Features of pollen from plum cultivars in the Ural

Full Text

Введение

Изучение особенностей генеративной сферы представителей генетической коллекции сливы (Prunus L.) имеет значение для селекционного процесса, поскольку образцы являются источником материала для гибридизации и получения перспективных форм на Урале. Многообещающим направлением в получении адаптивных форм является отдаленная гибридизация (Мочалова, Матюнин, 2002; Путов, 1974).

В Уральском регионе аборигенных видов сливы нет, практическое значение имеют зимостойкие виды (Слепнева, Исакова, 2018; Слепнева, Матюнин, 2020; Исакова, 2021). Так для регионов с резко-континентальным климатом зарекомендовали себя межвидовые гибриды между восточно-азиатской сливой уссурийской (Prunus ussuriensis Kovalev & Kostina) и северо-американской сливой карзинской (P. americana Marshall), гибриды от свободного опыления сливы уссурийской (например, Пионерка, Катунская, Пирамидальная, Горлица, Даная, Золотая нива, Шершневская), а также сорта, полученные в ходе повторной гибридизации межвидовых гибридов с сортами указанных видов (Мочалова, Матюнин, 2002). Нередко для получения современных зимостойких сортов в гибридизации используются отборные формы видов восточноазиатского происхождения: сливы китайской P. salicina Lindl. (например, Желтая Хопты), сливы Симона P. simonii (Decne.) Carrière и их гибриды (например, Маньчжурская красавица). В создании сортимента на Урале также участвуют виды переднеазиатского происхождения: алыча P. cerasifera Ehrh. (сорт Аштаракская 2), P. cerasifera var. pissardii (Carrière) Koehne, тернослива P. insititia L., гибриды терна P. spinosa L. и сливы домашней P. domestica L., североамериканский вид слива канадская P. nigra Aiton.

Основными показателями пыльцы, от которых напрямую зависит продуктивность плодовых растений, являются фертильность и жизнеспособность (Мочалова, Матюнин, 2002; Тихонова и др., 2020). Особенности пыльцы необходимо учитывать в связи с исследованием механизмов мужской стерилизации, полиплоидизации, нарушений микроспорогенеза, микрогаметогенеза у отдаленных гибридов (Guo, Zheng 2004; Кравец, 2013). Исследования пыльцы у сливы необходимы при обсуждении результатов гибридизации видов с разной плоидностью, изучении цитомиксиса, поиске доноров нередуцированных гамет (Еремин, 2018; Мочалова, Матюнин, 2002).

Цель исследования – изучение морфологических особенностей пыльцы пяти уральских сортов сливы и анализ ее качества с помощью оценки фертильности и жизнеспособности пыльцевых зерен.

Материалы и методы

Объектами исследований служили зарегистрированные в Государственном реестре селекционных достижений РФ сорта: Уральская золотистая, Пионерка, Эвридика, Доминика, Сапфир, допущенные к использованию по Уральскому региону (Слепнева, Матюнин, 2020; Слепнева, Гасымов, 2022). Они возделываются в отделе плодовых и ягодных культур Свердловской селекционной станции садоводства УрФАНИЦ УрО РАН, где входят в состав коллекции живых растений открытого грунта Уникальная научная установка «Генофонд плодовых, ягодных и декоративных культур на Среднем Урале» (Слепнева, Макаренко, 2020). Будучи востребованы у садоводов-любителей, широкое распространение получили Уральская золотистая, Пионерка, созданные в условиях Урала. Новые сорта Эвридика, Доминика, Сапфир получены в результате отдаленной межвидовой гибридизации (таблица 1) в результате совместной работы с М.Н. Матюниным (Опытная станция «Горно-Алтайское» – филиал ФГБНУ ФАНЦА).

 

Таблица 1 – Объекты исследования

Сорт	Регионы, рекомендованные к выращиванию	Авторы, год включения в Госреестр	Происхождение	Признаки плодов
Доминика	Уральский	Матюнин М.Н., Слепнева Т.Н., 2023	F1 Желтая Хопты × Аштаракская 2	Основная окраска плода желтая, покровная синяя с сильным восковым налетом
Пионерка	Уральский, Волго-Вятский	Гвоздюкова Н.И., Исакова М.Г., 1969	Гибрид от свободного опыления отборной формы сливы уссурийской №2	Основная окраска плода оранжевая, покровная темно-красная
Сапфир	Уральский	Матюнин М.Н., Слепнева Т.Н., 2020	Катунская × F1 (Аштаракская 2 × Пирамидальная)	Основная окраска плода желтая, покровная синяя с сильным восковым налетом
Уральская золотистая	Уральский	Муллаянов К.К., Гасымов Ф.М., 2004	Кызыл пионер × Желтая Хопты	Основная окраска плода желтая, покровная желтая
Эвридика	Уральский	Матюнин М.Н., Слепнева Т.Н., 2023	F1 P. cerasifera var. pissardii × P. ussuriensis	Основная окраска плода желтая, покровная бордовая со средним восковым налетом

