Identification of Pseudomonas fuscovaginae, Pseudomonas syringae and Xanthomonas translucens in wheat seeds using PCR

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

The causative agents of grain crops bacteriosis viz. Pseudomonas fuscovaginae , Pseudomonas syringae and Xanthomonas translucens are regulated by phytosanitary requirements of the largest importers of Russian grain - Egypt, Turkey, Bangladesh, Nigeria and Pakistan. Therefore, it requires the development of rapid methods for their diagnosis. The PCR method, which is the fastest and most reliable in testing laboratories, needs optimal preparation of the test material. The aim of the study was to optimize the process of preparing seed samples for subsequent detection and identification of P. fuscovaginae, P. syringae and X. translucens by PCR. Wheat grain samples were soaked in phosphate-buffered saline (PBS) for 2 hours and infected with suspensions of P. fuscovaginae, P. syringae pv. coronafaciens and X. translucens at various concentrations. Then, the infected grain samples were crushed and subjected to two-stage centrifugation. DNA was isolated from the obtained analytical samples and species-specific PCR was performed for each bacterial species. It was found that a two-hour soaking of the seeds and their treatment with a homogenizer is sufficient to effectively destroy each grain in the sample and ensure the release of bacteria into the liquid part of the sample. The first low-speed centrifugation allowed the crushed grain to settle efficiently and remove excess starch from the supernatant. High-speed centrifugation of the supernatant made it possible to obtain a concentrated microbiota contained in the grain sample. To obtain DNA of sufficient quality for PCR test, the kit ‘Proba-GS’ (AgroDiagnostika, Russia) was used for DNA extraction. Using ‘Pseudomonas fuscovaginae-RT’ kit (Syntol, Russia) and PsyF/PsyR and 4F1/4R 1 primers, DNA of P. fuscovaginae P. syringae and X. translucens , respectively, was successfully detected in each of the samples infected with these bacteria at concentrations of 103 CFU/ml. The absence of PCR inhibition was noted. The method of removing starch from samples for molecular diagnostics of phytopathogens was used for the first time. Application of these methods will allow diagnosing pathogens of bacterioses within one day.

About the authors

Mufaro Muvingi

Peoples’ Friendship University of Russia

Author for correspondence.
Email: mufaromuvingi@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-7700-1296

PhD student, Agrobiotechnology Department, Agrarian and Technological Institute

8 Miklukho-Maklaya st., Moscow, 117198, Russian Federation

Olga Y. Slovareva

All-Russian Plant Quarantine Center

Email: slovareva.olga@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-6022-5955

Candidate of Science (Biology), Junior Researcher, Department of Organization of Interlaboratory Comparison Tests

32 Pogranichnaya st., Bykovo vill., Ramenskoye, Moscow Region, 140150, Russian Federation

Meisam Zargar

Peoples’ Friendship University of Russia

Email: zargar-m@rudn.ru
ORCID iD: 0000-0002-5208-0861

Candidate of Science (Biology), Junior Researcher, Department of Organization of Interlaboratory Comparison Tests

8 Miklukho-Maklaya st., Moscow, 117198, Russian Federation

References

  1. Agapkin AM, Makhotina IA. The grain market of Russia. IOP Conf. Ser.: Earth Environ. Sci. 2021; 839(2):022023. doi: 10.1088/1755-1315/839/2/022023
  2. Xie G, Cui Z, Tao Z, Qiu H, Liu H, Ibrahim M, Zhu B, Jin G, Sun G, Almoneafy A, Li B. Genome sequence of the rice pathogen Pseudomonas fuscovaginae CB 98818. J Bacteriol. 2012;194(19):5479-80. doi: 10.1128/JB.01273-12
  3. Khojasteh M, Taghavi SM, Khodaygan P, Hamzehzarghani H, Chen G, Bragard C, Koebnik R, Osdaghi E. Molecular typing reveals high genetic diversity of Xanthomonas translucens strains infecting small-grain cereals in Iran. Appl Environ Microbiol. 2019;85(20): e01518-19. doi: 10.1128/AEM.01518-19
  4. Tambong JT. Bacterial Pathogens of Wheat: Symptoms, Distribution, Identification, and Taxonomy. In: Ansari M. (ed.) Wheat - Recent Advances. IntechOpen; 2022. doi: 10.5772/intechopen.102855
  5. González D, Corzo-Lopez M, Márquez OP, Cruz A, Martínez B, Martínez, Y. Characterization and diagnosis of Pseudomonas fuscovaginae Miyajima, Tanii and Akita, causal agent of the Brown Sheath Rot in rice. Biotecnología Aplicada. 2017;34(2):2101-2108.
  6. An JH, Noh YH, Kim YE, Lee HI, Cha JS. Development of PCR and TaqMan PCR assays to detect Pseudomonas coronafaciens, a causal agent of halo blight of oats. Plant Pathology. 2015;31(1):25-32. doi: 10.5423/PPJ.OA.09.2014.0096
  7. Iqbal MA, Ullah I, Shahbaz MU, Kamran M, Saleem K. Biochemical and molecular identification of Xanthomonas translucens pv. undulosa causing bacterial leaf streak of wheat in Punjab, Pakistan. Archives of Phytopathology and Plant Protection. 2014;47(4):417-424. doi: 10.1080/03235408.2013.811030
  8. Adorada DL, Stodart BJ, Pangga IB, Ash GJ. Implications of bacterial contaminated seed lots and endophytic colonization by Pseudomonas fuscovaginae on rice establishment. Plant Pathology. 2015;64(1):43-50. doi: 10.1111/ppa.12243
  9. Verma A, Agrawal K. Location and histopathology of seed-borne bacterial pathogen Pseudomonas syringae pv. pisi carried by pea seeds. Journal of Applied Biology and Biotechnology. 2018;6(1):20-22. doi: 10.7324/JABB.2018.60104
  10. Valencia-Botín AJ, Cisneros-Opez ME. A Review of the studies and interactions of Pseudomonas syringae pathovars on wheat. International Journal of Agronomy. 2012;2012:692350. doi: 10.1155/2012/692350
  11. Moon YJ, Lee SY, Oh SW. A Review of isothermal amplification methods and food-origin inhibitors against detecting food-borne pathogens. Foods. 2022;11(3):322. doi: 10.3390/foods11030322
  12. Mizuno S, Sakurai T, Nabasama M, Kawakami K, Hiroe A, Taguchi S, Tsuge T. The influence of medium composition on the microbial secretory production of hydroxyalkanoate oligomers. General Applied Microbiology. 2021;67(4):134-141. doi: 10.2323/jgam.2020.09.002
  13. Slovareva OY. Detection and identification of wheat and barley pathogens in the Russian Federation. Microbiology Independent Research Journal. 2020;7(1):13-23. doi: 10.18527/2500-2236-2020-7-1-13-23
  14. Guilbaud C, Morris CE, Barakat M, Ortet P, Berge O. Isolation and identification of Pseudomonas syringae facilitated by a PCR targeting the whole P. syringae group. FEMS Microbiology Ecology. 2016;92(1): fiv146. doi: 10.1093/femsec/fiv146
  15. Slovareva OY, Starikova EV, Muvingi M. Development of new PCR tests for diagnostics of the agent of bacterial leaf streak of wheat Xanthomonas translucens. Plant Health and Quarantine. 2021;2(6):37-49. (In Russ.).

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML


Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».