The effect of cytochalasin B during cytoplast preparation on the efficiency of somatic cloning in sheep (Ovis aries)

Full Text

Введение

Соматическое клонирование (somatic cell nuclear transfer, SCNT) — это мощный биотехнологический инструмент, направленный на сохранение высокоценных генотипов и ускорение генетического прогресса в животноводстве, получение животных с редактированным геномом и поддержание видового разнообразия [1–4]. Не менее важное значение имеет клонирование животных в биомедицинских целях, которое обусловливает перспективы разработки более точных методов моделирования и терапии заболеваний человека, улучшения и ускорения тестирования лекарственных препаратов, а также проведения ксенотрансплантации [5–7]. Овца является удобным объектом для биомедицинских исследований. SCNT в комбинации с методами генной инженерии открывает новые возможности для геномного редактирования овец, а также для производства необходимых человеку биологически активных веществ, в частности фармацевтических рекомбинантных белков, секретируемых в молоке, и моноклональных антител [8–10].

К сожалению, в настоящее время практические преимущества получения клонированных животных, в том числе овец, в большей степени нивелируются высокой себестоимостью и низкой эффективностью процедуры SCNT, которая требует усовершенствования и повышения воспроизводимости результатов [11–13]. В качестве потенциальных возможностей для улучшения результативности SCNT рассматривают стандартизацию оценки качества ооцитов перед постановкой на созревание, оптимизацию параметров слияния энуклеированного ооцита и перенесённой в него соматической клетки (СК), а также условий репрограммирования донорского ядра в цитоплазме ооцита-реципиента и культивирования полученных цитогибридов [14–17].

Основополагающий принцип технологии клонирования заключается в удалении собственного ядра у созревшего ооцита (энуклеация) и в замене его на ядро СК, содержащее генетическую информацию только донорского организма [18]. Как правило, ооциты лишают ядерного материала, используя классический метод слепой энуклеации, который предполагает аспирацию первого полярного тельца (ППТ) и части прилежащей ооплазмы с метафазными хромосомами [19, 20]. В процессе энуклеации интактный ооцит проходит испытание на сохранение своей целостности, жизнеспособности и потенции к эмбриональному развитию [21, 22]. Микроманипуляции, связанные с удалением и переносом ядерного материала (прокол оболочек, биопсия ооплазмы, подсадка донорской клетки), являются стрессом для ооцита и могут приводить к его дегенерации, в том числе вследствие необратимых повреждений плазматической мембраны и лизиса содержимого [23, 24]. Процедура энуклеации и переноса в перивителлиновое пространство полученного цитопласта СК, которую в англоязычных публикациях определяют как перенос ядра (nuclear transfer, NT), может быть также сопряжена с утратой и разрушением части клеточных компартментов, ультраструктур и молекулярных факторов ооцита, необходимых для последующего развития [25–27]. Вследствие вышесказанного для повышения эффективности SCNT важное значение приобретает поиск решений по повышению устойчивости ооцита к механическим воздействиям в ходе микроманипуляций [28].

Одним из основных компонентов цитоскелета ооцита являются субъединицы белка актина, полимеризованные в форме двухцепочечных спиральных нитей — микрофиламентов [29]. Актиновые микрофиламенты накапливаются в кортексе в период цитоплазматического созревания и к наступлению стадии метафазы второго деления мейоза (MII) уже полностью пронизывают кортикальный слой [30, 31]. Микрофиламенты тесно связаны с оолеммой и обеспечивают прочность цитоскелета ооцита [32].

Цитофармакологический агент цитохалазин Б, продукт метаболизма плесневых грибов, может воздействовать на актиновые микрофиламенты, вызывая их деполимеризацию [33]. Разрушение полимерных актиновых нитей изменяет физические свойства цитоплазмы ооцитов, снижает жёсткость и повышает эластичность плазматической мембраны [34]. Цитохалазин Б стабилизирует цитоскелет ооцита, предотвращая его структурные повреждения и облегчая реконструирование [35]. Цитохалазин Б в настоящее время широко используется в клонировании млекопитающих, в том числе в ходе NT [36–39]. Однако вопрос о целесообразности применения данного химического агента с этой целью всё ещё остаётся открытым. Есть данные, что NT ооцитов крупного рогатого скота, овец и свиней может проводиться без его участия [40–42]. В некоторых случаях использование цитохалазина Б приводило к ухудшению развития клонированных эмбрионов домашних животных [32, 42].

