A novel experimental in vitro human definitive endoderm cell-derived model of Wilson disease

Texto integral

ВВЕДЕНИЕ

Болезнь Вильсона–Коновалова (БВК) обусловлена мутациями гена ATP7B, кодирующего медь-транспортирующую АТФазу, функциональная активность которой обеспечивает транспорт и выведение меди [1]. У здоровых людей избыток меди экскретируется с желчью и удаляется из организма. В случае, если человек наследует мутантные копии гена ATP7B от обоих родителей, экспорт меди нарушается, приводя к её накоплению в печени, а позднее — в центральной нервной системе и других органах. Неоднозначные и многочисленные клинические проявления затрудняют своевременную постановку диагноза, что может привести к терминальному повреждению печени и тяжёлым неврологическим симптомам.

Изучение молекулярных механизмов, лежащих в основе патогенеза заболевания, невозможно без адекватной клеточной модели. Однако в случае БВК моделирование in vitro в значительной степени затруднено. Клеточные модели на основе иммортализованных культур не передают в полной мере сложных взаимодействий между разными клеточными популяциями печени, а полученные на них результаты зачастую не удаётся транслировать дальше. По этой причине для наиболее полной имитации патофизиологии БВК наиболее предпочтительно использование первичных гепатоцитов человека и человеческих плюрипотентных стволовых клеток, включая эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) [2, 3]. Первичные гепатоциты человека лучше отражают функции печени, но доступ к ним ограничен, кроме того, их срок жизни в культуре невелик [4]. ИПСК можно получить от пациентов с конкретными мутациями ATP7B, например с распространённой мутацией R778L или H1069Q. ИПСК пациента сохраняют способность дифференцироваться, а полученные из них гепатоцитоподобные клетки демонстрируют дефекты транспорта меди и аномальную локализацию ATP7B, воспроизводя фенотип заболевания [5, 6]. Однако гепатоцитоподобные клетки, полученные из ИПСК, часто не достигают полной зрелости, что может ограничить их использование в определённых исследованиях [7]. Модели на основе человеческих ЭСК разрабатывали путём введения специфических мутаций с использованием технологии геномного редактирования CRISPR/Cas9. Например, гепатоцитоподобные клетки, полученные при дифференцировке человеческих ЭСК, несущих мутацию R778L, демонстрировали дефекты экспорта меди, аналогичные тем, что наблюдаются в моделях на основе клеток пациентов [8]. В этом случае моделирование БВК возможно без использования образцов пациентов. Однако использование ЭСК часто ограничено этическими соображениями, связанными с их происхождением из эмбрионов. ЭСК менее доступны (по сравнению с ИПСК), что может затруднить их широкое применение в исследованиях.

Дефинитивная эндодерма является ключевым зародышевым листком, формирующимся на этапе гаструляции (15–17-й день эмбриогенеза человека) и дающим начало структурам печени, поджелудочной железы, лёгких, щитовидной железы и кишечной трубки [9, 10]. Процесс её развития начинается с имплантации бластоцисты в эндометрий, что инициирует переход от эмбриобласта к эпибласту — предшественнику всех трёх зародышевых листков. На стадии гаструляции клетки эпибласта мигрируют к срединной линии, образуя первичную полоску — структуру, регулируемую сигнальными путями WNT и NODAL [11]. Клетки, проходящие через узел Гензена (передний участок первичной полоски), под действием факторов Brachyury (T) и FOXA2 детерминируются в бипотентные мезендодермальные предшественники [12].

При дифференцировке in vitro естественные процессы развития стволовых клеток в дефинитивной эндодерме воспроизводят с помощью активина A (аналог NODAL) и ингибитора GSK3β (CHIR99021). Под их воздействием мезендодермальные клетки дифференцируются в дефинитивную эндодерму, экспрессируя специфические маркёры SOX17, FOXA2 и CXCR4 [13]. Клиническая значимость дефинитивной эндодермы связана с её ролью в генерации функциональных клеток, в частности гепатоцитов и инсулин-продуцирующих β-клеток поджелудочной железы [14].

