Induction of Callusogenesis and Indirect Morphogenesis in the Populus deltoides Marshall × Populus alba L. Hybrid in vitro

Full Text

Введение

Виды и гибриды Populus интенсивно выращиваются для целлюлозной промышленности и производства биомассы. Поскольку растения данного вида отличаются быстрыми темпами роста и хорошо адаптируются к условиям деградированных почв, они активно применяются в защитном лесоразведении, рекультивации нарушенных ландшафтов и озеленении в регионах мира с умеренным климатом [2].

Тополь является одним из часто используемых модельных объектов в биотехнологии и селекции лесных деревьев. Однако длительность периода, необходимого для оценки наличия или отсутствия полезных признаков у растений, является серьезным ограничением для классической селекции [8]. Культура растительных клеток и тканей может использоваться в качестве инструмента для селекции растений, поскольку клетки под действием регуляторов роста претерпевают специфические изменения в процессе культивирования. Таким образом, селекционеры могут разработать соответствующие стратегии отбора сомаклональных вариаций для получения улучшенных генотипов тополя по устойчивости к стресс-факторам и скорости роста [6; 15].

Метод культуры клеток и тканей, применяемый в биотехнологии растений, основывается на уникальном свойстве растительных клеток – тотипотентности. Это означает, что каждая клетка содержит полный генетический набор информации о структуре и функциях всего организма. Соответственно путем дифференцировки из одной клетки можно получить полноценное растение – регенерант [5; 10]. Исходя из этого основным аспектом в использовании культуры каллусной ткани является стимуляция морфогенеза и разработка эффективных протоколов регенерации целых растений. Опубликовано большое количество экспериментальных работ, посвященных изучению как образования каллусов in vitro, так и процессов морфогенеза у представителей многих семейств растений, в том числе и у видов и гибридов Populus [3; 13; 17]. Согласно литературным данным, на процесс индукции морфогенеза соматических клеток оказывают влияние различные экзогенные факторы (гормональный и минеральный состав питательной среды, условия культивирования in vitro, стресс-факторы и др.) и эндогенные (генотип донорного растения, его физиологический статус и др.) [10; 16; 18]. Оптимальный гормональный состав питательной среды, тип экспланта для индукции первичного каллуса, а также условия культивирования для получения растений-регенерантов необходимо подбирать эмпирическим путем индивидуально для каждого вида растения.

Цель нашего исследования – определить оптимальные условия для индукции каллусогенеза и способность к непрямому морфогенезу гибрида Populus F₁ в условиях in vitro.

Материалы и методика исследования

Исследование проводилось в 3-хкратной повторности в 2023 году на базе лаборатории биотехнологий селекционно-семеноводческого центра ФНЦ агроэкологии РАН. В качестве модельного объекта исследования был выбран гибрид тополя, который был получен в результате целенаправленного скрещивания Populus deltoides Marshall × Populus alba L. (Populus F₁).

Для индукции каллусогенеза использовали питательную среду, приготовленную по протоколу Murashige и Scoog (MS), дополненную синтетическими фитогормонами: ауксином 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д) или цитокинином тидиазурон (ТДЗ), в пяти концентрациях от 0,5 до 2,5 мг/л, с интервалом 0,5. Инокуляцию первичных эксплантов осуществляли по той же методике, как и в предыдущем исследовании [5]. По истечении 28 дней культивирования на фитостеллажах СТЕЛЛАР-ФИТО LINE (Россия) с 16-тичасовым фотопериодом и температурой 22–24 � осуществляли оценку свежей массы, морфологических характеристик первичного каллуса (цвет, структура) и  индукции  каллусогенеза  (ИК),  расчет которой проводили по формуле [4]:

$ИК =\frac{кол-во каллуса индуцированное эксплантами }{общее кол-во инокулированных эксплантов} * 100\%$

Оценку массы свежего первичного каллуса реализовывали при помощи лабораторных весов ВЛ-120С (Россия). Данные были обработаны с использованием программного обеспечения StatSoft Inc. (USA). Для выявления статистической значимости различий между количественными показателями использовался критерий Фишера (F-тест), по результатам которого различия считались статистически значимыми при значении p < 0,05. Полученные результаты представлены в виде средней арифметической с учетом ошибки среднего. Для наглядного представления данных и создания гистограмм использовали пакет программ Microsoft Excel.