 

Сбор пыльцы проводили на Челябинском государственном плодово-ягодном сортоучастке (Челябинская область, Красноармейский район). Массовое цветение сливы наблюдалось в I декаде мая. Весь материал для изучения особенностей пыльцы сортов собран 07 мая 2023. В 2023 году отмечалась стремительная весна: переход среднесуточной температуры через 0⁰С к 21 марта, переход через +5⁰С к 25 марта, переход через +10⁰С уже к 24 апреля. В апреле наблюдались резкие перепады суточных температур. Сумма температур выше 0⁰С к моменту цветения составила 256,8⁰С, сумма активных температур (выше 5⁰С) к моменту цветения составила 106⁰С, а сумма эффективных температур (выше 10⁰С) составила 30,6⁰С. Амплитуда перепада температур в дневное и ночное время суток во время цветения составляла 29,1⁰С. Метеорологические данные получены на основе архива погоды из открытого онлайн источника (http://www.pogodaiklimat.ru).

С деревьев одного сорта в сухую погоду собирали не менее 20 хорошо развитых бутонов, а затем в камеральных условиях отделяли пыльники, вскрывали их, отряхивали и сушили пыльцу при комнатной температуре в течение двух дней. Отбор и хранение пыльцы проводилось в бумажных пакетах, на которых отмечали сортность и дату сбора. Анализ фертильности и стерильности пыльцы проводили в течение недели после заготовки материала.

В исследованиях фертильности и жизнеспособности пыльцы использован оптический бинокулярный микроскоп Микмед-6 (АО Ломо, Россия). Оценку фертильности проводили согласно общепринятой цитоэмбриологической методике с помощью ацетокарминового метода (Паушева, 1988). Пыльцевые зерна помещали в каплю ацетокармина под покровное стекло, подсушивали препарат над пламенем спиртовки и просматривали при увеличении микроскопа 40 × 10. Стерильная пыльца не окрашивается или слабо окрашивается кармином. У нормально сформированной фертильной пыльцы цитоплазма зернистая и густо окрашивается в бордовый цвет. В 10 полях зрения подсчитывали количество прокрашенных фертильных и неокрашенных стерильных пыльцевых зерен. Фертильность определяли отношением количества прокрашенных пыльцевых зерен к общему количеству просмотренных в каждом поле зрения.

Жизнеспособность пыльцы проверяли по Д.А. Транковскому (Паушева, 1988) методом проращивания на искусственной питательной среде, содержащей 15% сахарозы, 2% агар-агара. Опыт проводили в чашках Петри, куда наносили суспензию пыльцы в капле стерильной дистиллированной воды, время экспонирования 36 часов, температура 20…25⁰С. Для оценки результатов проращивания использовали световую микроскопию, изображения просматривали при увеличении 40 × 10. Проросшей считали пыльцу, сформировавшую пыльцевую трубку. Учитывали не менее 350 пыльцевых зерен в пяти полях зрения. Процент жизнеспособности пыльцы определяли отношением количества проросших пыльцевых зерен к общему количеству просмотренных в каждом поле зрения.

Для характеристики морфологических особенностей пыльцы использовали палинологическую терминологию (Куприянова, Алешина, 1978; Токарев, 2002). Для проведения измерений линейных размеров пыльцы воспользовались сканирующим электронным микроскопом Tescan Mira LMS с ускоряющим напряжением 20 кэВ в режиме вторичных электронов (SE) (ЦКП «Геоаналитик» на базе лаборатории физико-химических методов исследования минерального вещества Института геологии и геохимии им. акад. А.Н. Заварицкого УрО РАН). Углеродное напыление получено на установке для напыления токопроводящих покрытий Quorum Q150T ES. Измерения морфологических параметров проводили на микрофотографиях с учетом их масштаба.

Размеры высушенной пыльцы определяли с помощью программы Image J при обработке фотографий со сканирующего электронного микроскопа. Размеры пыльцы сливы сорта Сапфир определить не удалось, поскольку на препаратах, изготовленных из пыльников, не было свободно лежащих пыльцевых зерен, видна лишь поверхность экзины несозревших пыльцевых зерен, плотно лежащих внутри пыльника (рисунок 2f).

Статистическую обработку всех полученных данных провели с использованием программ MS Excel 2013 и Statistica 10.0. Первичная математическая обработка данных выполнена по методикам, изложенным Т.Н. Зайцевым (1973), в том числе сделан подсчет коэффициентов вариации (CV) изученных морфометрических признаков, среднего значения и среднеквадратического отклонения. Проведена проверка полученного объема данных на нормальность. Она была подтверждена лишь для показателя размеры полярной оси пыльцевых зерен. Поэтому для поиска статистически значимых различий по этому показателю использован однофакторный анализ ANOVA с последующим post-hoc анализом. Размеры экваториального диаметра пыльцевых зерен у изученных сортов сливы сравнивали иначе, с помощью непараметрических критериев Краскела-Уоллиса и U-критерия Манна-Уитни.

Результаты и их обсуждение

Оригинальные данные получены с помощью морфологических исследований пыльцевых зерен уральских сортов сливы Уральская золотистая, Пионерка, Эвридика, Доминика. Особенности пыльцы при окрашивании препаратов ацетокармином представлены на рисунке 1. Набухшие фертильные пыльцевые зерна изополярные, шаровидно-сплющенные, в очертании с полюса округленно-треугольные, широкоэлиптические с экватора, тип апертур бороздно-оровый.

 

a, b – Уральская золотистая, c – Пионерка, d, e – Эвридика, f – Доминика, g, h – Сапфир

Рисунок 1 – Исследования фертильности и жизнеспособности пыльцы сортов сливы под оптическим микроскопом

 

На микрофотографиях, полученных с помощью сканирующего электронного микроскопа, хорошо заметно, что у пыльцевых зерен 4 сортов в полярной проекции очертания треугольно-тупо-выпуклые, в экваториальной проекции – эллиптические, скульптура их поверхности струйчатая, зародышевые борозды глубокие, длинные, вдавленные, щелевидные, меридиальные (рисунок 2). Эти признаки соответствуют ранее сделанным описаниям особенностей морфологии пыльцы различных сортов P. domestica (Dordević et al., 2020) и, по-видимому, являются диагностическими в плане установления родовой принадлежности. Стерильные пыльцевые зерна изученных сортов имеют несимметричную неправильную форму (рисунок 2a).

 

а, b – Уральская золотистая, c, d – Эвридика, e – Пионерка, f – Сапфир

Рисунок 2 – Микрофотографии пыльцевых зерен уральских сортов сливы

 

Нами обнаружено, что линейные размеры пыльцевых зерен отличаются внутри сорта и между сортами. Наибольшая вариабельность размеров пыльцы наблюдали у сорта Уральская золотистая. Линейные размеры пыльцевых зерен у всех изученных сортов имеют коэффициент вариации в пределах интервала нормы (Зайцев, 1973). Согласно таблице 2, наименьшие размеры пыльцевых зерен имеет сорт Доминика, наибольшие — сорта Пионерка и Эвридика.

 

Таблица 2 – Размеры пыльцы уральских сортов сливы

Сорт	Длина полярной оси, мкм	Мин, мкм	Макс, мкм	CV, %	Экваториальный диаметр, мкм	Мин, мкм	Макс, мкм	CV, %
Уральская золотистая	27,86±4,95	20,1	39,6	17,8	18,91±4,82	10,1	31,7	25,5
Пионерка	34,91±3,39	26,7	40,5	9,7	26,83±4,38	15,4	31,9	16,3
Эвридика	33,08±5,87	24,9	43,1	17,8	22,43±3,07	14,2	28,1	16,5
Доминика	19,36±3,03	14,3	24,2	15,6	13,98±3,04	9,41	19,5	21,7

 

Важно, что у сортов близок показатель отношения длины полярной оси (P) к размеру экваториального диаметра (E) – индекс формы. Именно он позволяет делать объективный вывод о форме пыльцевых зерен (Popa et al., 2022). Согласно работам предшествующих авторов (Мотылева и др., 2016), эллипсоидальная форма при P/E = 1,87…2,04, широкоэллипсоидальная при P/E = 1,67…1,78 и округло-эллипсоидальная при P/E = 1,36…1,67. Для сортов Уральская золотистая и Эвридика он составляет 1,47, сорта Доминика 1,38, сорта Пионерка 1,41. Таким образом, форма изученных пыльцевых зерен округло-элипсоидальная.

Если проводить сравнение с сортовой домашней сливой, то размеры пыльцевых зерен изученных сортов значительно меньше. Так согласно данным сербских коллег, изучавших P. domestica, длина полярной оси не менее 53 мкм, а длина экваториального диаметра не менее 28 мкм (Dordević et al., 2020). Согласно палинологической базе данных (https://www.paldat.org/search/genus/Prunus), для видов P. spinosa, P. domestica размеры находятся в пределах 26…50 мкм. Таким образом, лишь у сорта Пионерка, Эвридика размеры сопоставимы с указанными видами, а у сортов Доминика, Уральская золотистая размеры пыльцевых зерен меньше, чем у терна и домашней сливы.

Однофакторный ANOVA с последующим post-hoc анализом (таблица 3) показали, что нет достоверных отличий по длине полярной оси пыльцевых зерен лишь между сортами Эвридика и Пионерка, а в остальных случаях присутствует разница (F(3, 83) = 43,799, p < 0,00001). Сравнение сортов по размеру экваториального диаметра пыльцевых зерен с помощью критерия Краскела-Уоллиса показало, что между всеми изученными сортами есть достоверная разница (H (3, 87) = 48,09812 p < 0,00001), что дополнительно подтвердил U-критерий, везде p < 0,05 (таблица 4). Изучение морфологических особенностей, в том числе линейных размеров пыльцы сортов сливы может быть полезно при обсуждении их функциональных особенностей.

 

Таблица 3 – Результаты сравнения сортов по длине полярной оси с помощью однофакторного ANOVA с последующим post-hoc тестом

Сорт	Доминика	Пионерка	Уральская золотистая	Эвридика
Доминика		0,000146	0,000146	0,000146
Пионерка	0,000146		0,000147	0,561310
Уральская золотистая	0,000146	0,000147		0,001325
Эвридика	0,000146	0,561310	0,001325

Примечание: полужирным шрифтом выделены сорта, для которых установлены статистически достоверные различия по размерам полярной оси пыльцевых зерен

 

Таблица 4 – Результаты сравнения сортов по размеру экваториального диаметра пыльцевых зерен с помощью непараметрического U-критерия Манна-Уитни

Сорт	Доминика	Пионерка	Уральская золотистая	Эвридика
Доминика		U=4,5 p = 0,00000024	U=85,5 p = 0,000537	U=13 p = 0,000007
Пионерка	U=4,5 p = 0,00000024		U=77,5 p = 0,000001	U=98 p = 0,002823
Уральская золотистая	U=85,5 0,000537	U=77,5 p = 0,000001		U=131,5 p = 0,004757
Эвридика	U=13 0,000007	U=98 p = 0,002823	U=131,5 p = 0,004757

Примечание: полужирным шрифтом выделены сорта, для которых установлены статистически достоверные различия по размерам полярной оси пыльцевых зерен

 

Впервые определено качество пыльцы указанных сортов. Исследованные образцы пыльцы имели не только морфологические, но и физиологические отличия, которые обнаружились при исследовании фертильности и жизнеспособности (таблица 5). Фертильной оказалась пыльца только трех сортов: Уральская золотистая, Пионерка, Эвридика. У сорта Доминика пыльцы много (рисунок 1f), но она вовсе не прокрашивается ацетокармином, морфологически сформированных пыльцевых зерен нет, пыльца очень мелкая, не наблюдалось прорастание пыльцы на питательных средах. У сорта Сапфир пыльники присутствуют, но пыльца практически не формируется, в единственном случае, где на микропрепаратах удалось обнаружить пыльцевые зерна, они кармином не окрасились (рисунок 1h). Важно, что морфологически сформированные крупные пыльцевые зерна наблюдались только у сорта Пионерка, который является гибридом от свободного опыления отборной формы сливы уссурийской (таблица 1). У отдаленных гибридов Уральская золотистая и Эвридика фертильность высока, однако в пыльце присутствуют стерильные пыльцевые зерна и при этом снижена жизнеспособность.

 

Таблица 5 – Фертильность и жизнеспособность пыльцы уральских сортов сливы

Сорт	Фертильность пыльцевых зерен, % (ацетокарминовый метод)	Жизнеспособность пыльцевых зерен, % (проращивание на питательной среде)
Уральская золотистая	98,4±0,7	59,71±17,02
Пионерка	93,89±1.0	56,41±14,62
Эвридика	90,34±1,9	65,15±34,00

 

Полученный нами результат соответствует более ранним наблюдениям. Так у диплоидных сортов сливы домашней, уссурийской, терна фертильность лежит в пределах класса 80…100% (Царенко, 1981, Рассветаева, 1985). У отдаленных гибридов косточковых может снижаться фертильность или вовсе возникает стерильность пыльцы в силу сильных нарушений в мейозе и несбалансированности гибридных геномных наборов, возможно образование нераспадающихся тетрад и полиад (Мочалова, Матюнин, 2002). Возможно, именно это объясняет мужскую стерильность сортов Доминика, Сапфир. У искусственно индуцированных тетраплоидов сливы китайской и алычи ранее наблюдали значительные различия между фертильностью и жизнеспособностью, когда при высокой фертильности наблюдалась низкое или посредственное прорастание пыльцы на питательных средах (Мочалова, Матюнин, 2002). Таким образом, в отношении сорта Эвридика, произошедшего от гибридизации отборных форм P. salicina и P. cerasifera var. pissardii, на основании сравнения наших данных с литературными можно предположить тетраплоидность. Климатические факторы также могут оказывать существенное влияние на выход фертильной жизнеспособной пыльцы (Мочалова, Матюнин, 2002, Царенко, 1981, Рассветаева, 1985). Учитывая аномально раннюю весну 2023 года, погодные условия также могли снизить жизнеспособность пыльцы у изученных сортов. Необходимо продолжить исследования жизнеспособности и фертильности в течение последующих вегетационных сезонов.

Заключение

Изучение размеров, фертильности и жизнеспособности пыльцы отдаленных гибридов слив представляет интерес с практической точки зрения. Полученные данные необходимы для ведения успешного селекционного процесса, позволяют выбрать лучшие сорта для успешного использования их в качестве опылителей в селекции. Выявленные особенности пыльцы также могут быть полезны при дальнейшем изучении плоидности гибридов и нарушений мужского гаметогенеза у искусственных гибридов, в том числе аллополиплоидов. На основе полученных нами данных можно с уверенностью рекомендовать пыльцу сортов сливы Пионерка, Эвридика, Уральская золотистая для использования в дальнейшей селекции. Сорта слив Уральская золотистая, Эвридика, Доминика, Сапфир перспективны в плане изучения хромосомного состава, вариабельности показателей микроспорогенеза, механизмов нарушения мейоза в пыльниках и цитомиксиса.

Благодарности

Исследование выполнено в соответствии с государственным заданием Минобрнауки РФ по теме «Создание конкурентоспособных, высокоурожайных сортов зерновых, зернобобовых, кормовых, плодово-ягодных культур и картофеля мирового уровня на основе перспективных генетических ресурсов, устойчивых к био- и абиотическим факторам» (№ 0532-2021-0008).

Конфликт интересов: Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

Tatyana N. Slepneva

Ural Federal Agrarian Research Centre, Ural Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: tatyana_slepneva@mail.ru

junior researcher head of the Sverdlovsk Breeding Station of Horticulture 

Russian Federation, 620142, Ekaterinburg, Belinskogo st., 112a

Olga A. Kiseleva

Ural Federal Agrarian Research Centre, Ural Branch of the Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: kiselevaolga@inbox.ru

PhD in Biology, senior researcher at the Sverdlovsk Breeding Station of Horticulture 

Russian Federation, 620142, Ekaterinburg, Belinskogo st., 112a

Evgeny S. Shagalov

Ural State Mining University

Email: shagalov@igg.uran.ru

PhD in Geology and Mineralogy, Associate Professor at the Department of Mineralogy, Petrography and Geochemistry 

Russian Federation, 620144, Ekaterinburg, Kujbysheva st.,30

Nikolay S. Chebykin

The Zavaritsky Institute of Geology and Geochemistry of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: tchebykinnikolai@yandex.ru

research associate in Centre of collective usage «Geoanalitik»

Russian Federation, 620110, Ekaterinburg, Akademika Vonsovskogo st., 15

References

Supplementary files