В данном исследовании мы представляем платформу, состоящую из клеток дефинитивной эндодермы, полученных путём дифференцировки ИПСК здорового донора. Эндодермальный этап — первая и самая короткая стадия дифференцировки ИПСК в гепатоциты, причём в этот момент ген ATP7B уже активно экспрессируется [6]. Использование клеток дефинитивной эндодермы позволяет получить полноценную модель, которая значительно выигрышнее уже существующих аналогов по времени и в экономическом плане. Представленная методика в дальнейшем также может быть реализована и для клеток пациентов с БВК, несущих те или иные мутации гена ATP7B, что позволит получить персонифицированные модели. Используя этот инновационный подход, мы стремимся углубить понимание механизмов БВК, а также способствовать разработке таргетных терапевтических стратегий, адаптированных к индивидуальным профилям пациентов.

ЦЕЛЬ

Создание in vitro модели на основе клеток дефинитивной эндодермы человека, полученных из ИПСК здорового донора, для изучения молекулярных основ патогенеза БВК и тестирования различных терапевтических стратегий.

МЕТОДЫ

Культивирование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Линию ИПСК культивировали без фидера в среде mTeSR plus (STEMCELL Technologies, Канада) c добавлением 50 ед./мл пенициллина–стрептомицина («ПанЭко», Россия) на покрытых «Матригелем» без факторов роста (Corning, США) чашках Петри во влажном инкубаторе при 37 °C в атмосфере 5% CO₂. Пассирование клеток проводили с помощью раствора Accutase (Himedia, Индия). При пассировании клеток к среде mTeSR plus добавлялили 10 мкМ ROCK-ингибитора (STEMCELL Technologies, Канада). Отсутствие микоплазменной контаминации подтверждали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием набора MycoReport («Евроген», Россия).

Иммуноцитохимическое окрашивание

Клетки фиксировали 3,7% раствором параформальдегида в фосфатно-солевом буферном растворе — PBS («ПанЭко», Россия) в течение 20 мин при комнатной температуре, после чего трижды промывали 200 мкл PBS. В случае окраски эмбриоидных телец фиксировали их 30 мин при медленном перемешивании, отмывали 0,1% раствором Triton-X (PanReac, Италия) в PBS также при медленном перемешивании. Затем пермеабилизировали мембраны клеток 0,2% раствором Triton-X в PBS в течение 10 мин при комнатной температуре, после чего отмывали от Triton-X три раза с использованием 200 мкл PBS. В случае окраски эмбриоидных телец стадия пермеабилизации была объединена со стадией блокирования неспецифического связывания антител инкубацией в блокирующем буфере, представляющем собой раствор 0,3% Triton-X в PBS и 5% козьей сыворотки (Abcam, США), при комнатной температуре в течение 2 ч при осторожном перемешивании. Затем вносили блокирующий буфер, 0,2% (в случае окраски эмбриоидных телец — 0,3%) Triton-X в PBS, 5% козьей сыворотки и инкубировали в течение 1 ч. Первичные антитела разводили в блокирующем буфере, представляющем собой раствор 0,2% (в случае окраски эмбриоидных телец — 0,3%) Triton-X в PBS и 5% козьей сыворотки, в соответствии с инструкциями производителя и инкубировали при 4 °C в течение ночи, после чего промывали 3 раза с использованием 200 мкл PBS в течение 10 мин. В случае окраски эмбриоидных телец их отмывали раствором 0,1% Triton-X в PBS при медленном перемешивании. Вторичные антитела, конъюгированные с флуорофором, разводили в блокирующем буфере, представляющем собой раствор 0,2% (в случае окраски эмбриоидных телец — 0,3%) Triton-X в PBS и 5% козьей сыворотки, в соответствии с инструкциями производителя и инкубировали в течение 1 ч в темноте, после чего промывали 3 раза 200 мкл раствора PBS в течение 10 мин. Для окрашивания ядер использовали краситель DAPI (Lumiprobe, Россия). Препараты культур клеток анализировали с помощью EVOS M7000 Imaging System (Thermo Fisher Scientific, США), а препараты эмбриоидных телец — с помощью конфокального микроскопа Eclipse Ti2 (Nikon, Япония). Список использованных в работе первичных антител приведён в табл. 1, вторичных антител — в табл. 2.

