Ризогенез двух сортов калины обыкновенной в культуре in vitro

Полный текст

Введение

Калина – популярное декоративное и лекарственное растение. Наиболее широко используется человеком калина обыкновенная, красная – Viburnum оpulus L. В Государственный реестр селекционных достижений включено 16 сортов этого вида. Этот вид широко используется в садово-парковом строительстве, практически все части растения служат источником лекарственного сырья, из плодов варят кисели, компоты, варенье, отжимают сок (Абрамчук, Карпухин, 2019; Милюкова и др., 2021; Павленко, Козонова, 2021). Являясь источником различных биологически активных соединений, плоды и листья калины обыкновенной представляют собой ценный продукт для производства продуктов функционального питания (Винницкая, Попова, 2013). Интересно, что антиоксидантная активность листьев калины обыкновенной даже выше чем у плодов калины и находится на уровне 739,3 мг/100г (Красный коралл) – 904,0 мг/100 г (Зарница), что дает возможность использовать их для получения ингредиентов, обогащающих продукты питания (Попова, 2017).

Несмотря на то, что посадочный материал калины постоянно востребован, биотехнологические методы размножения этой культуры практически не разрабатывались. Разработка эффективной технологии размножения перспективных сортов калины in vitro позволит получать требуемое количество высококачественного посадочного материала к нужному сроку.

Этап ризогенеза микрочеренков – важнейший этап клонального микроразмножения (Деменко и др., 2010), поскольку формирование качественной корневой системы и развитых побегов in vitro во многом определяет успех прохождения микрорастениями этапа адаптации и последующего быстрого развития (Трунов, Хорошкова, 2020). Процесс образования корней – это сложная цепочка биохимических, физиологических и гистологических реакций, которые, в первую очередь, зависят от генома растений и условий укоренения черенков. Большое внимание уделяется грамотному применению стимуляторов корнеобразования. По литературным данным и результатам наших исследований для укоренения древесных и кустарниковых культур в большинстве случаев применение индукторов ризогенеза является обязательным. Наиболее часто для этих целей используют β-индолил-3-уксусную кислоту (ИУК), индолил-3-масляную кислоту (ИМК) и α-нафтилуксусную кислоту (НУК), которые добавляют в среды ризогенеза в концентрации 0,5…1,0 мг/л (Криницына, Чурикова, 2018; Остапчук, Кухарчик, 2018; Субботина и др., 2018; Крахмалева, Молканова, 2020; Хорошкова и др., 2020; Alosaimi, Tripepi, 2016; Hunková, Gajdošová, 2019; Raeva-Bogoslovskaya et al., 2019; Muratova et al., 2021). Оптимальный состав среды ризогенеза для каждого генотипа подбирается опытным путем индивидуально.

Целью наших исследований было изучение особенностей ризогенеза двух сортов калины обыкновенной на безгормональной среде и средах с ауксинами.

Материалы и методы

Исследования проведены в учебно-исследовательской лаборатории биотехнологии Мичуринского государственного аграрного университета. В качестве растительного материала выбраны перспективные для производственного размножения сорта калины обыкновенной Гранатовый браслет и Красный коралл. Сорта калины были введены в стерильную культуру и размножены в условиях in vitro. Микрочеренки, достигшие длины 1,5…2,5 см, высаживали на среды укоренения. На этапе ризогенеза использовали минеральную основу питательной среды Мурасиге-Скуга (Murashige, Skoog, 1962) со сниженной вдвое концентрацией макросолей, дополненную мезоинозитолом – 50 мг/л, пиридоксином HCl – 0,5 мг/л, никотиновой кислотой – 0,5 мг/л, тиамином HCl – 0,4 мг/л, глицином – 2 мг/л, агаром – 8 г/л и сахарозой – 20 г/л, рН среды – 5,7…5,8. В среду добавляли ауксины: β-индолил-3-масляную кислоту (ИМК) или β-индолилуксусную кислоту (ИУК) в концентрации 0,25…1,0 мг/л. Контролем служила среда без регуляторов роста. Стерилизация сред проводилась автоклавированием при температуре 120 ºС, давлении 1,2 атм. в течение 20 мин. Витамины и регуляторы роста растений стерилизовали ультрафильтрацией через фильтры Millipore («Millipore» 0,22 μm, France) и добавляли в среду после автоклавирования.

Субкультивирование побегов осуществляли в широкогорлых конических колбах емкостью 250 мл с 80 мл среды. Колбы закрывали тонкой алюминиевой фольгой и герметизировали стрейч пленкой.

Культивирование растений осуществляли в культуральной комнате при 16-часовом световом дне с освещенностью 2400…2700 люкс (люминесцентные лампы Osram L36W/765 Cool Daylight), температуре воздуха 24 ± 2 ºС и влажности воздуха 50…60 %. Микрочеренки находились на среде ризогенеза 6 недель.