Для остановки ростовых процессов и формирования морфогенных зон применяли осмотический стресс, для этого транспланты первичного каллуса в асептических условиях переносили на питательную среду MS, дополненную 20 г/л полиэтиленгликоля 6000 (ПЭГ 2 %), и культивировали при тех же условиях в течение 14 дней. После осуществляли отбор морфогенного каллуса с последующим его переносом на безгормональную питательную среду MS.

Результаты и обсуждение

При анализе полученных данных в ходе исследования было установлено, что Populus F₁ обладает высокой способностью к каллусообразованию. На всех исследуемых вариантах питательных сред вне   зависимости от гормона и его концентрации, а также от типа экспланта, индукция каллусогенеза составляла 91,7–100 % (таблица 1). Полученные данные согласуются с результатами ранее проводимых исследований у представителей рода Populus, 100 % индукция каллусогенеза была зафиксирована Erst А.А. с соавторами у P. alba и P. nigra на питательных средах MS с добавлением 2,4-Д [9], а в исследовании Maheshwari с соавторами аналогичные результаты активной индукции каллусных тканей (90–100 %) были получены у P. angustifolia, balsamifera и P. deltoides на питательных средах MS, дополненных зеатином и ТДЗ [14].

Таблица. Индукция каллусогенеза Populus F₁ в зависимости от фитогормонов и их концентраций

 

мг/л	Индукция каллусогенеза, %
	2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота	Тидиазурон
0,5	100±0,0 a	100±0,0 a
1	91,7±8,3 a	100±0,0 a
1,5	91,7±8,3 a	100±0,0 a
2	100±0,0 a	91,7±8,3 a
2,5	100±0,0 a	100±0,0 a
Примечание. В таблице представлены средние значения ± ошибка среднего, одинаковые буквы в столбце означают отсутствие статистических различий согласно F-тесту при p < 0,05.

Рисунок 1. Прирост массы каллуса на эксплантах Populus F1 в зависимости от фитогормона и типа экспланта. На гистограммах представлены средние значения ± ошибка среднего. Разные строчные буквы (а-d) означают статистически значимые различия согласно F-тесту p < 0,05

Было отмечено, что на нарастание массы первичного каллуса оказывают влияние тип экспланта и концентрация фитогормона. Максимальные показатели массы каллусных тканей фиксировались на листовых эксплантах при концентрации ТДЗ 0,5-1 мг/л (1,93 и 1,97 г соответственно) и 2,4-Д 2,5 мг/л (1,09 г). О том, что лист является наиболее подходящим эксплантом для получения каллусных культур у представителей рода Populus, подтверждается и результатами исследования С. Билоус, согласно которым, было установлено, что фрагменты листовой пластины Populus tremula характеризуются более активным каллусогенезом, чем побеги [1]. Также была установлена прямая и обратная зависимость между массой образовавшегося каллуса и концентрацией 2,4-Д (рис. 1 а) и ТДЗ (рис. 1 б) соответственно.

При анализе морфологических особенностей каллусных тканей было установлено, что на структуру каллуса оказывает влияние концентрация и тип фитогормона, а также используемый первичный эксплант. На всех побеговых эксплантах вне зависимости от гормонального состава среды образовывался сильно обводненный рыхлый каллус белого и коричневого цвета (рис. 2 а, б). Аналогичный каллус формировался и на листовых эксплантах в присутствии ауксина 2,4-Д на всех исследуемых концентрациях (рис. 2 в, г). Компактную, четко дифференцированную каллусную ткань удалось получить на питательной среде с низкими концентрациями ТДЗ (0,5 и 1 мг/л), при более высоких значениях цитокинина формировался плотным каллус (рис. 2 д, е). Данные согласуются с результатами Li H. с соавторами, которые также определили, что низкие концентрации ТДЗ способствуют росту и пролиферации компактного каллуса у серого тополя (P. tremula × P. alba) [12].