Цель исследования — оценить эффективность SCNT овец (Ovis aries) при использовании цитохалазина Б в период подготовки созревших ооцитов перед NT в зависимости от продолжительности данной процедуры.

Материалы и Методы

Во всех экспериментах, за исключением отдельно указанных случаев, использовали реактивы производства Sigma-Aldrich (CША). Культивирование ооцитов, СК и эмбрионов осуществляли при температуре 38,5 °С в атмосфере с 5% СО₂. Вне инкубатора все манипуляции c данными объектами проводили при 37 °С.

Подготовка донорских клеток (кариопластов)

Для работы была использована среда DMEM (Dulbecco’s modified eagle medium) (Gibco, США) в следующих модификациях:

• дополненная 15% фетальной бычьей сыворотки (ФБС), 50 мкг/мл гентамицина, 1% незаменимых аминокислот (DMEM-Р);
• дополненная 5% ФБС и 50 мкг/мл гентамицина (DMEM-М).

Донорскими клетками служили фетальные фибробласты овец IV–V пассажа. За несколько дней до NT клетки размораживали в водяной бане при 37 °С, содержимое переносили в центрифужную пробирку с 10 мл DMEM-М и центрифугировали при 1500 об./мин. После этого клетки культивировали в DMEM-Р до завершения формирования монослоя, проводили смену среды на такую же аналогичного состава, но с содержанием 0,5% ФБС, и дополнительно культивировали ещё в течение 48 ч для остановки клеточного цикла фетальных фибробластов на стадии G0/G1. После окончания периода инкубации в условиях сывороточного голодания, которое совпадало с началом эксперимента по NT, готовили суспензию клеток согласно протоколу, описанному ранее [43]. Кратко: среду, в которой происходило культивирование фетальных фибробластов, заменяли раствором трипсина–ЭДТА (Gibco, США), инкубировали при 37 °С до открепления клеток со дна культуральной посуды, после чего фетальные фибробласты переносили в пробирки со средой ТС-199, дополненной 50 мкг/мл гентамицина и 0,3% бычьего сывороточного альбумина. Клетки осаждали путём центрифугирования при 300 g в течение 7 мин, супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в среде аналогичного состава до использования при NT.

Подготовка ооцитов (цитопластов)

Источником ооцитов служили яичники овец, доставленные из пункта убоя в физиологическом растворе при температуре 30–35 °С в течение 2,5–3 ч. Препарирование яичников, выделение из них ооцитов в составе ооцит-кумулюсных комплексов, селекцию пригодных для культивирования ооцит-кумулюсных комплексов и их инкубацию с целью созревания (in vitro maturation, IVM) проводили по ранее описанному протоколу [44].

Через 19–23 ч IVM ооциты освобождали от клеток кумулюса, после чего выполняли селекцию тех, которые достигли стадии MII мейоза (созрели in vitro), т.е. имели в своём перивителлиновом пространстве ППТ, и тех, в которых отсутствовали признаки дегенерации и лизиса [45]. Первую группу отобранных ооцитов с ППТ перед процедурой NT инкубировали в течение 20 мин в среде, содержащей 7,5 мкг/мл цитохалазина Б (опыт); другая часть хранилась в среде аналогичного состава в отсутствие цитохалазина Б (контроль). Средой культивирования служила TC-199, дополненная 10% ФБС и 50 мкг/мл гентамицина.

Процедура NT: энуклеация ооцитов и перенос в перивителлиновое пространство полученных цитопластов соматических клеток

Микрохирургические процедуры с клетками выполняли с помощью инвертированного микроскопа Nikon Eclipse Ti (Nikon, Япония), совмещённого c системой лево- и правосторонних манипуляторов грубой (механические) и точной (масляно-гидравлические) настройки Narishige (Япония), а также используя масляно-гидравлические инжекторы. Для NT ооциты в количестве 15–20 клеток помещали в капли среды TC-199 с 5% ФБС объёмом 15 мкл, нанесённые на дно чашки Петри диаметром 60 мм («Биомедикал», Россия) и покрытые лёгким минеральным маслом. В те же капли вносили по 1–2 мкл суспензии фетальных фибробластов. Удаление ППТ и перенос единичных фибробластов проводили, используя микропипетку с внутренним диаметром 13–15 мкм (Origio, CША). Ооциты фокусировали с помощью удерживающей пипетки (Origio, CША) в поле зрения микроскопа в положении, позволяющем чётко визуализировать ППТ в перивителлиновом пространстве ооцита в направлении на 1 или 5 ч условного циферблата. Микропипетку для биопсии подводили вплотную к оболочке ооцитов, прокалывали zona pellucida в месте локализации ППТ, хромосомы яйцеклетки удаляли вслепую аспирацией ППТ и 10–20% прилежащей цитоплазмы. СК инъецировали в перивителлиновое пространство зафиксированного ооцита микропипеткой, используемой ранее для биопсии ППТ, через отверстие, сформированное в процессе энуклеации. По окончании микроманипуляций определяли результативность NT, проводя отбор морфологически нормальных (без признаков лизиса) комплексов ооцит–СК и расчёт их количества относительно общего числа ооцитов с ППТ, использованных для NT.

Получение цитогибридов, их активация и постактивационное культивирование

С целью интеграции содержимого СК в ооцит отобранные клеточные комплексы подвергали электрослиянию, используя мультипоратор фирмы Eppendorf (Германия), по методике, описанной нами ранее [45]. Клеточные комплексы размещали между электродами камеры, заполненной буфером, выравнивали с помощью тонкого стеклянного капилляра и располагали таким образом, чтобы блестящая оболочка ооцита примыкала к одному из электродов, а СК находилась рядом с местом их контакта. Объединение ооцита и СК в цитогибрид проводили, используя импульсы постоянного тока. После выполнения электрослияния комплексы хранили в среде ТС-199, содержащей 10% ФБС, в условиях инкубатора. Через 60 мин инкубации отбирали образовавшиеся цитогибриды, которые идентифицировали по отсутствию донорской клетки в перивителлиновом пространстве ооцита. Неслившиеся комплексы подвергали повторному электрическому воздействию. Результативность слияния оценивали по количеству образовавшихся цитогибридов к общему числу использованных комплексов ооцит–СК.

Цитогибриды, полученные в результате электрослияния, обрабатывали иономицином в дозе 5 мМ в течение 5 мин, помещали в среду эмбрионального развития, дополненную 2 мМ 6-(диметиламино)пурина и 10 мкг/мл циклогексимида, и инкубировали в течение 4 ч. Для эмбрионального развития активированные клетки культивировали в среде аналогичного состава в отсутствие данных веществ ещё двое суток [45], после чего определяли количество раздробившихся цитогибридов, его долю от числа полученных цитогибридов, а также его отношение к исходному количеству комплексов ооцит–СК.

Статистический анализ данных

Статистическую обработку данных проводили при помощи лицензионного программного пакета SigmaStat 2.03.0 (Systat Software Inc., США). Число независимых опытов в каждой экспериментальной группе было не менее 9. Результаты выражали как средние значения (M) и стандартные ошибки средних (±SEM). Проверку нормальности распределения производили с помощью критерия согласия Колмогорова–Смирнова. Для оценки статистической значимости различий между сравниваемыми средними значениями использовали t-критерий Стьюдента, при этом был принят порог значимости p <0,05.

Результаты

Этап проведения NT у овец иллюстрирует рис. 1. Экспериментальные данные оценки показателей результативности NT (количество морфологически нормальных комплексов ооцит–СК относительно числа ооцитов с ППТ), слияния и дробления в зависимости от использования (опыт) или неиспользования (контроль) цитохалазина Б в период подготовки созревших ооцитов к процедуре NT представлены в табл. 1. На данном этапе исследования реконструировано всего 520 ооцитов с ППТ. Результативность NT не различалась между сравниваемыми группами и находилась на высоком уровне. Ооциты, обработанные цитохалазином Б и реконструированные без его использования, также статистически значимо не различались по формированию цитогибридов (ооцитов после удаления ядра и слияния с СК). В свою очередь доля раздробившихся цитогибридов на 2-й день эмбрионального культивирования, рассчитанная от числа энуклеированных ооцитов, слившихся с СК, в группе цитохалазина Б оказалась существенно — на 22,0% — выше по сравнению с контрольной группой (p=0,0029). Положительный эффект сохранялся и в случае, когда выход эмбрионов ранних стадий развития рассчитывали относительно количества комплексов ооцит–СК. В контроле данный показатель составил 12,1±3,2%, в опытной группе — 20,8±2,6% и был статистически значимо выше (p=0,041).

 

Рис. 1. Микрофотографии ооцитов овец в период проведения процедуры NT (энуклеации ооцитов и переноса в перивителлиновое пространство полученных цитопластов донорской соматической клетки): a — индивидуальное фиксирование ооцита с помощью удерживающей пипетки в поле зрения микроскопа в положении, позволяющем чётко визуализировать первое полярное тельце (ППТ); b–c — энуклеация ооцита; d — захват соматической клетки (СК) микропипеткой; e — перенос СК в перивителлиновое пространство энуклеированного ооцита; f — завершение процедуры NT: получение комплекса ооцит–СК. Микроскоп Eclipse Ti-U (Nikon, Япония). ППТ указаны белыми стрелками, СК — чёрными стрелками; ×200.

Fig. 1. Micrographs of sheep oocytes during the nuclear transfer procedure: a, individual fixation of the oocyte using a holding pipette within the microscope’s field of view, positioned to clearly visualize the first polar body (PB1); b–c, oocyte enucleation; d, somatic cell capture with a micropipette; e, somatic cell transfer into the perivitelline space of the enucleated oocyte; f, completion of the nuclear transfer procedure: formation of the oocyte–somatic cell complex. Microscope: Eclipse Ti-U (Nikon, Japan). PB1 is indicated by white arrows, somatic cell by black arrows; ×200.

 

Таблица 1. Влияние цитохалазина Б¹ на получение клонированных эмбрионов овец

Table 1. Effect of cytochalasin B¹ on the production of cloned sheep embryos

Экспериментальная группа	Число ооцитов с ППТ, n	Получено
		комплексов ооцит–СК		цитогибридов2		раздробившихся цитогибридов3
		n	%, M±SEM	n	%, M±SEM	n	%, M±SEM
Контроль	201	193	96,3±1,6	62	33,9±5,1	21	35,7±7,7
Цитохалазин Б	319	312	97,8±1,7	114	35,6±3,7	65	59,7±6,9*

Примечание: ¹ — ооциты с первым полярным тельцем (ППТ) перед процедурой NT (энуклеации ооцитов и переноса в перивителлиновое пространство полученных цитопластов донорской соматической клетки, СК) кратковременно культивировали в среде ТС-199 с 10% фетальной бычьей сыворотки в присутствии (7,5 мкг/мл в течение 20 мин) и отсутствии (контроль) цитохалазина Б; ² — доля цитогибридов, рассчитанная как отношение количества цитогибридов к числу комплексов ооцит–CК; ³ — доля раздробившихся цитогибридов, рассчитанная как отношение количества раздробившихся цитогибридов к числу цитогибридов; * различия с контролем статистически значимы при p=0,0029.

Note: ¹ oocytes with the first polar body (PB1) were briefly cultured in TC-199 medium with 10% fetal bovine serum in the presence (7.5 µg/mL for 20 min) and absence (control) of cytochalasin B before the nuclear transfer procedure (enucleation of oocytes and transfer of donor somatic cell–derived cytoplasts into the perivitelline space); ² proportion of cytoplasmic hybrids, calculated as the ratio of the number of cytoplasmic hybrids to the number of oocyte–somatic cell complexes; ³ proportion of cleaved cytoplasmic hybrids, calculated as the ratio of the number of cleaved cytoplasmic hybrids to the number of cytoplasmic hybrids; * significant differences compared to the control, p=0.0029.

 

Эффект цитохалазина Б на результативность SCNT был также изучен в контексте продолжительности процедуры NT. Сравнивали две экспериментальные группы: в первой ооциты с ППТ после кратковременного культивирования в присутствии данного агента подвергались процедуре NT в течение периода, не превышающего 40 мин; во второй на микроманипуляции уходило более 40 мин (но не более 50 мин). Результаты данного эксперимента представлены в табл. 2. Доля комплексов энуклеированный ооцит–СК с отсутствием признаков дегенерации статистически значимо не различалась между вариантами и находилась, как и в первой серии экспериментов, на высоком уровне. В то же время эффективность слияния зависела от длительности NT: доля образовавшихся цитогибридов относительно числа комплексов ооцит–СК при продолжительности процедуры более 40 мин была статистически значимо (p=0,002) ниже — на 18,8% — по сравнению со случаями, когда процедура длилась менее 40 мин. Влияния длительности NT на компетенцию полученных цитогибридов к дроблению и эмбриональному развитию не выявлено, но более низкое количество цитогибридов в группе с продолжительностью NT >40 мин на слияние стало причиной снижения выхода эмбрионов ранних стадий развития, рассчитанного относительно количества комплексов ооцит–СК. В группе >40 мин данный показатель составил 13,6±3,5%, в группе ≤40 мин он составил 23,0±2,5% и был статистически значимо выше (p=0,042).

 

Таблица 2. Влияние цитохалазина Б¹ на получение клонированных эмбрионов овец в зависимости от продолжительности процедуры NT (энуклеации ооцитов и переноса в перивителлиновое пространство полученных цитопластов донорской соматической клетки)

Table 2. Effect of cytochalasin B¹ on the production of cloned sheep embryos depending on nuclear transfer duration

Продолжительность NT, мин	Число ооцитов с ППТ, n	Получено
		комплексов ооцит–СК		цитогибридов2		раздробившихся цитогибридов3
		n	%, M±SEM	n	%, M±SEM	n	%, M±SEM
≤40	205	194	94,3±2,5	84	44,0±3,2а	45	55,2±6,8
>40	164	160	97,9±2,1	41	25,2±4,6б	21	54,9±9,2

Примечание: ¹ — ооциты с первым полярным тельцем (ППТ) перед процедурой NT (энуклеацией ооцитов и переносом в перивителлиновое пространство полученных цитопластов донорской соматической клетки, СК) кратковременно культивировали в среде ТС-199 с 10% ФБС в присутствии (7,5 мкг/мл в течение 20 мин) цитохалазина Б; ² — доля цитогибридов, рассчитанная как отношение количества цитогибридов к числу комплексов ооцит–CК; ³ — доля раздробившихся цитогибридов, рассчитанная как отношение количества раздробившихся цитогибридов к числу цитогибридов; ^{а, б} — cредние значения для одной группы, помеченные разными буквами, статистически значимо различаются при p=0,002.

Note: ¹ — oocytes with the first polar body (PB1) were briefly cultured in TC-199 medium with 10% FBS in the presence (7.5 µg/mL for 20 min) of cytochalasin B before the nuclear transfer procedure (enucleation of oocytes and transfer of donor somatic cell–derived cytoplasts into the perivitelline space); ² proportion of cytoplasmic hybrids, calculated as the ratio of the number of cytoplasmic hybrids to the number of oocyte–somatic cell complexes; ³ proportion of cleaved cytoplasmic hybrids, calculated as the ratio of the number of cleaved cytoplasmic hybrids to the number of cytoplasmic hybrids; ^{a, b} mean values within a single group marked with different letters are statistically significantly different at p=0.002.

 

Обсуждение

Основным ограничением широкого применения SCNT у домашних животных, в том числе у овец, остаётся низкая эффективность, которая в том числе обусловлена сложностью и многоступенчатостью технологии [46]. Одной из стратегий повышения результативности SCNT является использование агентов, позволяющих уменьшить дегенерацию ооцитов и сохранить их потенцию к последующему развитию.

Для процедуры NT в основном используют ооциты на стадии MII [20]. Во время энуклеации под действием давления пипетки ооцит претерпевает повреждения вследствие локального разрыва плазматической мембраны и утраты части цитоплазмы [47]. Цитохалазин Б благодаря своей функции обратимого ингибирования полимеризации микрофиламентов может усиливать текучесть ооплазмы и пластичность оболочек ооцитов, уменьшая их общую травматичность при проведении микроманипуляций [48]. При этом вопрос его применения относительно процедуры NT остаётся дискуссионным.

Длительность удаления ядра ооцита на стадии MII и переноса ядра СК среди прочих факторов зависит от выбора стратегии NT: например, частичное рассечение zona pellucida всех ооцитов с последующей энуклеацией и подсадкой СК; прокол блестящей оболочки с энуклеацией всей группы ооцитов и отложенной трасплантацией ядер СК; перенос СК в ооцит сразу после удаления ядра; слепая энуклеация или энуклеация под контролем ультрафиолетового света. В наших экспериментах время проведения процедуры NT составляло для 15–20 ооцитов от 20 до 50 мин, что сопоставимо с данными зарубежных исследований, согласно которым в рамках слепого метода энуклеация 30 ооцитов в среднем занимает около 30 мин, а инъекция СК — 20–30 мин [47, 49].

В настоящем исследовании (см. табл. 1) цитохалазин Б на этапе подготовки созревших ооцитов к реконструированию не оказал значимого влияния на результативность NT и эффективность слияния, но повысил выход клонированных эмбрионов ранних стадий развития как от числа полученных цитогибридов (p=0,0029), так и от комплексов ооцит–СК (p=0,041). По всей видимости, действие цитохалазина Б на цитоархитектуру ооцитов проявляется спустя некоторое время, т.е. имеет долгосрочный эффект. Известно, что повреждение цитоскелета приводит к серьёзным последствиям для жизнедеятельности клетки вплоть до остановки цитокинеза и митотического цикла [30]. Вероятно, стабилизация цитоскелета цитохалазином Б с последующей реполимеризацией микрофиламентов позволяет ооциту легче преодолевать деформации, вызванные микроманипуляциями, и способствует его более стабильной трансформации в клонированный эмбрион после слияния с СК.

Влияние обработки половых клеток цитохалазином Б на показатели эффективности клонирования, тем не менее, зависело от длительности NT: наблюдалось снижение уровня слияния (p=0,002) и, как следствие, доли образования клонированных эмбрионов от числа комплексов ооцит–СК в случае превышения продолжительности процедуры NT более 40 мин (p=0,042) на фоне отсутствия негативного эффекта данного фактора на уровень дробления цитогибридов. Нами сделано предположение, что изменение продолжительности микроманипуляций в сторону превышения допустимых временн´ых значений (в наших условиях это не более 40 мин) имеет большее значение для электрических свойств ооцита и СК, чем для функциональных процессов, обеспечивающих переход полученного цитогибрида к эмбриональному развитию.

Заключение

Кратковременное культивирование созревших ооцитов в присутствии цитохалазина Б перед процедурой NT повышает выход клонированных эмбрионов овец ранних стадий развития. Удлинение продолжительности периода энуклеации ооцитов, предикубированных в цитохалазине Б, и переноса в них ядра СК до более 40 мин приводит к снижению показателей результативности SCNT овец. В целом, учитывая выраженный долгосрочный эффект цитохалазина Б на ооциты, полученные нами результаты и выявленные закономерности можно интерпретировать как предварительные, поскольку продолжение настоящего исследования актуально как с точки зрения получения эмбрионов более поздних стадий развития, так и с целью определения их качества.

