Enhancement of regenerative properties of multipotent mesenchymal stromal cells through modulation of autophagy in a model of acute radiation syndrome

全文:

ВВЕДЕНИЕ

Современная медицина сталкивается с проблемой эффективного восстановления повреждённых тканей и органов, что обусловливает необходимость развития новых терапевтических стратегий. Клеточная терапия представляет собой один из перспективных подходов для решения данной проблемы, обеспечивая возможность усиления регенерации тканей после действия повреждающего фактора. В особенности это характерно для быстрообновляющихся тканей, таких как миелоидная ткань [1].

Среди различных видов клеток, которые используются в регенеративной медицине [2], мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) занимают особое место благодаря своим уникальным биологическим свойствам. ММСК представляют собой особую группу стволовых клеток, локализующихся в различных органах и тканях организма, включая костный мозг, жировую ткань, пуповинную кровь, плаценту и др. Характерной особенностью ММСК является способность к самообновлению и дифференцировке в различные клетки мезенхимального происхождения, такие как адипоциты, хондроциты, остеоциты. По своему потенциалу к дифференцировке ММСК являются мультипотентными, и это обусловливает их широкое применение в различных областях медицины [3]. ММСК участвуют в создании специфического микроокружения, или «ниши», способствующей росту и дифференцировке других клеток, в том числе и гемопоэтических стволовых клеток [4]. Важно отметить, что ММСК обладают и иммуномодулирующими свойствами. Они способны взаимодействовать с различными клетками иммунной системы, включая Т-лимфоциты, В-лимфоциты, дендритные клетки и макрофаги. ММСК способны подавлять воспалительные реакции, снижать активность аутоиммунных процессов. Уникальные биологические свойства делают их перспективными для применения в лечении воспалительных процессов, аутоиммунных заболеваний, иммунологических конфликтов, в том числе при аллогенной трансплантации костного мозга [5, 6].

Секреторная активность ММСК — один из ключевых факторов их терапевтического потенциала. Они синтезируют и выделяют большое количество биологически активных веществ, играющих важную роль в регенерации тканей. К этим веществам относятся различные факторы роста, в том числе и гемопоэтические: G-CSF (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, granulocyte colony-stimulating factor) и GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), SCF (фактор роста стволовых клеток, stem cell factor), FLT3 ligand (лиганд fms-подобной тирозинкиназы 3, Fms-related tyrosine kinase 3 ligand), а также компоненты внеклеточного матрикса, такие как коллаген, эластин, фибронектин и ламинин [7, 8]. Данные молекулы стимулируют ангиогенез, пролиферацию, миграцию клеток, а также ремоделирование тканей.

Отмечены и ограничения, присущие терапии, основанной на использовании ММСК. Долговременное культивирование ММСК, как показано в некоторых исследованиях, приводит к уменьшению выработки ими трофических факторов, таких как VEGF (фактор роста эндотелия сосудов, vascular endothelial growth factor) и TGF-β2 (трансформирующий фактор роста бета 2, transforming growth factor-beta 2) [9]. В работе C. Hu и соавт. отмечено, что культивирование клеток сопровождается увеличением содержания факторов, замедляющих ангиогенез, к которым относится тромбоспондин-1 и ингибитор активатора плазминогена [10].

Другой проблемой при использовании ММСК является низкая приживляемость трансплантируемых клеток в повреждённом органе [11]. Данный эффект связан с реакцией воспаления и развитием аноиксиса [9]. Несмотря на существенные успехи и большой потенциал использования ММСК, перед их широким применением в клинике необходимо решить ряд задач, включая оптимизацию получения, культивирования и трансплантации клеток для повышения их приживляемости и функциональной активности.

Одним из способов, который может повысить уровень функциональной активности ММСК, является изменение активности аутофагии в этих клетках.

Аутофагия — это высококонсервативный процесс, направленный на переработку повреждённых белков и органелл внутри клетки [12, 13]. Эволюционная роль аутофагии заключается в адаптации клетки к изменяющимся метаболическим потребностям, особенно проявляющимся в условиях дефицита питательных веществ и кислорода [14]. Данная роль реализуется как за счёт утилизации повреждённых органелл, так и за счёт выработки факторов роста и образования новых белков с формированием третичной структуры «фолдинг» [15]. Модулирование аутофагии в клетках гемопоэзиндуцирующего микроокружения может сопровождаться изменением активности гемопоэза. Этот эффект достигается благодаря изменению способности клеток к выработке факторов, стимулирующих гемопоэз. Примерами таких гемопоэтических факторов роста являются SCF, FLT3 ligand и G-CSF, обеспечивающие пролиферацию и дифференцировку гемопоэтических стволовых клеток [16].

Однако накапливающиеся научные данные о роли аутофагии противоречивы. В ряде работ отмечена стимуляция функции клеток в результате активации в них аутофагии при воздействии стрессовых факторов. Например, в работе J. Jakovljevic и соавт. активация аутофагии уменьшает уровень апоптоза и повышает выживаемость ММСК [17]. В то же время имеются данные, свидетельствующие об аналогичном результате при ингибировании аутофагии. В экспериментах S. Molaei и соавт. отмечается, что в условиях гипоксии или окислительного стресса индукция аутофагии приводит к гибели клеток [18]. Аналогичные результаты получены и в других исследованиях, где активация аутофагии ассоциировалась со снижением жизнеспособности клеток, вплоть до их гибели [19].

Противоречивость имеющихся данных относительно роли аутофагии подчёркивает сложность и неоднозначность механизмов её влияния на функционирование клетки, а также необходимость дальнейших исследований с учётом возможных отличий результатов между экспериментами in vitro и in vivo.