После переноса полученных трансплантов первичного компактного каллуса на питательную среду с ПЭГ 2 % отмечалась остановка роста каллусных тканей, а по истечении 14 дней культивирования, фиксировались четко оформленные морфогенные зоны (рис. 3). Полученные данные согласуются с результатами исследования Heringer с соавторами [11], которые сообщили, что добавление 10 % PEG-3350 в культуральную среду увеличивало количество и качество морфогенных каллусов у Carica papaya L.

У отобранных морфогенных каллусов после переноса на безгормональную питательную среду MS отмечались активные ростовые процессы (рис. 4 а).

Рисунок 2. Морфологические особенности первичных каллусных тканей Populus F1 в зависимости от типа экспланта, фитогормона и его концентрации: а – 2,4-Д 1 мг/л; б – ТДЗ 2 мг/л; в – 2,4-Д

Рисунок 3. Формирование морфогенных зон первичного каллуса после 14 дней культивирования на питательной среде с ПЭГ 2 %. Стрелками обозначены морфогенные очаги. Масштаб 0,5 см

Рисунок 4. Непрямая регенераци Populus F₁ на питательной среде MS из каллусных тканей: а – нарастание морфогенного каллуса после переноса на среду MS; б – начало непрямой регенерации из каллуса (стрелками показаны точки регенерации из каллуса); в – полученные регенеранты с признаками витрификации; г – Populus F₁ через 3 недели после отделения от калуса и переноса на среду MS. Масштаб 0,5 см

Разрастающийся каллус субкультивировали на свежую питательную среду каждые 3 недели. После 4 пассажа рост каллуса прекратился, и отмечались активные процессы непрямого морфогенеза из каллусных тканей (рис. 4 б). Формировавшиеся растения имели признаки обводненности листьев (рис. 4 в). Однако после их отделения от каллуса и переноса на питательную среду MS, по истечении 4 недель признаки витрификации исчезали, а у растений отмечался активный рост и хорошее укоренение (рис. 4 г).

Заключение

По   результатам    проведенного исследования разработан простой и эффективный протокол регенерации гибрида тополя Populus deltoides Marshall × Populus alba L. путем непрямого морфогенеза из каллусных тканей в культуре in vitro. Активная индукция и формирование компактного первичного каллуса были достигнуты при невысоких концентрациях (0,5-1 мг/л) ТДЗ на листовых эксплантах. Для остановки ростовых процессов и формирования морфогенных зон полученный каллус культивируется на среде MS, дополненной ПЭГ 2 % в течение 14 дней с последующим субкультивированием на безгормональной питательной среде для непрямой регенерации побегов. Полученные регенераты активно росли и укоренялись после их отделения от каллуса и переноса на свежую среду MS.

Данный протокол может быть использован для проведения дальнейших исследований по тканевой селекции и отбора устойчивых форм Populus F к различным абиотическим стресс-факторам.

Финансирование. Работа выполнена в рамках государственного задания НИР ФНЦ агроэкологии РАН № 122020100427-1 «Разработать научные основы сохранения и воспроизводства ценных генотипов древесных и кустарниковых растений в культуре in vitro».

Авторский вклад. Авторы настоящего исследования принимали непосредственное участие в планировании, выполнении и анализе данного исследования, ознакомились и одобрили представленный окончательный вариант.

Конфликт интересов.  Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Author’s contribution. Authors of this research paper have directly participated in the planning, execution and analysis of this study. Authors of this paper have read and approved the final version submitted.

Conflict of interest.  Authors declare no conflict of interest.

About the authors

Nadezhda G. Fomenko

Federal Scientific Centre of Agroecology, Complex Melioration and Protective Afforestation of the Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: fomenko-n@vfanc.ru
ORCID iD: 0000-0002-0783-6447

Postgraduate student

Russian Federation, 400062, Universitetskiy Prospekt 97, Volgograd

Olga O. Zholobova

Federal Scientific Centre of Agroecology, Complex Melioration and Protective Afforestation of the Russian Academy of Sciences

Email: info@vfanc.ru
ORCID iD: 0000-0002-1594-4181

Cand. Sci. (Biol.), Leader Researcher, Laboratories of Biotechnology

Russian Federation, 400062, Universitetskiy Prospekt 97, Volgograd

References

Supplementary files