Study of microsatellite loci polymorphism as a stage on the way to certification of blackberries

Maria Dolzhikova; Должикова Мария Александровна; Anna V. Pikunova; Пикунова Анна Викторовна; Anna A. Pavlenko; Павленко Анна Андреевна; Lydia A. Gruner; Грюнер Лидия Андреевна; Boris B. Kornilov; Корнилов Борис Борисович

doi:10.52415/23126701_2023_0308

Изучение полиморфизма микросателлитных локусов как этап на пути к паспортизации ежевики

Авторы: Должикова М.А.¹, Пикунова А.В.¹, Павленко А.А.¹, Грюнер Л.А.¹, Корнилов Б.Б.¹
Учреждения:
1. ФГБНУ ВНИИ селекции плодовых культур
Выпуск: № 3 (2023)
Страницы: 65-73
Раздел: Генетика, селекция, сортоизучение
Статья получена: 13.01.2025
Статья опубликована: 15.09.2023
URL: https://journal-vniispk.ru/2312-6701/article/view/276711
DOI: https://doi.org/10.52415/23126701_2023_0308
EDN: https://elibrary.ru/kruvuu
ID: 276711

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Данная работа посвящена изучению полиморфизма 11 микросателлитных локусов на 15 сортах ежевики. Большинство сортов и форм ежевики имеют четыре базовых набора хромосом (2n = 4x = 28). В нашей работе большинство сортов тетраплоиды (Agawam, Reuben, гибридная форма Т × С, Brzezina, Loch Maree, Ouachita, Thornfree, Loch Tаy, Cacanska Besterna, Chester) и несколько – гексаплоиды (Karaka Black, Texas, Helen). Теоретически возможно наблюдать 4 разных фрагмента, амплифицируемых на ДНК одного тетраплоидного генотипа, что зависит от уровня гетерозиготности анализируемого локуса. В исследованиях разноплоидных гибридов яблони наблюдалось 3…4 фрагмента у тетраплоидных генотипов. В исследовании амплифицировалось от 1 до 3 фрагментов у некоторых тетраплоидных сортов для одного локуса (у гибридной формы Т × С в локусе ERubLR_SQ01_G16 амплифицировалось 3 аллеля, у сорта Erie амплифицировался 1 аллель в локусе ERubLR_SQ019_3_G09). Всего на ДНК 15 образцов в 11 микросателлитных локусах было амплифицировано 48 аллелей. В среднем один генотип тетраплоидного сорта по всем локусам амплифицирует приблизительно 18 аллелей. У некоторых гексаплоидных сортов амплифицировалось от 2 до 4 фрагментов (у сорта Техас в локусе ERubLR_SQ19_3_G09 амплифицировалось 2 аллеля, у сорта Karaka Black в локусе ERubLR_SQ01_G16 амплифицировалось 4 аллеля). Один гексаплоидный генотип в среднем амплифицирует 25 аллелей по всем локусам. В работе обсуждаются особенности и ограничения методики детекции ПЦР продуктов микросателлитных локусов путем разделения в полиакриламидных гелях. На данном этапе работы отработаны методики амплификации 11 микросателлитных локусов ежевики, обнаружен полиморфизм, выявлены наиболее полиморфные локусы (RubEndo_SQ004_N23, ERubLR_SQ01_G16, ERubLR_SQ01_M20), которые в дальнейшем могут быть использованы для генетической паспортизации сортов ежевики и работе с генетическими ресурсами.

Ключевые слова

ДНК-маркеры, полимеразная цепная реакция, идентификация

Полный текст

Введение

Ежевика – ценная ягодная культура, плоды которой служат источниками ценных для организма человека микро- и макроэлементов, ряда витаминов. Плоды ежевики созревают после большинства других ягодных культур, что способствует увеличению сроков производства продукции, богатой витаминами, в регионах выращивания. Плоды её содержат значительное количество важных биологически активных компонентов антиоксидантного комплекса, участвующих во многих процессах метаболизма человека (Грюнер, Корнилов, 2020).