 

Таблица 1. Первичные антитела, использованные в работе

Table 1. Primary antibodies used in the study

Антитело	Производитель, страна	Кат. №
Rabbit anti-human OCT4 (OCT3) Antibody, Clone 3A2A20	STEMCELL Technologies, Канада	60093.1
Rabbit anti-SOX2 Antibody	Cell Signaling Technology, США	3579S
Mouse anti-human SSEA-4 Antibody, Clone MC-813-70	STEMCELL Technologies, Канада	60062
Rabbit anti-SOX17 Antibody	Affinity Biosciences, Китай	DF9090
Rabbit anti-FOXA2 Antibody	Merk, Германия	AB4125
Mouse anti-human TRA-1-60, Clone TRA-1-60R	STEMCELL Technologies, Канада	60064
Rabbit anti-CD31, EPR3094	Abcam, Великобритания	ab76533
Mouse anti-human NESTIN	Merk Millipore, США	ZMS1022-4Х25Ul
Rabbit anti-VIMENTIN	Thermo Fisher Scientific, США	RM-9120-S0
Rabbit anti-PAX6	BioLegend, США	901302
Mouse anti-human CK7, клон PBM-12F1	«ПраймБиоМед», Россия	10-310048-01
Rabbit anti-human ATP7B	Sigma-Aldrich, США	HPA013187

 

Таблица 2. Вторичные антитела, использованные в работе

Table 2. Secondary antibodies used in the study

Антитело	Производитель, страна	Кат. №	Разведение
Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed conjugated antibody, Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific, США	A-21245	1/1000
Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed conjugated antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific, США	A-11008	1/500
Goat anti-mouse IgG (H+L) cross-adsorbed conjugated antibody, Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific, США	A-21235	1/1000
Goat anti-mouse IgG (H+L) cross-adsorbed conjugated antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific, США	A-11001	1/1000

 

Кариотипирование

Для формирования метафазных пластинок находящиеся в стадии экспоненциального роста ИПСК обрабатывали раствором «Колцемида» (0,1 мкг/мл; «ПанЭко», Россия) в течение 30 мин при температуре 37 °C в СО₂-инкубаторе. Далее клетки открепляли от поверхности с помощью раствора Accutase (Himedia, Индия) и инкубировали в 0,56% растворе KCl (Sigma-Aldrich, США) в течение 10 мин при температуре 42 °C на водяной бане. Затем суспензию ядер осаждали на центрифуге (300 g, 4 мин) и осадок фиксировали ледяным (–20 °C) раствором, содержащим метанол и уксусную кислоту (Sigma-Aldrich, США) в соотношении 6:1, после чего центрифугировали (300 g, 4 мин) и повторно фиксировали ядра тем же раствором. Затем снова центрифугировали (600 g, 4 мин) и ресуспендировали ядра в растворе, содержащем метанол и уксусную кислоту в соотношении 3:1. Образцы хранили при температуре –20 °C. Для проведения анализа кариотипа суспензию ядер по каплям наносили на холодные (4 °C) предметные стёкла Superfrost (Thermo Fisher Scientific, США), высушивали при комнатной температуре, после чего препараты инкубировали при 95 °C в течение 30 мин. Далее препараты обрабатывали 0,25% раствором трипсина («ПанЭко», Россия) в течение 9–11 с и окрашивали однократным раствором красителя Гимза («ПанЭко», Россия) в течение 1–2 мин, затем высушивали на воздухе. Анализ препаратов был произведён в Национальном медицинском исследовательском центре детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачёва.

Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

Тотальная РНК из фибробластов, ИПСК и дефинитивной эндодермы была выделена с помощью реагента RNA solo (BC034S; «Евроген», Россия), обратная транскрипция проведена с использованием 1 мкг РНК с помощью набора для синтеза первой цепи комплементарной ДНК MMLV RT kit (SK021; «Евроген», Россия). Анализ полимеразной цепной реакции в режиме реального времени выполнен с помощью набора 5X qPCRmix-HS SYBR (PK147L; «Евроген», Россия) с праймерами на OCT4, SOX2, NANOG, FOXA2, SOX17, ACTB, TUBB3 (табл. 3). Использовали анализатор LightCycler® 96 Instrument (Roche Diagnostics, Германия). Программа включала преинкубацию в течение 5 мин при 95 °C, 3 стадии амплификации, повторенные 45 циклов (30 с при 95 °C; 30 с при 55 °C или 25 с при 59 °C; 30 с при 72 °C). Уровни экспрессии генов рассчитывали как кратное изменение экспрессии по сравнению с недифференцированными фибробластами. Относительный уровень экспрессии целевых генов был определён как 2^−ΔΔCt. В качестве контрольных генов использовали β-тубулин III класса (TUBB3) или β-актин (ACTB). Каждая реакция была поставлена в двух биологических повторностях.

