Способность к аккумуляции и трансформации дизельного топлива у зеленой водоросли Ulva lactuca Баренцева моря

Полный текст

Введение

В последние годы возрос интерес к возможной роли водорослей-макрофитов в биоремедиации прибрежных акваторий от нефтепродуктов (НП). Это вызвано полученными сведениями о способности водорослей не только аккумулировать НП на поверхности таллома, но и поглощать, а в дальнейшем трансформировать и включать НП в метаболизм клеток. Описываемые процессы осуществляются во многом благодаря углеводородокисляющим бактериям (УОБ), которые в большом количестве присутствуют на поверхности макроводорослей, особенно в загрязненных нефтепродуктами прибрежных акваториях [1, 2]. Объектами исследований влияния НП на водоросли, а также роли водорослей в биоремедиации среды обитания были преимущественно представители бурых водорослей: ламинариевые и фукусовые, составляющие основную фитомассу в прибрежье Баренцева моря ¹ [3, 4]. Гораздо меньше данных по указанной выше тематике было получено для зеленых водорослей, хотя, судя по имеющимся в литературе сведениям, они также обладают определенной устойчивостью к нефтяному загрязнению [5–7]. Ранее в наших экспериментах по влиянию дизельного топлива (ДТ) на ранние стадии развития Ulva lactuca было показано, что при содержании в воде ДТ в концентрации 5 мг/л (100 ПДК) наблюдается замедление развития проростков на 20-е сутки эксперимента, при 25 мг/л (500 ПДК) – на 10-е сутки, а при содержании токсиканта 50 мг/л (1000 ПДК) гибель проростков наблюдалась на 5-е сутки опыта [8]. В опытах по влиянию ДТ на близкий к Ulva lactuca вид U. intestinalis было отмечено, что добавление в среду ДТ в концентрации 1–5 мг/л (20–100 ПДК) не приводит к гибели водорослей, однако вызывает снижение фотосинтетической активности и содержания фотосинтетических пигментов. Добавление же в среду ДТ от 50 до 150 мг/л (1000–3000 ПДК) вызывает постепенные необратимые изменения у водорослей, приводящие к гибели растений, причем при содержании в воде ДТ 150 мг/л гибель происходит через 3 сут эксперимента [9]. На сегодняшний день в литературе отсутствуют сведения о диапазоне толерантности «взрослых» талломов Ulva lactuca к ДТ и способности Ulva lactuca поглощать и трансформировать токсикант.

Ulva lactuca – вид зеленых водорослей, космополит, сравнительно недавно редко встречавшийся в Баренцевом море, в настоящее время активно распространяется на литорали Восточного Мурмана [10]. Дизельное топливо является одним из самых распространенных токсикантов морских акваторий в связи с тем, что используется морским транспортом, а также отопительными береговыми комплексами (ТЭЦ) [11].

Целью нашего исследования является получение сведений о поглощении и трансформации НП тканями U. lactuca, об изменениях у водорослей, происходящих на клеточном уровне, при содержании ДТ в морской воде 10 и 20 мг/л, а также возможной роли U. lactuca в биоремедиации. В статье использованы материалы тезисов Беломорской студенческой научной сессии СПбГУ) ².

Материал и методы

Талломы Ulva lactuca без признаков размножения и воду отбирали для исследования в августе 2023 г. на литорали губы Зеленецкой Баренцева моря в районе сезонной биостанции ММБИ РАН (69°07′09″ с. ш., 36°05′35″ в. д.). Эксперименты проводили в термостатируемом помещении при температуре 8–10 °С с постоянным освещением 150 мкмоль м^-²с^-¹, фотопериод 24L:0D (период полярного дня) и аэрацией водной среды. Воду для опытов соленостью 33 ‰ фильтровали через ватно-марлевый фильтр и охлаждали до температуры 8–10 °С. В экспериментальные сосуды в количестве 18 шт. (три – контрольных с водорослями, три – контрольных без водорослей, шесть – опытных с водорослями и шесть – без водорослей (по три на каждую концентрацию)) с подготовленной водой объемом 2 л добавляли летнее дизельное топливо в количестве 10 и 20 мг/л (200 и 400 ПДК соответственно). В сосуды, где должны были находиться водоросли, помещали взрослые талломы U. lactuca весом 5 г каждый из расчета три экземпляра на одну экспериментальную емкость. Каждый сосуд аэрировали с помощью воздушного компрессора.