На территории России выделяют три основных центра видового разнообразия ежевик: в Калининградской области, где западноевропейские таксоны находятся на восточной границе своих ареалов; в Крыму, где распространены крымские формы средиземноморского происхождения; российском Кавказе (в основном в Предкавказье) в виде совокупности средиземноморских и кавказских представителей. Виды подрода ежевик (Rubus) формируют полиплоидные ряды от 2x (2n = 14) до 12x (2n = 84) с основным числом хромосом х = 7, а также включают анеуплоиды разного уровня плоидности (Дунаева, 2022).

Классическая селекция ягодных культур представляет длительный и затратный процесс, например, длительность выведения нового сорта малины достигает 15 лет (Graham, Jennings, 2009). Использование маркерной селекции значительно ускоряет данный процесс. Однако, стоит важный вопрос идентификации имеющегося сортового материала.

Для идентификации сортов ежевики используются количественные и качественные признаки, которые определяются визуально. Однако данные признаки имеют зависимость их проявления от внешних факторов. В результате возникают сложности в идентификации. В связи с этим наиболее эффективной системой маркирования сортов является генетическая идентификация сорта, представляющая собой метод получения генетически детерминированных характеристик с помощью молекулярных маркеров (Каган, 2014).

Для выявления полиморфизма микросателлитных локусов наиболее часто используют SSR-маркеры (простые повторяющиеся последовательности). В первой работе по изучению SSR-полиморфизма у представителей рода Rubus микросателлитные участки выявляли методом блот-гибридизации по Саузерну, используя в качестве зонда две синтетические ДНК-пробы с тандемно повторяющимися последовательностями GACA и GATA (Bussemeyer et al., 1997)

J. Graham с соавторами (Graham et al., 2002) были выявлены SSR-районы путем секвенирования клонов из библиотек, обогащенных последовательностями (AC)n и (AG)n. Разработанные праймеры были апробированы на выборке из 50 генотипов (сорта малины, сорта ежевики, образцы дикорастущих видов R. grabowski, R. deliciosus и межвидовые гибриды). В дальнейшем многочисленные группы исследователей создавали наборы SSR-маркеров для разных видов малин и ежевик: R. coreanus (Lee et al., 2015), R. glaucus (López et al., 2019), а также сортов ежевики (Lewers et al., 2008).

Созданные наборы SSR-маркеров широко используются для изучения генетического разнообразия и генотипирования сортов ежевики и малины (Castillo et al., 2010a). Так, группой отечественных учёных было протестировано 9 сортов малины и ежевики по 11 микросателлитным локусам (Лебедев и др., 2018). Был разработан метод генотипирования сортов малины, ежевики и малино-ежевичных гибридов отечественной и зарубежной селекции на основе микросателлитного анализа набора из 13 маркеров (Субботина и др., 2019). Коллегами из Беларуси были проанализированы 5 сортов ежевики различного генетического происхождения в целях дальнейшей паспортизации методом маркирования с использованием 8 SSR-маркеров (Гашенко и др., 2020). Все проводимые работы дают основание полагать актуальность изучения данной культуры при помощи SSR- маркеров в целях дальнейшей идентификации.

Материалы и методы

Выделение ДНК производилось по методике Doyle and Doyle (1990) с небольшими модификациями из свежесобранного растительного материала (молодых листьев).

Объекты исследований – 15 сортов ежевики биоресурсной коллекции ВНИИСПК: Agawam, Natchez, Karaka Black, Reuben, Texas, гибридная форма Т × С, Brzezina, Loch Maree, Erie, Ouachita, Helen, Thornfree, LochTay, Cacanska Bestrna, Chester (таблица 1).