 

Таблица 3. Последовательности праймеров, использованных для количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией

Table 3. Primer sequences used for quantitative reverse transcription polymerase chain reaction

Ген	Последовательность праймера
OCT4	F 5’-CAATTTGCCAAGCTCCTGA-3’; R 5’-CGTTTGGCTGAATACCTTCC-3’
SOX2	F 5’-TGCTGCCTCTTTAAGACTAGGAC-3’; R 5’-GCCGCCGATGATTGTTATTA-3’
NANOG	F 5’-TACCTCAGCCTCCAGCAGAT-3’; R 5’-TGCGTCACACCATTGCTATT-3’
FOXA2	F 5’-GGAGCGGTGAAGATGGAAGG-3’; R 5’-CGGCGTTCATGTTGCTCAC-3’
SOX17	F 5’-CAAGATGCTGGGCAAGTC-3’; R 5’-TGGTCCTGCATGTGCTG-3
ACTB	F 5’-AGGCATCCTCACCCTGAAGTA-3’; R 5’-CACACGCAGCTCATTGTAGA-3
TUBB3	F 5’-ACACAGGCGTCCACAGTT-3’; R 5’-GTTCCAGGTCCACCAGAATG-3

 

Дифференцировка индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в клетки дефинитивной эндодермы

Использованный нами протокол дифференцировки был ранее описан в статье D.T. Peters и соавт. [15]. Для дифференцировки ИПСК в дефинитивную эндодерму клетки высевали на покрытые «Матригелем» без факторов роста лунки 96-луночного планшета в 100 мкл среды mTeSR plus (STEMCELL Technologies, Канада) с 10 мкМ ROCK-ингибитора (STEMCELL Technologies, Канада). На следующий день производили смену среды mTeSR plus на среду для дифференцировки, состоящую из DMEM/F12 (Himedia, Индия), 1% B27 plus supplement (Gibco, США), 50 ед./мл пенициллина–стрептомицина, а также содержащую 100 нг/мл активина А (STEMCELL Technologies, Канада) и 3 мкМ малой молекулы CHIR99021 (STEMCELL Technologies, Канада). Клетки культивировали в среде для дифференцировки 5 дней, ежедневно меняя среду.

Модель перегрузки медью

Цитотоксическое действие меди на клетки дефинитивной эндодермы, полученные из ИПСК, оценивали с помощью красителя на основе резазурина — Alamar Blue (Himedia, Индия). Для этого ИПСК дифференцировали в клетки дефинитивной эндодермы в 96-луночных планшетах в течение 5 дней. После дифференцировки среду меняли на среду для клеток дефинитивной эндодермы, состоящую из DMEM/F12 (Himedia, Индия), 1% B27 plus supplement (Gibco, США), 1% N2 supplement (Gibco, США), 1% Glutamax (Gibco, США), 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты (Bidepharm, Китай), 0,1% бычьего сывороточного альбумина (Sigma-Aldrich, США), 5 нг/мл фактора роста фибробластов 2 (SCI store, Россия), 20 нг/мл эпидермального фактора роста (SCI store, Россия), 10 нг/мл фактора роста эндотелия сосудов (SCI store, Россия), 3 мкМ CHIR99021 (STEMCELL Technologies, Канада), 0,5 мкМ ингибитора SB-431542 (STEMCELL Technologies, Канада). Такая среда обеспечивает выживание и пролиферацию клеток дефинитивной эндодермы. Состав среды для дефинитивной эндодермы адаптирован из статьи R.R. Zhang и соавт. [16]. В среду для клеток дефинитивной эндодермы добавляли дигидрат хлорида меди (Sigma-Aldrich, США) в диапазоне от 7,8 до 500 мкМ и инкубировали в течение 24 ч. По окончании инкубации клетки аккуратно промывали один раз 100 мкл PBS для удаления избытка CuCl₂. Затем добавляли 100 мкл культуральной среды для дефинитивной эндодермы и вносили по 10 мкл раствора Alamar Blue. Интенсивность флуоресценции измеряли после 3-часового периода инкубации с помощью планшетного флуориметра Varioscan Lux (Thermo Fisher Scientific, США). Ингибирование жизнеспособности клеток рассчитывали по следующей формуле: ингибирование жизнеспособности клеток (%) = 100 − (образец − F₀) / (контрольный образец − F₀) × 100, где F₀ — интенсивность флуоресценции в образце без клеток, а контрольный образец — это образец с клетками без добавления CuCl₂.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Дифференцировка человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в дефинитивную эндодерму