В данном исследовании для угнетения гемопоэза была выбрана модель острой лучевой болезни, которая широко используется для изучения патогенеза радиационного поражения на клеточном и системном уровнях, а также для поиска биомаркёров и тестирования новых терапевтических подходов. К преимуществам этой модели относятся возможность точного контроля дозы облучения, детального изучения поражения различных органов и систем, а также высокая воспроизводимость результатов. Вместе с тем существуют определённые ограничения: межвидовые различия в радиочувствительности затрудняют прямую экстраполяцию полученных данных на человека. Кроме того, такие модели не всегда позволяют учитывать влияние сопутствующих факторов, присущих реальным радиационным авариям [20, 21].

ЦЕЛЬ

Изучить влияние модуляции аутофагии в ММСК на их функциональную активность и способность стимулировать регенерацию миелоидной ткани на модели острой лучевой болезни.

МЕТОДЫ

Получение и культивирование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток

С целью получения клеточной культуры плацентарных ММСК было использовано 6 беременных мышей-самок линии ICR (CD1) возрастом 10–12 нед в 18-дневном сроке гестации. ММСК выделяли из хориона плаценты лабораторных мышей. Хориальную часть плаценты механически отделяли скальпелем с трёхкратным промыванием раствором D-PBS (Dulbecco’s phosphate buffered saline, фосфатно-солевой буфер) (STEMCELL Technologies, Канада) c добавлением 2 ммоль L-глутамина (STEMCELL Technologies, Канада), 50 ед./мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (STEMCELL Technologies, Канада). В дальнейшем проводили механическое измельчение ткани плаценты и последующую ферментативную обработку раствором аккутазы (Millipore, США). Для инактивации раствора аккутазы к полученной суспензии клеток добавляли среду для культивирования MesenCult Expansion Kit Mouse (STEMCELL Technologies, Канада) с 10% FBS (fetal bovine serum, фетальная бычья сыворотка) и последующим центрифугированием в течение 10 мин.

Процесс культивирования клеток осуществлялся в условиях CO₂-инкубатора при температуре 37 °C, с содержанием CO₂ 5% и влажностью 90%. Среду для культивирования MesenCult Expansion Kit Mouse использовали в качестве культуральной. Дополнительно в среду было добавлено 2 ммоль L-глутамина (STEMCELL Technologies, Канада), 50 ед./мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (STEMCELL Technologies, Канада) [22]. Замену питательной среды осуществляли в первый раз через 24 ч. В дальнейшем смену среды производили каждые 72 ч. При достижении плотности монослоя клеток в 80% выполняли пересев с использованием 0,25% раствора трипсин-EDTA (STEMCELL Technologies, Канада). Для эксперимента брали клетки третьего пассажа.

Характеристика мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток

Методом проточной цитометрии в суспензии трансплантируемых клеток оценивали содержание клеток, позитивных по CD105 (эндоглин), CD29 (интегрин β1), белку Sca-1 и негативных по CD45, с помощью набора Mouse MesenchymalStem Cell Multi-Color FlowCytometry Kit (R&D Systems, США) и в соответствии с протоколом производителя на цитометре FACSCalibur (BD Bioscienses, США). Дифференцировку ММСК в остеогенном и адипоцитарном направлении производили в 24-луночном культуральном планшете с помощью набора Mouse Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit (R&D Systems, США) в соответствии с протоколом производителя [23]. ММСК были посеяны в концентрации 7,4 × 10³ и 3,7 × 10⁵ клеток на лунку соответственно 24-луночного планшета с добавлением Osteogenic Supplement и Adipogenic Supplement (R&D Systems, США). При достижении 70 и 100% конфлюэнтности монослоя культуральная среда заменялась эквивалентным объёмом среды для индуцирования остеогенной или адипоцитарной дифференцировки (Osteogenic Differentiation Media или Adipogenic Differentiation Media; R&D Systems, США). Обновление среды для дифференцировки производилось каждые 3 дня. В дальнейшем оценивали полученные клетки через 21 и 14 дней соответственно по экспрессии белка остеопонтина и белка, связывающего жирные кислоты. Для идентификации ММСК методом проточной цитометрии после остеогенной и адипоцитарной дифференцировки были использованы антитела: первичное антитело Rabbit Anti-Mouse OPN-R monoclonal antibody, clone 35I6M4 (Creative Diagnostics, США) и Rabbit Anti-Mouse FABP4 monoclonal antibody, clone 3I4M3 (Creative Diagnostics, США), вторичное антитело Anti-Rabbit IgG polyclonal antibody (Creative Diagnostics, США) — согласно инструкции производителя.

Модуляция аутофагии

Модуляцию аутофагии проводили путём культивирования ММСК, высеянных во флаконы 25 см² (STEMCELL Technologies, Канада) в концентрации 2,5 × 10⁶ клеток на флакон со средой MesenCult™ Expansion Medium (STEMCELL Technologies, Канада) в течение 24 ч с активатором аутофагии сиролимусом¹ в дозе 3 мкмоль/л (Abcam, Великобритания) и ингибитором аутофагии 3-метиладенином (3-МА) в дозе 10 мкмоль/л (Abcam, Великобритания). В дальнейшем среда была заменена после промывания D-PBS трёхкратно [24].

Оценка жизнеспособности мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток

Для оценки жизнеспособности ММСК высевали в 96-луночные планшеты (Corning® 96-Well High-Binding Flat-Bottom Microplate; STEMCELL Technologies, Канада) в количестве 3000 кл./лунку. Клетки культивировали при 37 °C в течение 24, 48, 72, 96 ч с каждым из модуляторов аутофагии (сиролимус, 3-МА), а также без добавления модулятора. При завершении культивирования производили замену среды с добавлением в лунку 10 мкл соли тетразолия (набор для подсчёта клеток Cell Counting Kit-8 (CCK-8); Servicebio, Китай) и последующей инкубацией при температуре 37 °C в течение 1 ч. После этого оптическую плотность поглощения измеряли при длине волны 450 нм с помощью иммуноферментного анализатора Multiscan FC (Thermo Fisher Scientific, США).

Жизнеспособность клеток определяли по формуле:

$\frac{ОП\left(тест\right)-ОП\left(бланк\right)}{ОП\left(контроль\right)-ОП\left(бланк\right)}\times 100$,

где ОП (тест) — оптическая плотность в лунках: ММСК «+», ССК-8 «+», модулятор аутофагии «+»; ОП (контроль) — оптическая плотность в лунках: ММСК «+», ССК-8 «+», модулятор аутофагии «−»; ОП (бланк) — оптическая плотность в лунках: ММСК«−», ССК-8 «+», модулятор аутофагии «−».

Оценка концентрации белков аутофагии

В течение 20 мин ММСК инкубировали как без добавления, так и с добавлением модуляторов аутофагии, затем проводили центрифугирование при 1500 × g в течение 10 мин. В дальнейшем для приготовления лизата ММСК использовали лизис-буфер (Cloud-Clone, КНР) согласно инструкции производителя. Для оценки активности аутофагии определяли концентрацию белков Beclin-1 и MAP1LC3B (белок, ассоциированный с микротрубочками, лёгкая цепь 1 3B, далее именуемый LC3B). Определение концентрации LC3B было проведено в надосадочной жидкости с использованием набора MAP1LC3b (Cloud-Clone, США), для белка Beclin-1 использовали набор BECN1 (Cloud-Clone, США) согласно инструкции производителя.

Гемопоэтические факторы роста

На следующем этапе ММСК были высеяны в 6-луночные планшеты в концентрации 2,5 × 10⁵ кл./лунку [25]. Проводили культивирование ММСК в 2,5 мл раствора MesenCult™ Expansion Medium в течение 24 ч с последующим центрифугированием 2000 × g в течение 10 мин. Полученный супернатант использовали для анализа концентрации SCF, FLT3 ligand, G-CSF. Исследования проведены на иммуноферментном анализаторе Chem Well 2910 (Combi, США) с использованием наборов производства Abcam (Великобритания): Mouse FLT3 ligand ELISA Kit, Mouse G-CSF ELISA Kit, Mouse SCF ELISA Kit — согласно протоколу производителя.

Исследования in vivo

Экспериментальная часть исследования была проведена на 50 аутбредных мышах-самцах линии ICR (CD1) массой 22–24 г. Протокол экспериментов составлен в соответствии с Межгосударственным стандартом «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными» (ГОСТ 33215 — 2014) и одобрен локальным этическим комитетом Уральского государственного медицинского университета (протокол № 7 от 27 октября 2023 г.). Животных содержали в условиях стандартного вивария (световой день продолжительностью 12 ч, температура 21–22 °С, со свободным доступом к воде и еде).

Распределение животных было проведено с помощью блочной рандомизации на пять групп: 1-я — интактные животные (n = 10); 2-я — контрольная, в которой не проводилась трансплантация клеток (n = 10); 3-я — сравнения, с трансплантацией ММСК (n = 10); 4-я — трансплантация ММСК с активированной в них аутофагией (n = 10); 5-я — трансплантация ММСК, в которых аутофагия была ингибирована (n = 10). Животные 2–5-й групп были облучены с помощью гамма-терапевтической установки «Агат-С» (Россия) с Со-60 радионуклидным источником, в общей дозе 5,0 Гр и мощностью 0,6 Гр в минуту. Таким образом у животных 2–5-й групп стимулировали развитие острой лучевой болезни [26]. Для трансплантации использовали полученные по описанному ранее протоколу плацентарные ММСК третьего пассажа. Лабораторным животным через 1 час после воздействия ионизирующего излучения внутривенно в латеральную хвостовую вену были трансплантированы ММСК в количестве 1 × 10⁶ кл./мышь [27, 28].

Выведение лабораторных животных из эксперимента осуществляли на 7-е сутки после облучения. Для получения образцов крови выполняли анестезию внутримышечным введением тилетамина¹ и золазепама¹ (Virbac, Италия) в дозе 12,5 мг/кг и ксилазина¹ (Bioveta, Чехия) в дозе 7,5 мг/кг [29]. После взятия анализов лабораторным животным, находящимся под наркозом, осуществляли цервикальную дислокацию. Забор крови для общего анализа выполняли путём пункции сердца лабораторного животного. Подсчёт форменных элементов крови производили на гематологическом анализаторе MEK-6400 (Nihon Kohden, Япония).

С целью извлечения внеклеточной фракции из костного мозга выполняли процедуру выделения бедренной кости с последующим отсечением эпифизов. Далее проводили вымывание костного мозга с использованием 0,5 мл D-PBS (STEMCELL Technologies, Канада). Полученная суспензия была пипетирована для достижения однородной консистенции и центрифугирована при 3000 × g в течение 15 мин [30]. Для морфологического исследования костного мозга были подготовлены цитологические препараты. Фиксацию мазков осуществляли с использованием красителя-фиксатора «эозин метиленовый синий» («ЭКОлаб», Россия) в течение 2 мин, после чего мазки окрашивали красителем по Романовскому также в течение 2 мин. Подсчёт миелограммы проводили на 1000 клеток. Для определения количества миелокариоцитов осуществляли забор костного мозга из второй бедренной кости аналогичным способом. Подсчёт миелокариоцитов выполняли в камере Горяева.

Статистический анализ

Формирование базы данных осуществлялось с помощью пакета программ Excel (Microsoft Office 2013). Статистический анализ проводили с использованием программы SPSS Statistics 27 (IBM, США). Оценивали нормальность распределения с использованием W-критерия Шапиро–Уилка. Анализ параметрических групп выполнен с использованием t-критерия Стьюдента с представлением результата в виде среднего арифметического (M) ± стандартное отклонение (SD), непараметрических групп — с использованием U-критерия Манна–Уитни с предоставлением результата в виде медианы (Me) и значений нижнего и верхнего квартилей [Q25; Q75]. Использовали поправку Бонферрони при множественном сравнении. Отличия считались статистически значимыми при p < 0,05. Графическое представление результатов работы было проведено в программе Prism v. 10.3.0 (507) (GraphPad, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Идентификация мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток

В проведённом исследовании установлено, что полученные ММСК экспрессируют CD105 (эндоглин), CD29 (интегрин β1), белок Sca-1 и негативны по CD45 на 98,6%. Установлена также способность ММСК дифференцироваться в адипоцитарном и остеогенном направлениях. Проведённые исследования позволили установить, что полученная культура по поверхностным кластерам дифференцировки и по дифференцировочному потенциалу соответствует ММСК. Рисунки предоставлены в приложении 1 и приложении 2.

Оценка жизнеспособности мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток

При оценке жизнеспособности ММСК после культивирования с активатором и ингибитором аутофагии в течение 24, 48, 72, 96 ч отмечен высокий уровень жизнеспособных клеток — более 96% во всех наблюдениях. Статистически значимых изменений между исследуемыми группами не получено (рис. 1).

 

Рис. 1. Оценка жизнеспособности мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) после культивирования с активатором и ингибитором аутофагии в течение 24, 48, 72, 96 ч. Контроль — ММСК, культивированные без добавления модулятора аутофагии; сиролимус — ММСК, культивированные с активатором аутофагии сиролимусом в концентрации 3 мкмоль/л; 3-МА — ММСК, культивированные с ингибитором аутофагии 3-метиладенином в концентрации 10 мкмоль/л.

Fig. 1. Viability assessment of multipotent mesenchymal stromal cells (MMSCs) after 24, 48, 72, and 96 hours of culture with autophagy activator or inhibitor. Control, MMSCs cultured without autophagy modulators; Sirolimus, MMSCs cultured with autophagy activator sirolimus (3 µmol/L); 3-MA, MMSCs cultured with autophagy inhibitor 3-methyladenine (10 µmol/L).

 

Оценка активности аутофагии

При культивировании ММСК в течение 24 ч с модуляторами аутофагии установлено изменение экспрессии белков Beclin-1 и LC3B, которые являются ключевыми маркёрами данного процесса.

Добавление к культуре клеток сиролимуса, являющегося индуктором аутофагии, привело к увеличению концентрации LC3B и белка Beclin-1 в 3,2 и 3,6 раза соответственно относительно 3-й группы (сравнения). Культивирование ММСК в присутствии 3-МА приводило к снижению концентрации LC3B на 58,8% (р < 0,001) и Beclin-1 на 63,3% (р < 0,001) (рис. 2).

 

Рис. 2. Концентрация белков аутофагии при культивировании мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) в течение 24 ч с модуляторами аутофагии: сиролимусом и 3-метиладенином: a — определение концентрации LC3B в надосадочной жидкости с использованием набора MAP1LC3b (Cloud-Clone, США); b — определение концентрации Beclin-1 в надосадочной жидкости с использованием набора BECN1 (Cloud-Clone, США); *** различия статистически значимы при р < 0,001. Группа сравнения — с трансплантацией ММСК; Сиролимус — ММСК, культивированные с активатором аутофагии сиролимусом в концентрации 3 мкмоль/л; 3-МА — ММСК, культивированные с ингибитором аутофагии 3-метиладенином в концентрации 10 мкмоль/л.

Fig. 2. Autophagy protein concentrations during 24-hour culture of multipotent mesenchymal stromal cells (MMSCs) with autophagy modulators sirolimus and 3-methyladenine: a, LC3B concentration measurement in supernatant using MAP1LC3b kit (Cloud-Clone, USA); b, Beclin-1 concentration measurement in supernatant using BECN1 kit (Cloud-Clone, USA); ***, statistically significant differences at p < 0.001. Comparison group, MMSCs transplantation; Sirolimus, MMSCs cultured with autophagy activator sirolimus (3 µmol/L); 3-MA, MMSCs cultured with autophagy inhibitor 3-methyladenine (10 µmol/L).

 

Оценка концентрации факторов роста

При активации аутофагии в ММСК отмечается повышение выработки ими гемопоэтических факторов роста: SCF +70,5% (р < 0,0001), G-CSF +59,6% (р < 0,0001), FLT3 ligand +62,3% (р < 0,0001). Применение ингибитора аутофагии в культуре клеток отражается в статистически значимом снижении выработки факторов роста в питательных средах: SCF −43,6% (р < 0,0001), G-CSF −22,4% (р < 0,0001), FLT3 −33,5% (р < 0,0001) соответственно (рис. 3).

 

Рис. 3. Содержание факторов роста при культивировании мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) в течение 24 ч с модуляторами аутофагии сиролимусом и 3-метиладенином: a — измерение концентрации фактора стволовых клеток (SCF) методом иммуноферментного анализа с помощью набора Mouse SCF ELISA Kit (Abcam, Великобритания); b — измерение концентрации колониестимулирующего фактора (G-CSF) методом иммуноферментного анализа с помощью набора Mouse G-CSF ELISA Kit (Abcam, Великобритания); c — измерение концентрации лиганд fms-подобной тирозинкиназы 3 (FLT3 ligand) методом иммунноферментного анализа с помощью набора Mouse FLT3 ligand ELISA Kit (Abcam, Великобритания); **** различия статистически значимы при р < 0,0001. Группа сравнения — с трансплантацией ММСК; Сиролимус — ММСК, культивированные с активатором аутофагии сиролимусом в концентрации 3 мкмоль/л; 3-МА — ММСК, культивированные с ингибитором аутофагии 3-метиладенином в концентрации 10 мкмоль/л.

Fig. 3. Content of growth factors during 24-hour culture of multipotent mesenchymal stromal cells (MMSCs) with autophagy modulators sirolimus and 3-methyladenine: a, measurement of stem cell factor (SCF) concentrations by enzyme-linked immunosorbent assay using Mouse SCF ELISA Kit (Abcam, UK); b, measurement of granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) concentrations by enzyme-linked immunosorbent assay using Mouse G-CSF ELISA Kit (Abcam, UK); c, measurement of Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (FLT3 ligand) concentrations by enzyme-linked immunosorbent assay using Mouse FLT3 ligand ELISA Kit (Abcam, UK); ****, statistically significant differences at p < 0.0001. Comparison group, MMSCs transplantation; Sirolimus, MMSCs cultured with autophagy activator sirolimus (3 µmol/L); 3-MA, MMSCs cultured with autophagy inhibitor 3-methyladenine (10 µmol/L).

 

Оценка клеточного состава костного мозга

На 7-е сутки эксперимента в костном мозге лабораторных животных отмечается угнетение всех ростков кроветворения. Наблюдаемые изменения характерны для выбранной дозы облучения и длительности наблюдения на модели острой лучевой болезни (рис. 4) [31, 32]. Установлено снижение количества миелокариоцитов на 55,4% (p < 0,0001), клеток моноцитарного ряда на 37,6% (p < 0,0001), мегакариоцитарного — на 65,4% (p < 0,0001), эритроидного — на 59,3% (p < 0,0001), нейтрофильного — на 52,4% (р < 0,0001) с преимущественным снижением в лимфоидном ростке на 64,7% (p < 0,0001).

 

Рис. 4. Клеточный состав костного мозга лабораторных животных на 7-е сутки острой лучевой болезни: a — количество миелокариоцитов — общая популяция незрелых миелоидных предшественников, включая миелобласты, промиелоциты и миелоциты; b — количество клеток нейтрофильного ряда — метамиелоцитов, палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов; c — количество клеток лимфоидного ряда — лимфоцитов, включая В- и Т-клеточных предшественников; d — количество клеток моноцитарного ряда — моноцитов и их предшественников (промоноцитов); e — количество клеток эритроидного ряда — нормобластов на разных стадиях созревания (базофильных, полихроматофильных, оксифильных); f — количество клеток мегакариоцитарного ряда — мегакариоцитов; ** различия статистически значимы при р ≤ 0,01; *** при р ≤ 0,001; **** при р ≤ 0,0001; ns — нет статистически значимых различий. Интактные — группа лабораторных животных, не подвергшихся ионизирующему излучению; Контроль — не проводилась трансплантация клеток; Группа сравнения — с трансплантацией мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) без модулирования в них аутофагии; Сиролимус — проведена трансплантация ММСК с активированной в них аутофагией сиролимусом; 3-МА — проведена трансплантация ММСК с ингибированной в них аутофагией 3-метиладенином.

Fig. 4. Bone marrow cellular composition in laboratory animals on day 7 of acute radiation syndrome: a, myelokaryocyte count (total population of immature myeloid precursors including myeloblasts, promyelocytes, and myelocytes); b, neutrophil lineage cell count (metamyelocytes, band neutrophils, and segmented neutrophils); c, lymphoid lineage cell count (lymphocytes including B- and T-cell precursors); d, monocytic lineage cell count (monocytes and their precursors/promonocytes); e, erythroid lineage cell count (normoblasts at various maturation stages, including basophilic, polychromatophilic, and oxyphilic normoblasts); f, megakaryocytic lineage cell count (megakaryocytes); **, statistically significant differences at p ≤ 0.01; ***, at p ≤ 0.001; ****, at p ≤ 0.0001; ns, no statistically significant differences. Intact, animals not exposed to ionizing radiation; Control, no cell transplantation; Comparison group, transplantation of MMSCs without autophagy modulation; Sirolimus, transplantation of MMSCs with sirolimus-activated autophagy; 3-MA, transplantation of MMSCs with 3-methyladenine-inhibited autophagy.

 

В группе животных с трансплантированными ММСК без модулирования в них аутофагии (3-я группа, сравнения) наблюдалось увеличение клеточности костного мозга по сравнению со 2-й группой (контроля). В частности, количество миелокариоцитов увеличилось на 14,7% (p < 0,0001), клеток нейтрофильного ряда — на 18,1% (p < 0,0001), лимфоидного ряда — на 26,1% (p = 0,0002). При этом изменения в моноцитарном, эритроидном и мегакариоцитарном ростках были статистически незначимыми.