Таблица 1 – Объекты исследований

Сорт	Плоидность	Происхождение
Агавам (Agawam)	2n=4x=28	R. allegheniensis Pozter
Натчез (Natchez)	2n=28	скрещивание селекционных линий
Карака Блек (Karaka Black)	2n=6x=42	скрещивание селекционных линий
Рубен (Reuben)	2n=4x=28	скрещивание селекционных линий
Техас (Texas)	2n=6x=42	R. loganovaccus
Гибридная форма Т × С	2n=4x=28	Thornfree × Rubus cauzasicus
Бжезина (Brzezina)	2n=4x=28	Black Satin × Darrow
Лох Mери (Loch Maree)	2n=4x=28	Loch Ness × селекционные формы
Эри (Erie)	неизвестно	неизвестно
Вошита (Ouachita)	2n=4x=28	Navaho × Ark.1506
Хелен (Helen)	2n=6x=42	селекционные сеянцы × Silvan
Торнфри (Thornfree)	2n=4x=28	(Brainerd × Merton Thornless) × (Merton Thornless x Eldorado)
Лох Тей (LochTаy)	2n=4x=28	Loch Ness ×SCRJ82417D
Чачанска Бестрна (Cacanska Bestrna)	2n=4x=28	Dirksen Thornless × Black Satin
Честер (Chester)	2n=4x=28	Darrow × Thornfree

Для проведения ПЦР выделенную ДНК разбавляли. ПЦР проводили с использованием реактивов и BioTaq полимеразы фирмы Dialat Ltd. Проанализированные микросателлитные локусы перечислены в таблице 2. Они представляют 5 групп сцепления ежевики из 7.

Таблица 2 – Характеристика микросателлитных локусов, задействованных в анализе

Локус	ГС*	RM	t °С	Ведущий праймер c хвостом 5′→3′	Обратный праймер 5′→3′
ERubLR_SQ19_1_A05	5	GAA	50	aacaggtatgaccatga GTTTGCTTCCTTTCGTAGTC	gttt TATACTAATGGCCACCTTGG
ERubLR_SQ01_B06	4	AGCG	53	aacaggtatgaccatga CCTCTACACCACCCCATCAG	gttt CGTCATCGTCATCTCTCTCG
RubPara_SQ008_D04	1	AT	53	aacaggtatgaccatga TTGAGAACCATGCCTACATATCTT	gttt GCTGGAAATGGATTGAATGG
ERubLR_SQ07_4_D05	3	AGC	50	aacaggtatgaccatga CTTCTTTCCAACCGATTTC	gttt ACGAATTGATTTCATCAACC
ERubLR_SQ06_2_E01	5	AT	53	aacaggtatgaccatga GCAGGAGTTGGACGAGTAG	gttt TTTCCAGATCAAACAAGACC
ERubLR_SQ01_M20	5	ATA	50	aacaggtatgaccatga TTACGAACACCCATTAATTTAAGTC	gttt AATCCTGAGACCGACGAGTG
RubEndo_SQ004_N23	4	TA	53	acaggtatgaccatga CACTGCAAGGTGTCGTTTGT	gttt ATAGCTCCGGCAATCCATC
ERubLR_SQ19_3_G09	4	GCTC	53	acaggtatgaccatga GTTCGTCATCGTCATCTCTC	gttt AGAAAACCAAACCCCTCTAC
ERubLR_SQ01_G16	7	TC	50	acaggtatgaccatga GCACCCTAATCTCCATGACC	gttt CCGCTGTAGTTCCTGTAGGC
ERubLR_SQ07_2_H02	4	CTAG	50	aacaggtatgaccatga TGGCAATCAACCACTCTGTG	gttt CAAACTGACAAACGCTCTTCC
ERubLR_SQ01_I20	5	TA	50	aacaggtatgaccatga TCTTTTGCGGTGGCTACAAG	gttt CAACCCGAAGTCTACAACAGC

Примечания: ГС – группа сцепления; RM – repeat motif; t°С – температура отжига

Условия ПЦР следующие: денатурация 5 мин при 95°C, затем 30 циклов – 30 с при 95°C, температура отжига специфична для конкретной пары праймеров, экспериментально подобранная – 30 с, 72°C – 30 с; финальная элонгация 72°C – 10 мин. Анализ полиморфизма ранее опубликованных микросателлитных локусов (Woodhead et al., 2008) проводили методом разделения в 8 % полиакриламидном геле (ПААГ) с последующим окрашиванием нитратом серебра. Размеры фрагментов определяли с помощью маркера молекулярного веса 10 bp DNA Ladder.