В исследовании использована линия ИПСК FCBRNi001-A (https://hpscreg.eu/cell-line/FCBRNi001-A), ранее полученная в Федеральном центре мозга и нейротехнологий Федерального медико-биологического агентства России из фибробластов кожи здорового донора-мужчины [17]. Для перепрограммирования фибробластов в ИПСК был использован неинтегрирующий вирус Сендай с факторами транскрипции Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc. Клетки имели типичную морфологию ИПСК (рис. 1, a), а анализ кариотипа полученных в результате перепрограммирования клеток, проведённый нами на 12-м пассаже методом GTG-окрашивания метафазных пластинок, показал наличие нормального кариотипа (46, XY) (рис. 1, b). Плюрипотентные свойства были подтверждены нами с помощью иммуноцитохимического окрашивания на маркёры плюрипотентности SOX2, OCT4, TRA-1-60 и SSEA-4 (рис. 1, d). Количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией также выявила 8000-кратное увеличение экспрессии OCT4 (p < 0,0001), 5000-кратное — SOX2 (p < 0,0001), 400-кратное — NANOG (p < 0,0001) по сравнению с исходными фибробластами (рис. 1, c). Полученная культура демонстрировала способность к образованию тканей всех трёх зародышевых листков (энто-, экто- и мезодермы) при спонтанной дифференцировке in vitro в составе эмбриоидных телец (рис. 1, e).

 

Рис. 1. Характеристика линии ИПСК FCBRNi001-A: a — морфология клеток; b — анализ кариотипа линии ИПСК; c — результаты количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией на маркёры плюрипотентности OCT4, SOX2, NANOG; * статистически значимые различия, p < 0,0001; d — иммуноцитохимическое окрашивание на маркёры плюрипотентности SOX2, OCT4, TRA-1-60 и SSEA-4; окраска ядер: DAPI (синий), исследуемый маркёр (красный или зелёный); е — иммуноцитохимическое окрашивание эмбриоидных телец, сформированных из ИПСК, при спонтанной дифференцировке в ткани трёх зародышевых листков; окраска ядер: DAPI (синий), исследуемый маркёр (красный или зелёный). Маркёры эктодермы — NESTIN, PAX6, CYTOKERATIN 7 (CK7); мезодермы — VIMENTIN, CD31; эндодермы — SOX17. Бар 50 мкм. ИПСК — индуцированные плюрипотентные стволовые клетки.

Fig. 1. FCBRNi001-A induced pluripotent stem cell line: a, cell morphology; b, karyotyping of the induced pluripotent stem cell line; c, quantitative reverse transcription polymerase chain reaction for pluripotency markers: OCT4, SOX2, NANOG; *, statistically significant differences, p < 0.0001; d, immunocytochemical staining for pluripotency markers: SOX2, OCT4, TRA-1-60, and SSEA-4. DAPI (blue) nuclear staining, red/green marker staining; e, immunocytochemical staining of embryoid bodies obtained from induced pluripotent stem cells during spontaneous differentiation in the tissue of three germ layers: DAPI (blue) nuclear staining, red/green marker staining. Ectoderm markers include NESTIN, PAX6, CYTOKERATIN 7 (CK7); mesoderm markers include VIMENTIN, CD31; endoderm marker is SOX17. Scale bar = 50 μm; ИПСК, induced pluripotent stem cells.

 

Для дальнейшей дифференцировки использовали ИПСК на 15–18 пассажах, что обеспечивает оптимальное соотношение геномной стабильности и дифференцировочного потенциала. Активацию TGFβ-пути (активин А, 100 нг/мл) и ингибирование GSK3β (CHIR99021, 3 мкМ) проводили в соответствии с протоколами, стандартизированными для спецификации дефинитивной эндодермы [18, 19]. Данная комбинация имитирует эмбриональные сигналы Nodal и Wnt, критичные для формирования первичной полоски и последующего разделения мезендодермы. На 5-е сутки дифференцировки > 90% клеток демонстрировали морфологию, характерную для дефинитивной эндодермы: уплощённую эпителиоидную структуру с выраженными межклеточными контактами (рис. 2, а). Иммуноцитохимический анализ подтвердил ядерную локализацию транскрипционных факторов SOX17 у (68,55 ± 4,91)% клеток (p < 0,05) и FOXA2 — у (87,12 ± 3,98)% клеток (p < 0,05) (рис. 2, b), что согласуется с данными литературы [13]. Количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией выявила 200-кратное увеличение экспрессии FOXA2 (p < 0,01) и 16-кратное — SOX17 (p < 0,0001) по сравнению с исходными фибробластами (рис. 2, c). Таким образом, полученные нами путём дифференцировки из ИПСК клетки фенотипически и по профилю экспрессии характерных маркёров схожи с клетками дефинитивной эндодермы.

 

Рис. 2. Характеристика клеток дефинитивной эндодермы, дифференцированных из ИПСК: a — морфология клеток; b — иммуноцитохимическое окрашивание на маркёры дефинитивной эндодермы SOX17, FOXA2; окраска ядер: DAPI (синий), исследуемый маркёр (красный). Бар 50 мкм; с — результат количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией на маркёры дефинитивной эндодермы FOXA2, SOX17; * различие с фибробластами статистически значимо, p < 0,01; ** различие с фибробластами статистически значимо, p < 0,0001. ДЭ — дефинитивная эндодерма; ИПСК — индуцированные плюрипотентные стволовые клетки.

Fig. 2. Definitive endoderm cells differentiated from induced pluripotent stem cells: a, cell morphology; b, immunocytochemical staining for definitive endoderm markers (SOX17, FOXA2); DAPI (blue) nuclear staining, red marker staining. Scale bar = 50 μm; c, quantitative reverse transcription polymerase chain reaction for definitive endoderm markers (FOXA2, SOX17); *, difference with fibroblasts is statistically significant, p < 0.01; **, difference with fibroblasts is statistically significant, p < 0.0001. ДЭ, definitive endoderm; ИПСК, induced pluripotent stem cells.

 

Модель перегрузки медью

Согласно данным литературы, ген ATP7B начинает демонстрировать активную экспрессию уже в клетках дефинитивной эндодермы [6]. Для подтверждения этого было проведено иммуноцитохимическое окрашивание дифференцированных нами из ИПСК клеток. Результаты анализа (рис. 3, a) подтвердили наличие в них белка ATP7B. Для имитации патологического накопления меди, характерного для патогенеза БВК, мы искусственно перегружали клетки CuCl₂ путём его внесения в среду. Полученные результаты демонстрируют выраженный дозозависимый эффект CuCl₂ на жизнеспособность клеток дефинитивной эндодермы (рис. 3, b). Полулетальная концентрация CuCl₂ (IC₅₀), при которой гибнет 50% клеток, составила 197 мкМ. Эти данные подтверждают чувствительность предложенной клеточной модели БВК к избытку меди в среде и её пригодность для изучения цитотоксических эффектов меди при патогенезе заболевания.

 

Рис. 3. Клеточная модель болезни Вильсона–Коновалова на основе человеческих клеток дефинитивной эндодермы: a — иммуноцитохимическая окраска клеток дефинитивной эндодермы (микрофотография слева) на экспрессию ATP7B; окраска ядер DAPI (синий), ATP7B (красный). В качестве отрицательного контрольного образца были использованы фибробласты человека (микрофотография справа). Бар 50 мкм; b — кривая ингибирования жизнеспособности клеток дефинитивной эндодермы при добавлении дигидрата хлорида меди. Жизнеспособность клеток дефинитивной эндодермы оценивали через 24 ч после внесения добавки в сравнении с контролем (без добавления CuCl₂). На графике представлены средние значения жизнеспособности и стандартные отклонения в трёх биологических повторностях. Статистическую обработку результатов и определение полулетальной концентрации (IC₅₀) проводили с помощью программы GraphPad Prizm.

Fig. 3. Human definitive endoderm cell-derived model of Wilson disease: a, immunocytochemical staining of definitive endoderm cells (left micrograph) for ATP7B expression: DAPI (blue) nuclear staining, ATP7B (red) staining. Human fibroblasts were used as a negative control (right micrograph). Scale bar = 50 μm; b, dose-response curve of cell viability inhibition for definitive endoderm cells treated with copper(II) chloride dihydrate. Cell viability was assessed 24 h after copper(II) chloride dihydrate treatment relative to the untreated control (without CuCl₂). Data represent mean viability values  ±  standard deviation from three biological replicates. Statistical analysis and determination of the half-maximal inhibitory concentration (IC₅₀) were performed using GraphPad Prism.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