Все экспериментальные емкости плотно закрывали крышкой с целью исключения потери летучих фракций ДТ. Концентрации ДТ были выбраны в целях определения толерантности к токсиканту и анализа морфологических изменений у U. lactuca. В начале (0 суток), на 5-е и 10-е сутки эксперимента образцы водорослей отбирали и исследовали методом газовой хроматографии/масс-спектрометрии на содержание в них НП. Водоросли, не подвергавшиеся воздействию НП, изучали на протяжении опыта как контрольный образец. Воду на содержание ДТ анализировали в исходном варианте, контроле и после добавления ДТ в присутствии в воде водорослей и без них. Каждый анализ воды и водорослей проходил в трех повторностях. Процесс пробоподготовки и инструментального анализа осуществляли на основе методики ЕРА 8270, подробно описанной в предыдущих исследованиях [12]. Для анализа изменений у водорослей под влиянием НП, происходящих на клеточном уровне, из талломов делали высечки 1 см², которые помещали в пробирки Эппендорфа с фиксатором. Предфиксацию проводили 2.5%-ным глютаровым альдегидом на какодилатном буфере (к-к-б) с введением в состав фиксатора  1.5%-ного танина, а постфиксацию – 1%-ным OsO₄ (оксидом осмия (VIII)) на аналогичном буфере. Осмотическое давление обоих фиксаторов доводили до осмотического давления морской воды в среде обитания (1100 мосм) с помощью сахарозы. Фиксация проходила при температуре 0…+5 °С по схеме:

предфиксация глютаровым альдегидом 18 ч, отмывка к-к-б – две смены по 6 ч, постфиксация OsO₄ – 18 ч. Далее материал готовили к просмотру в электронном микроскопе JEM-100C (фирмы JEOL) по общепринятым методикам ³.

Результаты и обсуждение

Светооптические и электронно-микроскопические наблюдения показали, что талломы U. lactuca, взятые из места обитания, где концентрация НП была 0.62 мг/л (12 ПДК), не отличались по ультраструктуре клеток от исследованных ранее талломов ульвовых водорослей, обитающих при содержании НП в воде 0.1–0.2 мг/л (2–4 ПДК), которое наблюдается в большинстве исследованных губ побережья Кольского залива, Восточного Мурмана Баренцева моря. Все отобранные талломы были жизнеспособны в контрольных условиях до конца эксперимента. Каких-либо деструктивных изменений в морфологии клеток не наблюдалось. Хлоропласты содержали одноканальные пиреноиды (литера П на рис. 1, а) преимущественно погруженного типа, выявлялось большое число гранул крахмала (литера К на рис. 1, а), что свидетельствовало об активно идущем фотосинтезе (рис. 1, а).

Это же подтверждала и ярко зеленая окраска талломов контрольного варианта, сохранявшаяся до конца опыта. Вместе с тем на срезах ульвы контрольного варианта на всех сроках опыта в строении клеток отмечалась гетерогенность: клетки различались по степени развития фотосинтетического аппарата, парциального объема запасного вещества. Надо отметить, что такая же гетерогенность отмечалась при изучении ультраструктуры клеток ульвовых в природных и экспериментальных условиях в наших более ранних исследованиях [13]. На 5-е сутки в обоих вариантах опыта с ДТ в концентрации 10 и 20 мг/л около 90 % клеток в талломах ульвы не имели признаков повреждения, талломы сохраняли однородную зеленую окраску. Однако если в контрольном варианте и варианте с введенным ДТ в концентрации 10 мг/л пиреноиды присутствовали в большинстве хлоропластов, то при воздействии ДТ в концентрации 20 мг/л пиреноиды выявлялись лишь в хлоропластах у 30–40 % клеток (рис. 1, b), что может свидетельствовать об уменьшении активности функционирования фотосинтетического аппарата у большинства клеток ульвы. На 10-е сутки эксперимента при введенном в воду ДТ (10 мг/л) в строении большинства клеток таллома (до 70 %) по-прежнему не отмечалось каких-либо изменений. Однако небольшая часть клеток при данной концентрации, а также основная часть клеток (до 80 %) ульвы при концентрации 20 мг/л содержала минимальное количество организованных структур: остатки цитоплазмы локализовались у оболочки, хлоропласты не выявлялись (рис. 1, d). В клетках присутствовали зерна крахмала, но в гораздо меньшем количестве, чем в клетках контрольного варианта и на предыдущем этапе (5 сут) опыта. С внешней стороны оболочки клеток выявлялось большое число бактерий (рис. 1, c, d). Вместе с тем небольшая часть клеток таллома характеризовалась неповрежденной структурой.