Введение ММСК с предварительно активированной в них аутофагией с использованием сиролимуса (4-я группа) обеспечивало ещё более выраженное восстановление клеточного состава костного мозга по отношению к группе сравнения. Отмечено дополнительное увеличение количества миелоцитов +8,3% (р = 0,0003), клеток лимфоидного ряда +18,8% (р < 0,0001), нейтрофильного ряда +4,5% (р = 0 026), мегакариоцитарного ряда +30,5% (р = 0 011). В то же время не отмечено значимого влияния ММСК с индуцированной в них аутофагией сиролимусом на активность моноцитарного и эритроидного ростков. Однако при сравнении со 2-й группой (контроль) отмечается статистически значимое повышение клеточности в эритроидном ряду на 10,1% (р = 0,019).

Введении ММСК с ингибированной в них аутофагией не приводило к статистически значимым изменениям клеточного состава костного мозга по сравнению с контрольной группой. В то же время отмечено, что трансплантация прекондиционированых ММСК с 3-MA приводит к статистически значимому снижению активности гранулоцитарного и лимфоцитарного ростков при сравнении с группой ММСК без модификации аутофагии (3-я группа) и группой ММСК с активированной аутофагией (4-я группа).

Оценка содержания форменных элементов крови

Анализ крови на 7-е сутки после воздействия ионизирующего излучения во многом отражает наблюдаемые изменения в показателях миелограмм. Лучевое повреждение сопровождалось снижением содержания эритроцитов на 38,4% (p < 0,0001), тромбоцитов на 57,0% (p < 0,0001) и лейкоцитов на 87,0% (p < 0,0001). Общее содержание лейкоцитов было снижено за счёт уменьшения нейтрофилов на 84,8% (p < 0,0001), лимфоцитов на 93,8% (p < 0,0001), моноцитов на 43,6% (р < 0,0001) соответственно (рис. 5).

 

Рис. 5. Содержание форменных элементов крови лабораторных животных на 7-е сутки острой лучевой болезни: a — общее количество клеток лейкоцитов; b — количество клеток нейтрофилов; c — количество клеток лимфоцитов; d — количество эритроцитов; e — количество тромбоцитов; f — количество клеток моноцитов; * различия статистически значимы при р ≤ 0,05; *** различия статистически значимы при р ≤ 0,001; **** различия статистически значимы при р < 0,0001; ns — нет статистически значимых различий. Интактные — группа лабораторных животных, не подвергшихся ионизирующему излучению; Контроль — не проводилась трансплантация клеток; Группа сравнения — с трансплантацией мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) без модулирования в них аутофагии; Сиролимус — проведена трансплантация ММСК с активированной в них аутофагией сиролимусом; 3-МА — проведена трансплантация ММСК с ингибированной в них аутофагией 3-метиладенином.

Fig. 5. Blood cell counts in laboratory animals on day 7 of acute radiation syndrome: a, total leukocyte count; b, neutrophil count; c, lymphocyte count; d, erythrocyte count; e, platelet count; f, monocyte count; *, statistically significant differences at p ≤ 0.05; ***, at p ≤ 0.001; ****, at p < 0.0001; ns, no statistically significant differences. Intact, animals not exposed to ionizing radiation; Control, no cell transplantation; Comparison group, transplantation of MMSCs without autophagy modulation; Sirolimus, transplantation of MMSCs with sirolimus-activated autophagy; 3-MA, transplantation of MMSCs with 3-methyladenine-inhibited autophagy.

 

Отмечен терапевтический эффект при использовании ММСК, проявляющийся в виде повышения содержания лейкоцитов на 31,8% (р = 0,001), нейтрофилов на 42,1% (р = 0,0004), лимфоцитов на 67,2% (р = 0,0002) по сравнению со 2-й (контрольной) группой.

Активация аутофагии в ММСК с помощью сиролимуса усиливала их положительное влияние на восстановление клеточного состава крови после трансплантации. В 4-й группе отмечалось более выраженное повышение содержания лейкоцитов на 35,3% (р = 0,0003), лимфоцитов на 60,5% (р = 0,001), нейтрофилов на 25,0% (р = 0,028) и тромбоцитов на 12,2% (р = 0,0002) по сравнению с 3-й группой ММСК без активации аутофагии.

Введение ММСК с ингибированной аутофагией не вызвало значимых изменений в содержании форменных элементов крови по сравнению со 2-й группой (контроля), что согласуется с результатами анализа клеточного состава костного мозга. Более того, по сравнению с 3-й группой ММСК без модуляции аутофагии отмечалось статистически значимое снижение количества лимфоцитов — на 33,8% (р = 0,0004) и нейтрофилов — на 17,7 (р = 0,013).

ОБСУЖДЕНИЕ

В рамках настоящего исследования проведена комплексная оценка влияния модуляции аутофагии на функциональные свойства ММСК в условиях как in vitro, так и in vivo. Ранее авторским коллективом проводились исследования по применению ММСК для повышения регенераторного потенциала на различных моделях, но без изменения функциональной активности самих стволовых клеток [33, 34]. В данной работе мы впервые демонстрируем изменение функциональной активности ММСК путём модулирования уровня аутофагии в них после воздействия ионизирующего излучения. Аутофагия, являясь важнейшим внутриклеточным механизмом поддержания гомеостаза и удаления повреждённых компонентов клетки через образование аутофагосом и фаголизосом, рассматривалась как потенциальная мишень для повышения терапевтической эффективности ММСК [35].

В экспериментах in vitro показано, что модуляция аутофагии с помощью сиролимуса (индуктора) и 3-МА (ингибитора) приводит к статистически значимым изменениям ключевых белков аутофагии (Beclin-1 и LC3B), что подтверждает эффективность выбранных подходов для управления данным процессом в ММСК [36]. Beclin-1 — центральный регулятор инициации аутофагии. Он входит в состав PI3K-комплекса класса III, который отвечает за формирование фосфатидилинозитол-3-фосфата — молекулы, необходимой для начала образования аутофагосом. Концентрация Beclin-1 отражает активность ранних стадий аутофагии и позволяет оценить её индукцию. LC3B — это маркёр аутофагосом и один из ключевых белков, участвующих в расширении и завершении формирования мембраны аутофагосом. Концентрация LC3B коррелирует с числом аутофагосом и служит прямым показателем интенсивности процесса. Полученные данные согласуются с результатами исследования L. Gao с соавт., где также показано изменение уровня аутофагии в ММСК при использовании указанных веществ в контексте иммуносупрессивной активности ММСК [24].

На следующем этапе оценивали жизнеспособность ММСК после модуляции аутофагии. Существует мнение, что базальная активность аутофагии может ограничивать пролиферативную активность некоторых типов клеток, однако её влияние на жизнеспособность ММСК остаётся недостаточно изученным [37]. Статистически значимые различия в жизнеспособности ММСК, предварительно культивированных с модуляторами аутофагии и без предварительной культивации, не были зафиксированы в ходе эксперимента. Это свидетельствует о безопасности применяемых концентраций модуляторов для ММСК и согласуется с данными других исследователей [20].

Особое значение имеют результаты анализа секреторной активности ММСК. Активация аутофагии сопровождалась увеличением продукции основных гемопоэтических факторов роста (G-CSF, SCF и FLT3 ligand), тогда как ингибирование аутофагии, напротив, вызывало снижение их секреции. Это позволяет сделать вывод о том, что именно функциональная активность, а не жизнеспособность ММСК, определяет их терапевтический эффект при трансплантации в условиях радиационного повреждения.

В эксперименте in vivo показано, что трансплантация ММСК способствует восстановлению клеточного состава костного мозга и периферической крови, прежде всего за счёт лимфоцитарного и гранулоцитарного ростков кроветворения, однако не было замечено значимых изменений показателей в отношении эритроидного и мегакариоцитарного дифферонов.

Наиболее выраженный регенераторный эффект наблюдался при использовании ММСК с активированной аутофагией: отмечено увеличение клеточности по всем основным росткам гемопоэза, включая эритроидный и мегакариоцитарный.

Следует отметить, что повышение клеточности костного мозга и количества форменных элементов крови в группах с трансплантацией ММСК, особенно с активированной аутофагией, может быть обусловлено не только стимуляцией гемопоэза, но и снижением пострадиационной гибели клеток. Повышенная устойчивость стромальных и гемопоэтических клеток к действию ионизирующего излучения вследствие активации аутофагии может способствовать сохранению пулов жизнеспособных клеток, тем самым увеличивая общий объём клеточного состава. Эта возможность требует дальнейшей экспериментальной проверки, включая оценку маркёров апоптоза и некроза, а также исследования динамики клеточной пролиферации и выживаемости в условиях радиационного повреждения.

Кроме того, усиление регенераторного эффекта может быть также связано с оптимизацией белоксинтетической функции ММСК, обусловленной улучшением внутриклеточного гомеостаза и удалением повреждённых органелл. Повышение продукции гемопоэтических факторов роста ММСК с помощью активированной в них аутофагии также свидетельствует о важной роли этих молекул в стимуляции пролиферации и дифференцировки гемопоэтических клеток [38].

Процесс активации гемопоэза в эритроидном и мегакарицитарном дифферонах также связан с особенностями рецепторного аппарата гемопоэтических клеток-предшественников. В частности, известно, что мегакариоцит-эритроидные прогениторные клетки характеризуются низким уровнем экспрессии рецепторов к SCF. Это объясняет, почему трансплантация ММСК без активации аутофагии не приводит к выраженной стимуляции мегакариоцитопоэза и эритропоэза: выработка необходимых факторов роста в данном случае оказывается недостаточной для эффективной активации этих ростков кроветворения.

В то же время активация аутофагии в ММСК сопровождается значительным увеличением продукции гемопоэтических факторов роста, включая G-CSF, SCF и FLT3 ligand. Это, вероятно, обеспечивает дополнительную стимуляцию мегакариоцитарного и эритроидного дифферонов, что проявляется в более выраженном восстановлении соответствующих клеточных популяций после трансплантации таких ММСК. Таким образом, можно предположить, что повышение секреции гемопоэтических факторов роста при активации аутофагии позволяет преодолеть ограничения, связанные с низкой чувствительностью клеток-предшественников к отдельным цитокинам [39].