Результаты и их обсуждение

Всего на ДНК 15 образцов в 11 микросателлитных локусах было амплифицировано 48 аллелей (таблица 3). В каждом отдельном локусе наблюдалась амплификация от 2 (ERubLR_SQ07_4_D05, ERubLR_SQ06_2_E01) до 8 фрагментов (ERubLR_SQ01_M20) при анализе всех 15 генотипов ежевики. Как наиболее полиморфные локусы можно выделить: RubEndo_SQ004_N23, ERubLR_SQ01_G16, ERubLR_SQ01_M20.

Таблица 3 – Характеристика полиморфизма 11-ти микросателлитных локусов у анализируемой выборки 15-ти сортообразцов с детекцией на ПААГ

№	Локус	Наблюдаемое количество фрагментов	Приблизительные размеры аллелей (п.н.)
1 GAA	ERubLR_SQ19_1_A05	4	220, 225, 230, 240
2 AGCG	ERubLR_SQ01_B06	4	214, 222, 226, 230
3 AT	RubPara_SQ008_D04	5	262, 264, 266, 268, 270
4 AGC	ERubLR_SQ07_4_D05	2	267, 270
5 AT	ERubLR_SQ06_2_E01	2	163,166
6 ATA	ERubLR_SQ01_M20	8	253, 256, 259, 271, 280, 283, 286, 292
7 TA	RubEndo_SQ004_N23	6	220, 224, 236, 240, 250, 270
8 GCTC	ERubLR_SQ19_3_G09	3	228, 232, 236
9 TC	ERubLR_SQ01_G16	7	220, 225, 230, 235, 240, 245, 260
10 CTAG	ERubLR_SQ07_2_H02	3	252, 260, 264
11 TA	ERubLR_SQ01_I20	4	225, 230, 245, 260

Большинство сортов и форм ежевики имеют четыре базовых набора хромосом (2n=4x=28). В нашей работе большинство сортов тетраплоиды (Agawam, Reuben, гибридная форма Т×С, Brzezina, Loch Maree, Ouachita, Thornfree, LochTаy, Cacanska Besterna, Chester) и несколько - гексаплоиды (Karaka Black, Texas, Helen). Теоретически возможно наблюдать 4 разных фрагмента, амплифицируемых на ДНК одного тетраплоидного генотипа, что зависит от уровня гетерозиготности анализируемого локуса. В исследованиях разноплоидных гибридов яблони (Пикунова и др., 2018) наблюдалось 3…4 фрагмента у тетраплоидных генотипов.

У сортов Agawam, Renben, Bzzezina, Ouachita, Chester, Natchez во всех изучаемых локусах амплифицировалось от одной до двух аллелей. Например, у сорта Natchez наблюдается от одной до двух аллелей по всем проанализированным локусам (например, в локусе ERubLR_SQ19_3_G09 аллель в приблизительном размере 232 п.н., в локусе ERubLR_SQ01_B06 две аллели с приблизительными размерами 214 и 226 п.н. соответственно).

У ряда изучаемых сортов амплифицировалось от 1 до 3 аллелей по всем изучаемым локусам (у сортов Texas, гибридная форма ТхС, Loch Meree, Helen, Thornfree, LochTey, Erie). Например, у гибридной формы Т×С в локусе ERubLR_SQ01_G16 амплифицировалось 3 аллеля, у сорта Erie амплифицировался 1 аллель в локусе ERubLR_SQ019_3_G09. У сорта Cacanska Bestrna в локусе ERubLR_SQ01_М20 амплифицировалось 2 аллеля

В среднем один генотип тетраплоидного сорта по всем 11 локусам амплифицирует 18 аллелей. У гексаплоидных сортов амплифицировалось от 2 до 4 фрагментов (у сорта Karaka Black в локусе ERubLR_SQ01_G16 амплифицировалось 4 аллеля). Один гексаплоидный генотип в среднем амплифицирует 25 аллелей по всем локусам.