Учет результатов производили с периодичностью 1 раз в 7 дней. На этапе укоренения микрочеренков учитывали число укоренившихся побегов, число и длину корней на каждый укорененный микрочеренок, измеряли длину побегов. На каждый вариант опыта брали по 25…30 эксплантов. Повторность опытов трехкратная. Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Microsoft Excel.

Результаты и их обсуждение

Результаты опытов по укоренению микрочеренков калины обыкновенной в условиях in vitro показали, что эффективность ризогенеза зависит как от типа используемого ауксина и его концентрации в питательной среде, так и от индивидуального потенциала генотипа к образованию корней, определяемого в первую очередь эндогенным балансом фитогормонов. В нашем случае сорт калины Гранатовый браслет на контрольной среде без ауксина совсем не образовывал корней (рисунок 1), на средах с ауксинами через 13…16 дней началось образование корней. При этом на среде с 0,25 мг/л ИМК итоговая частота укоренения за шесть недель культивирования составила всего 11,9 %. Максимальное число укоренившихся побегов (до 65,0 %) получили при концентрации ИМК в среде укоренения 0,5…1,0 мг/л
(рисунок 1). В этом случае сформировалось и наибольшее число корней на укорененный микрочеренок, появились корешки второго порядка. С ростом концентрации ИМК в питательной среде росло и число корней на укорененный микрочеренок (рисунок 2).

 

Рисунок 1 – Влияние типа и концентрации ауксина на эффективность укоренения калины обыкновенной сорта Гранатовый браслет

 

Рисунок 2 – Влияние типа и концентрации ауксина на образование корней у микрорастений калины обыкновенной сорта Гранатовый браслет

 

Наибольшее среднее число корней на укорененный микрочеренок калины сорта Гранатовый браслет получено при концентрации ИМК в среде ризогенеза 1,0 мг/л (рисунок 2). В этом случае отметили и максимальную интенсивность корнеобразования – 7 корней на одно микрорастение. Микропобеги с корнями интенсивно развивались на средах ризогенеза, формируя крепкие растения с крупными темно-зелеными листьями.

На средах с ИУК частота ризогенеза была ниже, максимальное значение 51,2 % достигнуто при концентрации ИУК в среде укоренения 0,5 мг/л. При этом если число корней на укорененный микрочеренок возрастало с ростом концентрации ИМК в среде, то на всех средах с ИУК оно было практически одинаковым и достаточно высоким (рисунок 2).

Интенсивность роста корней и побегов была схожей при использовании как одного, так и другого ауксина (рисунки 3, 4), за исключением варианта с самой низкой концентрацией ИМК, в этом случае длина корней была максимальной. Тот факт, что высокие концентрации ИМК в питательной среде замедляют рост корней, был показан ранее и на других культурах (Субботина и др., 2018; Крахмалева, Молканова, 2020; Хорошкова и др., 2020), кроме того, как правило, возрастание числа корней на укорененный черенок коррелирует с уменьшением их средней длины.

 

Рисунок 3 – Влияние типа и концентрации ауксина на рост корней у микрорастений калины обыкновенной сорта Гранатовый браслет

 

Рисунок 4 – Влияние типа и концентрации ауксина на рост побегов калины обыкновенной сорта Гранатовый браслет

Не отмечено принципиальных различий в развитии растений на средах с разными ауксинами. Микрорастения с корнями как на средах с ИМК, так и на средах с ИУК интенсивно развивались, формируя побеги до 5…6 см длиной, с крупными листьями длиной до 2,0…2,5 см (рисунки 5, 6).

 

Рисунок 5 - Влияние концентрации ИМК на ризогенез и развитие побегов калины сорта Гранатовый браслет на среде MS_УК

 

Рисунок 6 – Влияние концентрации ИУК на ризогенез и развитие побегов калины сорта Гранатовый браслет на среде MSУК

 

Побеги не образовавшие корней на всех средах останавливались в развитии, листья у них начинали постепенно желтеть. Следовательно, перед высадкой на адаптацию требовалось добиться максимальной частоты ризогенеза микрочеренков, так как именно в этом случае качество полученных микрорастений могло обеспечить максимальный выход прижившихся растений на этапе адаптации.

Как следует из полученных нами данных, сорт калины Красный коралл характеризуется более высокой способностью к ризогенезу в условиях in vitro. Частота укоренения этого сорта на контрольной среде без гормонов составила 35,0 % (рисунок 7).