Дополнительная информация

Вклад авторов. А.В. Лопухов — обзор и анализ литературных источников, участие в проведение экспериментов, обработка и анализ полученных результатов, подготовка статьи к публикации; Е.Н. Шедова — участие в проведении экспериментов; E.В. Цындрина — участие в проведении экспериментов; Г.Н. Сингина — общее руководство, участие в проведение экспериментов, подготовка статьи к публикации. Все авторы одобрили рукопись (версию для публикации), а также согласились нести ответственность за все аспекты работы, гарантируя надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой её части.

Этическая экспертиза. Неприменимо.

Источник финансирования. Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования РФ (Государственное задание № FGGN-2024–0014).

Раскрытие интересов. Авторы заявляют об отсутствии отношений, деятельности и интересов за последние три года, связанных с третьими лицами (коммерческими и некоммерческими), интересы которых могут быть затронуты содержанием статьи.

Оригинальность. При создании настоящей работы авторы не использовали ранее опубликованные сведения (текст, иллюстрации, данные).

Доступ к данным. Все данные, полученные в настоящем исследовании, доступны в статье.

Генеративный искусственный интеллект. При создании настоящей статьи технологии генеративного искусственного интеллекта не использовали.

Рассмотрение и рецензирование. Настоящая работа подана в журнал в инициативном порядке и рассмотрена по обычной процедуре. В рецензировании участвовали три члена редакционной коллегии и научный редактор издания.

Additional information

Authors' contributions. A.V. Lopukhov — review and analysis of literature sources, participation in experiments, processing and analysis of the obtained results, preparation of the article for publication; E.N. Shedova — participation in experiments; E.V. Tsyndrina — participation in experiments; G.N. Singina — general management, participation in experiments, preparation of the article for publication. All authors approved the manuscript (version for publication) and agreed to take responsibility for all aspects of the work, ensuring the proper consideration and resolution of any issues related to the accuracy and integrity of any part of the study.

Ethics approval. Not applicable.

Funding sources. This work was financially supported by the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation (State assignment No. FGGN-2024–0014).

Disclosure of interests. The authors declare no relationships, activities, or interests over the past three years involving third parties (commercial or non-commercial) whose interests could be affected by the content of this article.

Statement of originality. The authors did not use any previously published material (text, illustrations, or data) in the preparation of this work.

Data availability statement. All data obtained in the present study are available in the article.

Generative AI. No generative artificial intelligence technologies were used in the preparation of this article.

Provenance and peer-review. This work was submitted to the journal on the authors’ initiative and underwent the standard review process. The manuscript was reviewed by three members of the editorial board and the journal’s scientific editor.

About the authors

Alexandr V. Lopukhov

Federal Research Center for Animal Husbandry named after Academy Member L.K. Ernst

Author for correspondence.
Email: vubi_myaso@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1284-1486
SPIN-code: 1092-2523
Russian Federation, Village Dubrovitsy, Podolsk, Moscow Region

Ekaterina N. Shedova

Federal Research Center for Animal Husbandry named after Academy Member L.K. Ernst

Email: shedvek@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-9642-2384
SPIN-code: 1067-8115
Russian Federation, Village Dubrovitsy, Podolsk, Moscow Region

Evgeniya V. Tsyndrina

Federal Research Center for Animal Husbandry named after Academy Member L.K. Ernst

Email: kiril04kina@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3263-2358
Russian Federation, Village Dubrovitsy, Podolsk, Moscow Region

Galina N. Singina

Federal Research Center for Animal Husbandry named after Academy Member L.K. Ernst

Email: g_singina@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0198-9757
SPIN-code: 4118-2990

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Village Dubrovitsy, Podolsk, Moscow Region

References

Supplementary files