В работе M. Woodhead с соавт. (2008) было проанализировано 9 родов Rubus (R. fructicosus, R. geoides, R. grabowski, R. idaeus, R. lacustre, R. macraei, R. mesogaeus, R. coreanus, R. strigosus) и одна гибридная форма Eubatus × Ideobatus hybrid более чем по 20-ти микросателлитным локусам, в том числе по 11 локусам, которые изучались в нашей работе. В работе M. Woodhead с соавт. в локусах ERubLR_SQ19_1_A05, ERubLR_SQ01_B06, ERubLR_SQ07_4_D05, ERubLR_SQ06_2_E01, RubEndo_SQ004_N23, ERubLR_SQ19_3_G09, ERubLR_SQ07_2_H02 наблюдается наибольшее количество аллелей маркеров в сравнении с полученными нами данными. Причиной этому может служить наиболее разнообразная выборка. Однако в некоторых локусах, таких как RubPara_SQ008_D04, ERubLR_SQ01_M20 и ERubLR_SQ01_I20 в выборке, используемой в наших исследованиях, было обнаружено большее количество аллелей данных маркеров, то есть выборка оказалась более полиморфной.

Полиморфизм в микросателлитных локусах обусловлен, как правило, различным числом повторений определенного набора нуклеотидов – мотива. Мотив может состоять из разного числа нуклеотидов – от двух пар нуклеотидов (динуклеотидные повторы) и выше (три-, тетра- пентануклеотидные повторы). Соответственно, размеры аллелей могут отличаться минимум на 2 п.н. (если локус представляет собой динуклеотидные повторы), 3 п.н. (тринуклеотидный повтор), 4 п.н. (тетрануклеотидный повтор) и т.д. Некоторые авторы отмечают, что использование динуклеотидных повторов сопряжено с рядом недостатков, и отмечают что наиболее удобны для практического использования микросателлиты ограничивающие повторяющиеся мотивы свыше динуклеотидных (Кветко и др., 2019)

Наиболее современным методом детекции полиморфизма микросателлитных локусов является разделение путём капиллярного электрофореза, поскольку позволяет различить фрагменты с разницей в одну пару нуклеотидов. Его минусом является необходимость наличия дорогостоящего оборудования, например, ABI prizm Genetic Analyser. Детекция в 8% полиакриламидном геле (ПААГ) так же может подходить для ряда задач при работе с микросателлитными локусами. В вопросах генетической паспортизации данную методику можно рассматривать как промежуточный диагностический этап, поскольку разрешающая способность ПААГ ограничена и чем ближе фрагменты по размеру, тем их сложнее разделить в геле. Визуальное разделение фрагментов зависит и от размеров фрагментов, так в диапазоне 150…200 п.н. фрагменты с разницей в 2 п.н. разделяются лучше, чем в диапазоне 200…250 п.н.

Разделение в ПААГ локусов с динуклеотидным повтором требует особенно длительной пробежки и идеальной окраски (рисунок 1). Однако, как прослеживается на представленной электрофореграмме, учет некоторых фрагментов затруднителен. Несмотря на это можно проследить что в локусе RubPara_SQ008_D04 на всех изучаемых генотипах амплифицируется 5 фрагментов с приблизительными размерами 262, 264, 266, 268, 270 п.н.

Рисунок 1 – Локус RubPara_SQ008_D04 по изучаемым сортам на 8 % полиакриламидном геле (ПААГ)

Легче учитывать данные при разделении ПЦР продуктов В ПААГ для локусов, представляющих три- и тетрануклеотидные повторы.

Выводы

На данном этапе методики амплификации по 11 микросателлитным локусам отработаны. Все локусы полиморфны. В дальнейшем данные локусы могут быть использованы для генетической паспортизации сортов ежевики и в работе с генетическими ресурсами.

Выявлены наиболее полиморфные локусы, амплифицирующие на данной выборке 6…8 аллелей (ERubLR_SQ01_M20, RubEndo_SQ004_N23, ERubLR_SQ01_G16). Анализ динуклеотидных локусов (RubPara_SQ008_D04, ERubLR_SQ06_2_E01, RubEndo_SQ004_N23, ERubLR_SQ01_G16, ERubLR_SQ01_I20) с учетом размеров повторяющихся мотивов рекомендуется проводить путём фрагментного электрофореза.

Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах