Том 19, № 2 (2024)

Использование технологии получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) с их последующей дифференцировкой является перспективным подходом для изучения патогенеза заболеваний и разработки способов терапии оптических нейропатий и ретинопатий — наиболее распространённых типов патологий зрительной системы, при которых происходит дегенерация ганглиозных клеток сетчатки (и как следствие — атрофия зрительного нерва) или поражаются клетки пигментного эпителия и фоторецепторы, соответственно. Перспектива получения специфичных для пациента ИПСК добавила мощный альтернативный инструмент обнаружения новых вызывающих заболевания мутаций, изучения взаимосвязей между генотипом и фенотипом, проведения скрининга терапевтической токсичности и разработки персонализированной клеточной терапии оптических нейропатий и ретинопатий.

Многочисленные работы демонстрируют возможность создания из ИПСК различных типов клеток сетчатки, что обеспечивает бурное развитие направления исследований заболеваний человека, для которых отсутствуют релевантные животные модели или ограничен доступ к первичным тканям и клеткам человека.

В настоящем обзоре представлено разнообразие протоколов по получению из соматических клеток ИПСК с их последующей дифференцировкой с акцентом на наблюдаемые биологические эффекты получаемых клеточных культур, в том числе и органоидов, а также обсуждаются перспективы использования таких моделей. Статья может быть полезна исследователям, изучающим патогенез различных наследственных форм слепоты, и разработчикам подходов к терапии этих заболеваний, нуждающимся в получении релевантной клеточной модели.

Обоснование. Генотип человека является одним из факторов, определяющих тяжесть течения COVID-19. Ранее в широкомасштабном полногеномном исследовании ассоциаций COVID-19 HG project (COVID-19 Host Genetics Initiative, 2021) рассматривалась связь генетических вариантов, включающих множество локусов, с тяжестью течения данного заболевания. Ожидается, что генетические варианты, оказывающие наибольшее влияние на тяжесть течения COVID-19, будут иметь низкую частоту в популяции. Таким образом, изучение редких вариантов может дать дополнительные сведения о патогенезе заболевания и, следовательно, помочь в разработке способов его профилактики и лечения.

Цель исследования — поиск генов, обогащённых редкими генетическими вариантами, связанными с тяжестью течения COVID-19, на данных российской популяции при помощи репликационного анализа.

Методы. Проведено секвенирование клинического экзома российской когорты пациентов на базе СПб ГБУЗ «Городская больница № 40» и СПбГУ. В исследовании использовали биоматериал пациентов, госпитализированных в СПб ГБУЗ «Городская больница № 40» с диагнозом COVID-19, и здоровых людей, вошедших в группу популяционного контроля. Тяжесть течения COVID-19 определяли по результатам компьютерной томографии лёгких. Список генов для последующей репликации был сформирован в результате анализа литературы. Репликационный анализ генов, ассоциированных с тяжестью течения COVID-19, был выполнен с помощью методов нагрузочного тестирования (burden test).

Результаты. Проведено секвенирование 701 клинического экзома: 263 пациентов с тяжёлым течением COVID-19 и 438 здоровых доноров. В результате анализа литературы было найдено 18 генов, ассоциированных с тяжёлым течением COVID-19, которые вошли в репликационный анализ. Он не выявил генов, ассоциация которых с тяжёлым течением COVID-19 подтвердилась бы на исследуемой когорте.

Заключение. Несмотря на то, что генов, для которых была бы найдена значимая ассоциация между обогащением функциональными вариантами и тяжестью течения COVID-19, не обнаружено, рассчитанное направление корреляционной связи совпадает с данными ранее проведённых исследований. Расширение исследуемой когорты приведёт к усилению мощности тестов и, возможно, позволит обнаружить дополнительные редкие варианты, влияющие на тяжесть течения COVID-19.

Актуальность. При обнаружении у пациентов с муковисцидозом новых, чаще всего редких, вариантов гена CFTR применяют метод кишечных органоидов, который позволяет оценить остаточную функциональную активность CFTR-канала и действие таргетных препаратов для определения возможности дальнейшей патогенетической терапии. Проведение клинических исследований эффективности таргетных препаратов у пациентов с редкими вариантами гена CFTR является дорогостоящим, а группы их крайне малочисленны. Форсколиновый тест на кишечных органоидах пациента позволяет осуществить персонализированный подход при изучении редких или даже единичных вариантов гена CFTR.

Цель исследования — на культуре кишечных органоидов, полученной от пациентки с двумя редкими вариантами гена CFTR с.264_268delATATT и c.3139+1G>C изучить влияние CFTR-потенциатора ивакафтора, а также ивакафтора в сочетании с CFTR-корректорами лумакафтором, тезакафтором и элексакафтором на восстановление функциональной активности CFTR-канала.

Материалы и методы. Для оценки активности CFTR-канала применяли форсколиновый тест на кишечных органоидах и метод определения разницы кишечных потенциалов, проводили описание клинической картины у пациентки с генотипом с.264_268delATATT/c.3139+1G>C.

Результаты. In vitro показано, что генетические варианты с.264_268delATATT и c.3139+1G>C приводят к полной утрате функционального белка CFTR, при этом CFTR-модуляторы не оказывают положительного эффекта и не обеспечивают восстановления данного белка, в отличие от F508del/F508del-контроля. Тяжесть течения заболевания у ребёнка согласуется с результатами функциональных тестов.

Заключение. Оба исследованных варианта гена CFTR относятся к «тяжёлым» и вызывают полную потерю активности хлорного канала CFTR. Для вариантов с.264_268delATATT и c.3139+1G>C не обнаружены эффективные CFTR-модуляторы, поэтому в данном случае не может быть рекомендована таргетная терапия.

Обоснование. Белок UBE2A относится к семейству E2 убиквитин-связывающих ферментов, которые участвуют в процессе убиквитинирования белков-субстратов. Известно, что мутации гена UBE2A связаны с синдромом врождённой Х-сцепленной умственной отсталости типа Насименто. До сих пор остаётся неизвестным, каким образом дисфункция гена UBE2A приводит к нарушению развития центральной нервной системы.

Цель исследования — создание клеточной модели на основе индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) для изучения молекулярных и клеточных функций гена UBE2A в нейрогенезе.

Методы. Используя геномное CRISPR-Cas9-редактирование и лентивирусную трансдукцию, мы создали клеточную модель на основе ИПСК двух здоровых доноров, включающую изогенные ИПСК с нокаутом и индуцибельной гиперэкспрессией гена UBE2A. Дополнительно к изогенным системам мы получили линию ИПСК путём репрограммирования мононуклеаров периферической крови пациента, которому поставлен диагноз Х-сцепленной умственной отсталости типа Насименто и у которого выявлена делеция, целиком захватывающая локус гена UBE2A.

Результаты. Полученные ИПСК демонстрируют морфологию, подобную эмбриональным стволовым клеткам. Они экспрессируют маркёры плюрипотентных клеток OCT4, SOX2, SSEA-4 и TRA-1-81 и имеют нормальный кариотип. Обнаружено, что у ИПСК с нокаутом или гиперэкспрессией гена UBE2A происходит статистически значимое увеличение размера клеточного ядра по сравнению с изогенным контролем.

Заключение. Созданная клеточная модель на основе ИПСК может быть использована для фундаментальных исследований функций гена UBE2A в нейрогенезе.