинах волн 260 и 230 нм (А260/230), для оценки чистоты препарата оптимальный показатель около 1,8.

ПЦР-анализ проводился с помощью 12 пар специфичных праймеров к 12 SSR-маркеров (e1-021, g2-H21, g2-L17, e4-D03, g1-E03, g2-B20, g1-M07, e3-B02, e1-001, g1-K04, g2-J08, g2-G12) (Межнина, Урбанович 2017). Выполнен классический метод ПЦР с отдельной амплификацией с каждой парой праймеров на амплификаторе Gene Explorer (BIOER). Реакцию амплификации проводили в реакционной смеси объемом 20 мкл, содержащей 2,5 мкл 0,2 мМ dNTP; 2,5 мкл 10хПЦР буфер; 0,5 мкл 0,3Е Taq ДНК-полимераза; 2,5 мкл 25мМ MgCl₂, 1мкл 0,5 мкМ праймера и 100 нг геномной ДНК на реакцию, в термоциклере Gene Explorer (BIOER) в режиме: предварительная денатурация – 15 мин. при 94ºС, 35 циклов повторяется: денатурация – 30 сек. при 94ºС; отжиг праймеров – 45 сек. 50…56ºС в зависимости от температуры плавления праймеров; синтез ДНК – 1 мин. при 72ºС; элонгация – 5 мин. при 72ºС.

Детекция ПЦР продуктов проводилась при помощи электрофореза в 2% агарозном геле в режиме постоянного напряжения 100 V.

 

Результаты и их обсуждение

Оценка выбранных способов выделения ДНК проводилась в три этапа. На первом этапе были выделены образцы растительной ДНК из 12 сортов чёрной смородины в двух повторностях от каждого сорта четырьмя разными способами. Повторно провели выделение ДНК способом по D. Puchooa и используемым в ФНЦ Садоводства способом выделения ДНК из косточковых культур с модификациями, позволяющими увеличить выход ДНК из смородины черной высокого качества. Оба апробированных способа выделения ДНК достаточно трудоёмки и занимают в среднем от 6 до 7 часов. На втором этапе все выделенные образцы были проанализированы на спектрофотометре. По результатам измерения концентрации выделенной растительной ДНК были отобраны образцы ДНК из нескольких повторов, наиболее высокого качества для дальнейшего ПЦР анализа (таблица 1).

После выделения растительной ДНК из листьев 12 сортов смородины чёрной различными методами полученные образцы ДНК были протестированы на пригодность к проведению ПЦР анализа. Оценка эффективности ПЦР проводилась посредством сопоставления полученных результатов ПЦР выделенной ДНК четырьмя указанными способами. ПЦР продукты предварительно визуализировали на агарозном геле для подтверждения успешной амплификации нужных участков ДНК смородины черной (рисунок 1).

 

Таблица 1 – Результаты измерения концентрации ДНК в образцах смородины чёрной с вычислением поглощения на длинах волн 260/280 и 260/230 нм

Сорт	Способ выделения ДНК (по D. Puchooa, 2004)*			Способ выделения ДНК (используемый в ФНЦ Садоводства)*			Набор для выделения растительной ДНК «СОРБ-ГМО-Б» (ЗАО Синтол)			Набор для выделения растительной ДНК «Plant DNA Isolation Kit» (FOREGENE)
	нг/мл	А260/А280	А260/А230	нг/мл	А260/А280	А260/А230	нг/мл	А260/А280	А260/А230	нг/мл	А260/А280	А260/А230
Бармалей	151,1	1,41	1,77	297,5	2,03	1,79	36,1	1,96	1,81	70,1	1,91	1,88
Брянский Агат	148,3	1,56	1,81	310,1	2,02	1,86	55,9	1,95	1,88	65,8	1,94	1,91
Дебрянск	170,6	1,62	1,85	384,9	1,99	1,89	44,2	2,08	1,91	76,5	2,08	1,82
Миф	210,2	1,76	1,56	567,9	1,93	1,86	52,3	1,97	1,93	33,1	1,96	1,81
Чародей	225,3	1,26	1,62	259,9	2,03	1,89	60,9	1,94	2,3	59,9	1,96	1,88
Гамаюн	162,4	1,78	1,73	326,4	2,01	1,92	93,5	2,01	1,84	44,2	2,13	1,90
Стрелец	136,6	1,92	1,79	335,3	1,99	1,91	40,9	2,01	1,88	67,6	1,97	1,84
Вера	159,6	1,59	2,61	297	2,02	1,86	55,5	2,06	1,92	72,9	2,03	1,79
Кудесник	125,8	1,88	1,46	239,1	1,93	1,94	39,6	1,96	1,84	46,4	2,06	1,87
Фаворит	110,3	2,01	2,52	173,0	2,07	1,94	73,6	1,99	1,93	58,1	1,96	1,88
Каскад	126,7	1,89	2,01	208,2	2,00	1,85	55,7	1,78	1,88	63,8	2,09	1,91
Подарок Ветеранам	134,1	1,72	1,86	189,4	1,99	1,87	56,0	1,82	1,97	48,6	1,97	1,79

Примечание: звездочкой отмечены методы выделения ДНК с модификацией

 

Рисунок 1 – Электрофореграмма продуктов амплификации с SSR праймерами на 12 сортах смородины черной (2% агарозный гель, окрашенный бромистым этидием; ММ-маркер молекулярного веса)

 

ПЦР-анализ с помощью 12 SSR-маркеров выполненный классическим методом ПЦР позволил визуализировать каждый локус отдельно и оценить возможность его дальнейшего разделения на генетическом анализаторе (рисунок 2).