В этом исследовании мы использовали линию ИПСК FCBRNi001-A, полученную из фибробластов кожи здорового мужчины с помощью неинтегрирующего вируса Сендай, кодирующего факторы транскрипции Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc [17]. Этот подход обеспечил геномную стабильность, подтверждённую анализом кариотипа на 12-м пассаже (нормальный кариотип 46, XY). ИПСК демонстрировали типичные маркёры плюрипотентности (SOX2, OCT4, TRA-1-60, SSEA-4) и способность к спонтанной дифференцировке во все три зародышевых листка, что согласуется с данными реестра. Использование активина А и CHIR99021 для имитации сигнальных путей Nodal и Wnt позволило эффективно дифференцировать ИПСК в дефинитивную эндодерму, при этом более 90% клеток приобретали эпителиоидную морфологию, (68,55 ± 4,91)% клеток экспрессировали SOX17 и (87,12 ± 3,98)% — FOXA2. Эти результаты подтверждают воспроизводимость протоколов дифференцировки дефинитивной эндодермы и подчёркивают полезность пациент-специфичных ИПСК для моделирования моногенных заболеваний, таких как БВК.

Обнаружение экспрессии ATP7B в клетках дефинитивной эндодермы подчёркивает раннюю роль этого транспортера меди в спецификации гепатической линии. Эксперименты с перегрузкой меди показали дозозависимую цитотоксичность (IC₅₀ = 197 мкМ), что отражает патологическое накопление меди, наблюдаемое при БВК. Эта модель преодолевает ограничения иммортализованных культур, которые лишены физиологических взаимодействий между клетками, и первичных гепатоцитов, имеющих короткий срок жизни. Однако неполная зрелость клеток дефинитивной эндодермы остаётся ограничением, поскольку они могут не полностью воспроизводить функции взрослых гепатоцитов. Будущие исследования могут включать использование 3D-систем кокультивирования для повышения зрелости и моделирования мультиклеточных ниш печени.

Этический контроль и согласие донора являются важными сильными сторонами этого исследования. Линия FCBRNi001-A соответствует международным стандартам, с анонимизированными данными донора и одобрением локального этического комитета. Хотя линия доступна для исследований, ограничения на клиническое или коммерческое использование соответствуют этическим рекомендациям.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование предлагает надёжную модель БВК на основе ИПСК линии FCBRNi001-A, которая воспроизводит ключевые аспекты дисрегуляции меди. Протокол дифференцировки приводит к получению клеток дефинитивной эндодермы, экспрессирующих ATP7B, что позволяет моделировать токсичность меди с IC₅₀ 197 мкМ. Полученные результаты демонстрируют полезность модели для высокопроизводительного скрининга препаратов и механистических исследований патогенеза БВК. Будущие направления включают оптимизацию зрелости дефинитивной эндодермы с помощью 3D-систем и редактирование генома CRISPR-Cas9 для введения пациент-специфичных мутаций гена ATP7B (например, R778L). Эта платформа может сократить разрыв между in vitro моделями и клиническими приложениями, продвигая стратегии персонализированной терапии для БВК и связанных с ней метаболических расстройств.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. М.А. Берестовой — разработка методологии, проведение исследования, формальный анализ, написание черновика, пересмотр и редактирование рукописи; В.Д. Стародубова — проведение исследования, формальный анализ, написание черновика, пересмотр и редактирование рукописи; Е.В. Карпухина — проведение исследования; А.С. Баранова — проведение исследования; А.Г. Шохина — разработка концепции, написание черновика, пересмотр и редактирование рукописи, административное руководство исследовательским проектом, получение финансирования. Все авторы одобрили рукопись (версию для публикации), а также согласились нести ответственность за все аспекты работы, гарантируя надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой её части.

Благодарности. Авторы выражают признательность врачу-неврологу, научному сотруднику Федерального центра мозга и нейротехнологий Федерального медико-биологического агентства (Москва, Россия) М.А. Солдатову за обеспечение участия донора в исследовании и научному сотруднику Федерального центра мозга и нейротехнологий Федерального медико-биологического агентства В.С. Усатовой за содействие в проведении экспериментов.

Этическая экспертиза. Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом Федерального центра мозга и нейротехнологий Федерального медико-биологического агентства (протокол № 02/14-10-24 от 14.10.2024). Участник исследования добровольно подписал форму информированного согласия до включения в исследование. Исследование не регистрировали.

Согласие на публикацию. Авторы получили письменное информированное добровольное согласие пациента на публикацию персональных данных в научном журнале «Гены и Клетки», включая его электронную версию (дата подписания 21.10.2024). Объём публикуемых данных с пациентом согласован.

Источники финансирования. Исследование проведено с использованием денежных средств гранта Российского научного фонда № 24-74-10106. Финансирующая организация не устанавливала ограничений на использование данных и распространение результатов исследования.