 

Рисунок 7 – Влияние типа и концентрации ауксина на эффективность укоренения калины обыкновенной сорта Красный коралл

 

Для этого сорта наиболее эффективной была определена концентрация ИМК в среде ризогенеза 0,25 мг/л, которая обеспечила 100 % укоренение микрочеренков. При этом как и в случае с сортом Гранатовый браслет число корней увеличивалось с ростом концентрации ИМК (рисунок 8) и соответственно снижалась их средняя длина (рисунок 9). На средах с ИУК частота ризогенеза была ниже и не превышала 60 %, при использовании этого ауксина повышение его концентрации в питательной среде не вело к увеличению числа образовавшихся корешков (рисунок 8). Образование каллуса на срезах микрочеренков во всех вариантах опыта было приемлемым, максимальное его количество вполне ожидаемо получено при самых высоких концентрациях ауксина. Укоренившиеся побеги росли практически с одинаковой интенсивностью во всех вариантах опыта (рисунок 9). По высоте побеги сорта Красный коралл на питательных средах с различной концентрацией ауксина статистически не отличались.

 

Рисунок 8 – Влияние типа и концентрации ауксина на образование корней у микрорастений калины обыкновенной сорта Красный коралл

 

Рисунок 9 – Влияние типа и концентрации ауксина на рост корней у микрорастений калины обыкновенной сорта Красный коралл

 

Рисунок 10 – Влияние типа и концентрации ауксина на рост побегов калины обыкновенной сорта Красный коралл

 

Ранее, при укоренении ягодных культур рода Rubus было показано, что морфология образовавшихся корней могла сильно отличаться в зависимости от типа применяемого ауксина (Субботина и др., 2018; Хорошкова и др., 2020). В отличие от ежевики у калины морфологические характеристики корней и общая структура корневой системы на средах с ИМК и ИУК была очень схожей (рисунки 5, 6, 11, 12), что говорит о том, что качество образовавшихся корней в большей степени зависело от биологических особенностей культуры и в меньшей от типа используемого ауксина.

 

Рисунок 11 – Влияние концентрации ИМК на ризогенез и развитие побегов калины сорта Красный коралл на среде MSУК

 

Рисунок 12 – Влияние концентрации ИУК на ризогенез и развитие побегов калины сорта Красный коралл на среде MSУК

 

Возможность применения ИУК в составе питательных сред для укоренения микрочеренков была ранее показана и на других кустарниковых породах (Криницына, Чурикова, 2018).

Наиболее качественные микрорастения получены на среде с 0,5 мг/л ИМК (рисунок 13). Эти растения хорошо перенесли переход в условия ex vitro.

 

Рисунок 13 – Укорененные на среде MSУК с 0,5 мг/л ИМК растения калины сорта Гранатовый браслет

 

Заключение

Калина обыкновенная достаточно хорошо укореняется в условиях in vitro. При этом сорт калины Красный Коралл характеризуется более высокой способностью к укоренению микрочеренков по сравнению с сортом Гранатовый браслет. Для ризогенеза in vitro включенных в исследования сортов калины обыкновенной рекомендуется использовать разбавленную питательную среду Мурасиге-Скуга со сниженной вдвое концентрацией макросолей, дополненную мезоинозитолом – 50 мг/л, пиридоксином HCl – 0,5 мг/л, никотиновой кислотой – 0,5 мг/л, тиамином HCl – 0,4 мг/л, глицином – 2 мг/л, агаром – 8 г/л и сахарозой – 20 г/л  с добавлением  β-индолил-3-масляной кислоты (ИМК). Для укоренения сорта Гранатовый браслет рекомендуется добавлять в среду ризогенеза 0,5…1,0 мг/л ИМК, для эффективного укоренения сорта Красный Коралл снизить концентрацию ауксина в среде до 0,25 мг/л. На средах с ИМК частота ризогенеза сорта калины Гранатовый браслет доходит до 65,0 %, сорта Красный коралл до 100 %. На средах с ИУК эффективность ризогенеза микрочеренков калины не превышает 60,0 %. На безгормональной среде сорт Гранатовый браслет не укореняется совсем, частота укоренения сорта Красный коралл существенно ниже.

Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

Светлана Александровна Муратова

ФГБОУ ВО Мичуринский ГАУ

Автор, ответственный за переписку.
Email: smuratova@yandex.ru

кандидат биологических наук, заведующий учебно-исследовательской лаборатории биотехнологии

Россия, 393760, Тамбовская обл., г. Мичуринск, ул. Интернациональная 101

Наталия Сергеевна Субботина

ФГБОУ ВО Мичуринский ГАУ

Email: subbotinanatali1982@yandex.ru

младший научный сотрудник учебно-исследовательской лаборатории биотехнологии

Россия, 393760, Тамбовская обл., г. Мичуринск, ул. Интернациональная 101

Список литературы

Дополнительные файлы