 

Рис. 1. Изменения в клетках Ulva lactuca в эксперименте: a – контроль 0 сут;  b – 5 сут эксперимента при концентрации ДТ 10 мг/л (200 ПДК); с – 5 сут эксперимента при концентрации 20 мг/л (400 ПДК) ДТ; d – 10 сут эксперимента при концентрации 20 мг/л (400 ПДК) ДТ. Условные обозначения: П – пиреноид, К – гранулы крахмала, Я – ядро. Стрелками показаны бактерии на периферии таллома

Fig. 1. Changes in Ulva lactuca cells in the experiment: a – control for 0 days; b – 5 days of the experiment at 10 mg/L (200 MPC) diesel fuel (DF); c – 5 days of the experiment at 20 mg/L (400 MPC) DF; d – 10 days of the experiment at 20 mg/L (400 MPC) DF. Notations: П – pyrenoid, К – starch granules, Я – core. Arrows indicate bacteria on the thallus periphery

 

Результаты анализа образцов воды показали, что в течение эксперимента с добавлением в воду ДТ в концентрации 20 мг/л (без ульвы) происходит деструкция и поглощение введенных углеводородов (УВ), по-видимому, микроорганизмами, присутствующими в воде. На пятые сутки опыта концентрация НП в воде снизилась на 40 % и составила 12 мг/л. Способность к биоремедиации у микроорганизмов отмечалась ранее в исследованиях с другими видами водорослей [1]. В случае добавления в воду образца ульвы валовое содержание НП в воде на 5-е сутки снизилось на 86 % и составило 2.8 мг/л, а на 10-е сутки немного увеличилось (до 4.2 мг/л). Некоторое увеличение концентрации НП в воде на 10-е сутки говорит об обратном процессе – высвобождении поглощенных УВ в воду, что может отражать изменение (частичное разрушение) мембранной системы клетки, наблюдаемое на электронно-микроскопических фотографиях. Подобный результат фиксировался и в более ранних исследованиях влияния углеводородов сырой нефти на зеленую водоросль Acrosiphonia arcta [14]. Значения показателя, отражающего степень трансформации углеводородов (∑н-алканов/∑НП), оставались высокими (> 0.2) на протяжении всего эксперимента, то есть процессы поглощения/высвобождения такого количества УВ (20 мг/л) проходят без существенной их трансформации. При добавке ДТ (20 мг/л) временного интервала в 10 сут, вероятно, недостаточно для наблюдения существенных изменений структуры нефтяных УВ как при участии микроводорослей, так и при участии ульвы.

Изменение концентрации алканов и валового содержания нефтепродуктов в тканях Ulva lactuca показано на рис. 2.

 

Рис. 2. Концентрация (C) н-алканов в тканях Ulva lactuca  в течение эксперимента с добавлением ДТ: а – 10 мг/л (200 ПДК); b – 20 мг/л (400 ПДК)

Fig. 2. Mass fraction of n-alkanes in the tissues of the Ulva lactuca during the experiment with the addition of DF: а – 10 mg/L (200 MPC); b – 20 mg/L (400 MPC)

 

Изначально образец водоросли (контроль, 0 сут) содержал 0.540 мг/г НП, из них н-алканов в диапазоне С₉–С₃₀ – 0.1 мг/г. Образец отличался повышенным для «чистых» водорослей содержанием нефтяных УВ в области С₂₃–С₃₀ (рис. 2). Важно отметить отсутствие у ульвы каких-либо выраженных эндогенных н-алканов по сравнению с водорослями, обитающими в загрязненных акваториях [15, 16]. На 5-е сутки эксперимента без добавления ДТ (контроль, 5 сут) валовое содержание УВ в тканях ульвы снизилось до 0.49 мг/г, на 10-е сутки – до 0.34 мг/г. Уменьшилось в четыре раза и количество н-алканов в тканях водорослей – от 0.1 мкг/г (0 сут) до 0.026 мг/г (10 сут). Значение маркерного показателя ∑н-алканов/∑НП также существенно снизилось с 0.19 (в первые сутки) до 0.08 (на 5-й и 10-й день), что указывает на активную трансформацию УВ в первые пять суток. Значение данного показателя на уровне менее 0.1 характерно для водорослей, произрастающих в относительно чистых акваториях. При добавлении ДТ начинается процесс поглощения нефтяных УВ поверхностью водоросли. В опыте с добавлением ДТ в концентрации 10 мг/л содержание НП в тканях ульвы на 5-е и 10-е сутки было зарегистрировано на уровне 0.6 мг/г (рис. 2, а). Маркерное соотношение ∑н-алканов/∑НП в течение эксперимента находилось на уровне 0.2. Небольшое снижение этого показателя до 0.18 на 10-е сутки свидетельствует о начале трансформации химической структуры углеводородов. В образце ульвы, где ДТ было добавлено в количестве 20 мг/л, этот показатель на 5-е и на 10-е сутки зарегистрирован на уровне 0.25 и 0.28 соответственно, что указывает на активный процесс поглощения углеводородов, который на 10-е сутки еще не завершился. При добавлении 20 мг/л максимум содержания НП в водоросли был зарегистрирован на 10-е сутки эксперимента и составил 18 мг/г (рис. 2, b).