Рисунок 2 – Электрофореграмма продуктов амплификации с праймерами25G1-K04

 

Параметрами оценки являлись уровень чувствительности ПЦР и воспроизводимость результатов ПЦР в процентах, рассчитанных на каждый метод отдельно, с учетом наличия/отсутствия фоновой амплификации (шмеры на электрофореграмме) (таблица 2).

 

Таблица 2 – Оценка эффективности выделения растительной ДНК из листьев смородины чёрной по результатам обнаружения продукта ПЦР после электрофоретической детекции в 2% агарозном геле

Сорт	Способ выделения ДНК (по D. Puchooa, 2004)*		Способ выделения ДНК (используемый в ФНЦ Садоводства)*		Набор для выделения растительной ДНК «СОРБ-ГМО-Б» (ЗАО Синтол)		Набор для выделения растительной ДНК «Plant DNA Isolation Kit» (FOREGENE)
	Проба1	Проба2	Проба1	Проба2	Проба1	Проба2	Проба1	Проба2
Бармалей	+	+	+	+	+	+	+	+/-
Брянский Агат	-	+	+	+	+	+	+	+
Дебрянск	+	+	+	+	+	+	+	+
Миф	+	+	+	+	+	+	+	+
Чародей	+	+	+	+	+	+	+	+
Гамаюн	+	+	+	+/-	+/-	-	+	+
Стрелец	+/-	-	+	+	+	+	+/-	+
Вера	+	+/-	+	+	+	+	+	+
Кудесник	+	+	+	+	+	+	+	+
Фаворит	+	+/-	+	+	+	+	+	+
Каскад	+	+	+	+	+	+	+	+
Подарок Ветеранам	+	+	+	+	+	+	+	+/-
Чувствительность ПЦР, %	0,5		0,1		0,1		0,1
Воспроизводимость результатов ПЦР, %	81		99		92		88
Наличие фоновой амплификации	+		-		-		+

Примечания: звездочкой выделены методы выделения ДНК с модификацией; плюс (+) – обнаружены продукты ПЦР; минус (-) – не обнаружены продукты ПЦР; плюс/минус (+/-) – сомнительный результат.

 

Чувствительность ПЦР анализировали после разведения полученных продуктов ПЦР и визуализации их посредством электрофореза. В первой пробирке концентрация раствора составила 1 : 10, во второй – 1 : 100, в третьей – 1 : 1000, и так далее. Вместе с чувствительностью ПЦР также параллельно оценивалась воспроизводимость результатов ПЦР, путем постановки каждого из разведенного образца ПЦР в двух повторностях (проба 1 и проба 2) для подсчета процента обнаружения/отсутствия продуктов ПЦР.

Результат ПЦР анализа показал, что наилучшие показатели эффективности метода (чувствительность – 0,1%, воспроизводимость – 99%, отсутствие фоновой амплификации) были получены у образцов, выделенных способом используемым в ФНЦ Садоводства. На втором месте по эффективности оказался коммерческий набор «СОРБ-ГМО-Б» (ЗАО Синтол), чувствительность которого составила 0,1%, воспроизводимость 92% и также отсутствовала фоновая амплификация. На третьем месте по эффективности оказался коммерческий набор для выделения растительной ДНК «Plant DNA Isolation Kit» (FOREGENE). Его чувствительность составила 0,1%, воспроизводимость 88%, при этом были обнаружены шмеры на электрофореграмме. Метод выделения растительной ДНК по D. Puchooa (2004), показал среднюю чувствительность (0,5%), невысокую воспроизводимость результатов ПЦР (81%), а также выявлены фоновые продукты амплификации.

 

Заключение

По результатам оценки эффективности выделения ДНК из замороженных листьев 12 сортов смородины черной селекции ФГБНУ ФНЦ Садоводства удалось выделить наиболее эффективные и нетрудоемкие способы выделения ДНК. Результаты оценки эффективности способов выделения ДНК из замороженных листьев смородины чёрной готовыми коммерческими наборами показали небольшой выход ДНК (в среднем 30 нг/мл), сравнительно высокую чистоту выделенного образца, что подтверждено результатами эффективности ПЦР анализа, при этом оказались менее трудоемкими, чем два других способа.

Полученные результаты исследований позволяют рекомендовать для выделения ДНК из замороженных листьев смородины чёрной для оценки генетического разнообразия культуры с помощью SSR-маркеров способ выделения ДНК из косточковых культур с модификацией, используемый в ФНЦ Садоводства, так как он, несмотря на свою трудоемкость в исполнении, является эффективным и даёт высокий выход ДНК (170…380 нг/мл), которой хватает на большое количество ПЦР реакций.

 

Финансирование

Работа выполнена в рамках государственного задания по теме «FGUW-0432-2022-0001 Воспроизводство и сохранение ценных генотипов плодовых и ягодных культур методами новых биотехнологий».

 

Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

 

Отказ от ответственности: заявления, мнения и данные, содержащиеся в публикации, принадлежат исключительно авторам и соавторам. ФГБНУ ВНИИСПК и редакция журнала снимают с себя ответственность за любой ущерб людям и/или имуществу в результате использования любых идей, методов, инструкций или продуктов, упомянутых в контенте.

About the authors

Alla A. Guzeeva

Federal Horticultural Center for Breeding, Agrotechnology and Nursery

Email: alla1988.88@mail.ru

PhD student

Russian Federation

Irina A. Kapitova

Federal Horticultural Center for Breeding, Agrotechnology and Nursery

Author for correspondence.
Email: kiastandart@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-3629-4461

Candidate of Chemistry Sciences

Russian Federation

Fedor F. Sazonov

Federal Horticultural Center for Breeding, Agrotechnology and Nursery

Email: sazon-f@yandex.ru
SPIN-code: 1494-7253

Doctor of Agricultural Sciences

Russian Federation

References

Supplementary files