Раскрытие интересов. Авторы заявляют об отсутствии отношений, деятельности и интересов за последние три года, связанных с третьими лицами (коммерческими и некоммерческими), интересы которых могут быть затронуты содержанием статьи.

Оригинальность. При создании настоящей работы авторы не использовали ранее опубликованные сведения (текст, иллюстрации, данные).

Доступ к данным. Все данные, полученные в настоящем исследовании, доступны в статье.

Генеративный искусственный интеллект. При создании настоящей статьи технологии генеративного искусственного интеллекта не использовали.

Рассмотрение и рецензирование. Настоящая работа подана в журнал в инициативном порядке и рассмотрена по обычной процедуре. В рецензировании участвовали один член редакционной коллегии, один внешний рецензент и научный редактор издания.

ADDITIONAL INFORMATION

Author contributions: M.A. Berestovoy: methodology, investigation, formal analysis, writing — original draft, writing — review & editing; V.D. Starodubova: investigation, formal analysis, writing — original draft, writing — review & editing; E.V. Karpukhina: investigation; A.S. Baranova: investigation; A.G. Shokhina: conceptualization, writing — original draft, writing — review & editing, project administration, and funding supervision. All the authors approved the version of the manuscript to be published and agree to be accountable for all aspects of the work, ensuring that questions related to the accuracy or integrity of any part of the work are appropriately investigated and resolved.

Acknowledgments: The authors would like to express their gratitude to M.A. Soldatov, a neurologist and researcher at the Federal Center for Brain and Neurotechnology of the Federal Medical and Biological Agency (Moscow, Russia), for coordinating the donor’s participation in the study, and to V.S. Usatova, a researcher at the Federal Center for Brain and Neurotechnology of the Federal Medical and Biological Agency, for her assistance in the experimental phase.

Ethics approval: The study was approved by the Local Ethics Committee of the Federal Center for Brain and Neurotechnology of the Federal Medical and Biological Agency (Protocol No. 02/14-10-24, October 14, 2024). The participant voluntarily signed a written informed consent form before enrollment in the study. The study was not registered.

Consent for publication: The authors received the voluntary written informed consent from the patient to publish personal data in the scientific journal Genes & cells, including its electronic version (signed on October 21, 2024). The scope of the published data was approved by the patients.

Funding sources: The study was supported by Grant No. 24-74-10106 from the Russian Science Foundation. The funding source did not impose any restrictions on how the study results could be used or disseminated.

Disclosure of interests: The authors declare no relationships, activities, or interests over the past three years involving third parties (commercial or non-commercial) whose interests could be affected by the content of this article.

Statement of originality: No previously published material (text, images, or data) was used in this work.

Data availability statement: All data generated or analyzed during this study are included in this article.

Generative AI: No generative artificial intelligence technologies were used in the preparation of this article.

Provenance and peer review: This paper was submitted unsolicited and reviewed following the standard procedure. The peer review process involved one external reviewer, one member of the editorial board, and an in-house scientific editor.

Sobre autores

Mikhail Berestovoy

Federal Center of Brain Research and Neurotechnologies; Russian National Research Medical University named after N.I. Pirogov

Email: m.berestovoy1181@gmail.com
ORCID ID: 0000-0002-0462-2603
Código SPIN: 4348-8610

Cand. Sci. (Biology)

Rússia, Moscow; Moscow

Varvara Starodubova

Russian National Research Medical University named after N.I. Pirogov

Email: starodubova.varya@gmail.com
ORCID ID: 0009-0008-0793-8022

Cand. Sci. (Biology)

Rússia, Moscow

Elizaveta Karpukhina

First Sechenov Moscow State Medical University

Email: lizabetta200240@gmail.com
ORCID ID: 0009-0005-5669-531X
Rússia, Moscow

Arina Baranova

Russian National Research Medical University named after N.I. Pirogov

Email: ari.baranova@bk.ru
ORCID ID: 0009-0009-8355-5696
Rússia, Moscow

Arina Shokhina

Federal Center of Brain Research and Neurotechnologies; Russian National Research Medical University named after N.I. Pirogov

Autor responsável pela correspondência
Email: a.g.shokhina@yandex.ru
ORCID ID: 0000-0002-1769-4526
Código SPIN: 5873-7308

Cand. Sci. (Biology)

Rússia, Moscow; Moscow

Bibliografia

Arquivos suplementares