Обобщенные результаты эксперимента с Ulva lactuca показаны в таблице.

Процессы поглощения и трансформации НП характерны для ульвы так же, как и для всех ранее изученных видов водорослей-макрофитов [12, 14]. По сравнению с другой зеленой водорослью – акросифонией [14] – ульва демонстрирует более высокую скорость поглощения/трансформации УВ, что может быть обусловлено различием в строении таллома: пластинчатым у ульвы и сифоновым у акросифонии. Можно предположить, что пластинчатое строение таллома более благоприятно для расположения эпифитных углеводород-окисляющих бактерий.

 

Валовое содержание НУ в воде (мг/л) и в водорослях (мг/г) в ходе эксперимента при добавлении 20 мг/л (400 ПДК) ДТ

Gross content of petroleum hydrocarbons (PH) in water (mg/L) and in algae (mg/g) during the experiment with the addition of 20 mg/L (400 MPC) DF

Время, сут / Time, days	НУ в воде / PH in water	НУ в водорослях / PH in algae
0	20	0.54
5	2.8	4
10	4.2	18

 

Заключение

Проведенные опыты продемонстрировали, что воздействие летнего ДТ в концентрации 10 мг/л (200 ПДК) в течение 10 сут и в концентрации 20 мг/л (400 ПДК) в течение 5 сут при температуре 8–10 °С не является летальным для литорального вида зеленых водорослей Ulva lactuca. По-видимому, длительное произрастание в природных условиях при концентрации НП около 0.6 мг/л (12 ПДК) позволяет клеткам ульвы выработать адаптивные реакции, выдерживать разовые выбросы (утечки) НП. Показано, что U. lactuca при загрязнении ДТ морской воды достаточно быстро включается в биоремедиацию, аккумулируя, поглощая и активно трансформируя нефтепродукты. На основании данного эксперимента, а также литературных данных можно предположить, что относительно широкий диапазон толерантности к нефтепродуктам является одним из факторов, позволившим U. lactuca занять определенную экологическую нишу на литорали Мурманского побережья Баренцева моря, богатого в настоящее время источниками нефтяного загрязнения.

 

¹ Степаньян О. В. Морфо-функциональные перестройки у водорослей-макрофитов Баренцева моря под воздействием нефти и нефтепродуктов : дис. … канд. биол. наук : 25.00.28. Мурманск, 2003. 146 с.

² Беломорская студенческая научная сессия СПбГУ. Тезисы докладов. 1–2 февраля 2024 г., Санкт-Петербург. Санкт-Петербург : Свое издательство, 2024. 79 с. URL: https://dspace.spbu.ru/bitstream/11701/44808/1/Abstract_book_WSSS24.pdf (дата обращения: 21.11.2024).

³ Уикли Б. Электронная микроскопия для начинающих. Москва : Мир, 1975. 324 с.

Об авторах

Григорий Михайлович Воскобойников

Мурманский морской биологический институт РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: grvosk@mail.ru
SPIN-код: 1740-3870
Scopus Author ID: 7004206680
ResearcherId: G-4094-2016

заведующий лабораторией альгологии, доктор биологических наук, профессор

Россия, Мурманск

Лариса Олеговна Метелькова

Мурманский морской биологический институт РАН

Email: Larissa.metelkova@list.ru
SPIN-код: 2850-7044

старший научный сотрудник, кандидат химических наук

Россия, Мурманск

Дмитрий Олегович Салахов

Мурманский морской биологический институт РАН

Email: Salahov04@yandex.ru
SPIN-код: 6153-4697

младший научный сотрудник

Россия, Мурманск

Екатерина Олеговна Кудрявцева

Мурманский морской биологический институт РАН

Email: ekato393@mail.ru
SPIN-код: 9379-9074

старший лаборант

Россия, Мурманск

Список литературы

Дополнительные файлы