С другой стороны, ингибирование аутофагии значительно снижает терапевтический потенциал ММСК. Во-первых, наблюдается уменьшение секреции ключевых гемопоэтических факторов роста, что ограничивает способность клеток поддерживать и стимулировать процессы кроветворения. Во-вторых, блокировка аутофагии препятствует эффективному удалению повреждённых белков и органелл, что может привести к их накоплению и снижению функциональной активности ММСК. Эти выводы согласуются с результатами работы S. Ghanta и соавт., где показано, что нарушение аутофагии в ММСК приводит к снижению их цитопротективной активности в условиях окислительного стресса [40]. Важно отметить, что, несмотря на сохранение жизнеспособности ММСК при ингибировании аутофагии, их функциональная активность, в частности продукция биологически активных молекул, существенно снижается. В условиях in vivo такие клетки демонстрируют низкую эффективность в восстановлении миелоидной ткани, а показатели гемопоэза в этих группах сопоставимы с показателями контрольных животных, не получавших клеточной терапии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные данные подчёркивают важность аутофагии как ключевого механизма, определяющего регенераторный потенциал ММСК. Результаты нашего исследования подтверждают потенциальную эффективность использования ММСК с индуцированной аутофагией для стимуляции регенерации миелоидной ткани на модели острой лучевой болезни. Однако, прежде чем эти данные можно будет использовать в клинической практике, необходимо провести дополнительные экспериментальные исследования: для определения оптимальных условий модуляции аутофагии; разработки стандартизованных протоколов индукции; комплексной оценки эффективности и безопасности данного подхода; изучения долгосрочных эффектов; анализа механизмов действия, включая специфические влияние на восстановление эритропоэза и тромбоцитопоэза.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. В.А. Иванов — осуществление научно-исследовательского процесса, включая выполнение экспериментов и сбор данных, подготовку и написание текста статьи; Д.Ю. Гребнев — осуществление научно-исследовательского процесса, включая выполнение экспериментов, написание рукописи — рецензирование и редактирование, научное руководство; И.Ю. Маклакова — написание рукописи — рецензирование и редактирование; Л.Г. Полушина — осуществление научно-исследовательского процесса, включая выполнение экспериментов и сбор данных. Все авторы одобрили рукопись (версию для публикации), а также согласились нести ответственность за все аспекты работы, гарантируя надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой её части.

Благодарности. Неприменимо.

Этическая экспертиза. Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «Уральский государственный медицинский университет» (протокол № 7 от 27.10.2023).

Согласие на публикацию. Неприменимо.

Источники финансирования. Отсутствуют.

Раскрытие интересов. Авторы заявляют об отсутствии отношений, деятельности и интересов за последние три года, связанных с третьими лицами (коммерческими и некоммерческими), интересы которых могут быть затронуты содержанием статьи.

Оригинальность. При создании настоящей работы авторы не использовали ранее опубликованные сведения (текст, иллюстрации, данные).

Доступ к данным. Все данные, полученные в настоящем исследовании, доступны в статье и в приложениях к ней.

Приложение 1. Идентификация кластеров дифференцировки мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток методом проточной цитометрии. DOI: 10.17816/gc678802-4348516.

Приложение 2. Определение дифференцировочного потенциала мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток методом проточной цитометрии. DOI: 10.17816/gc678802-4348519.

Генеративный искусственный интеллект. При создании настоящей статьи технологии генеративного искусственного интеллекта не использовали.

Рассмотрение и рецензирование. Настоящая работа подана в журнал в инициативном порядке и рассмотрена по обычной процедуре. В рецензировании участвовали два внешних рецензента, один член редакционной коллегии и научный редактор издания.

ADDITIONAL INFORMATION

Author contributions: V.A. Ivanov: data curation, investigation, writing — original draft; D.Yu. Grebnev: investigation, supervision, writing — original draft, writing — review & editing; I.Yu. Maklakova: writing — original draft, writing — review & editing; L.G. Polushina: data curation, investigation. All the authors approved the version of the manuscript to be published and agreed to be accountable for all aspects of the work, ensuring that questions related to the accuracy or integrity of any part of the work are appropriately investigated and resolved.

Acknowledgments: Not applicable.

Ethics approval: The study was approved by the Local Ethics Committee of the Ural State Medical University (Protocol No. 7 dated October 27, 2023).

Consent for publication: Not applicable.

Funding sources: No funding.

Disclosure of interests: The authors have no relationships, activities, or interests for the last three years related to for-profit or not-for-profit third parties whose interests may be affected by the content of the article.

Statement of originality: No previously published material (text, images, or data) was used in this work.

Data availability statement: All data generated during this study are available in the article and its supplementary material.

Supplement 1: Identification of differentiation clusters in multipotent mesenchymal stromal cells by flow cytometry. DOI: 10.17816/gc678802-4348516.

Supplement 2: Assessment of differentiation potential of multipotent mesenchymal stromal cells by flow cytometry. DOI: 10.17816/gc678802-4348519.

Generative AI: No generative artificial intelligence technologies were used to prepare this article.

Provenance and peer review: This paper was submitted unsolicited and reviewed following the standard procedure. The review process involved two external reviewers, one member of the editorial board, and the in-house scientific editor.

¹ Лекарственное средство не зарегистрировано в Российской Федерации.

作者简介

Vladislav Ivanov

Ural State Medical University

编辑信件的主要联系方式.
Email: vlanov123@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7475-9517
SPIN 代码: 2915-7500
俄罗斯联邦, Ekaterinburg

Dmitry Grebnev

Ural State Medical University; Institute for Medical Cell Technologies

Email: dr-grebnev77@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5698-8404
SPIN 代码: 5761-9324

MD, Dr. Sci. (Medicine), Associate Professor

俄罗斯联邦, Ekaterinburg; Ekaterinburg

Irina Maklakova

Ural State Medical University; Institute for Medical Cell Technologies

Email: makliu@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6895-7947
SPIN 代码: 7335-7294

MD, Dr. Sci. (Medicine), Associate Professor

俄罗斯联邦, Ekaterinburg; Ekaterinburg

Larisa Polushina

Ural State Medical University

Email: polushina-larisa@bk.ru
ORCID iD: 0000-0002-4921-7222
SPIN 代码: 4391-5873

MD, Cand. Sci. (Medicine)

俄罗斯联邦, Ekaterinburg

参考

补充文件