Геном митохондрий штамма Chlorella sp. BAC9706, выделенного из озера Байкал

Полный текст

1. Введение

Байкал — уникальное древнее олиготрофное пресноводное озеро — самое глубокое, самое дренее и самое большое по объему в мире. Озеро имеет необычную климатическую среду и удивительное разнообразие эндемичной флоры и фауны. Автотрофный пикопланктон играет значительную роль в производстве первичного органического вещества. Летом пикопланктон обеспечивает 60–90% всей первичной продукции в озере Байкал (Votintsev et al., 1975; Bondarenko and Guselnikova, 1989; Nagata et al., 1994). Наибольший вклад в биомассу фитопланктона вносят диатомовые и золотистые водоросли (Bondarenko et al., 2017), тогда как зеленые водоросли Chlorophyta редки и представлены несколькими видами, а водоросли рода Chlorella отмечены лишь спорадически. Так, авторы сообщали о подледном развитии Chlorella sp. в озере Байкал (Kozhova, 1959; 1987, Nagata et al., 1994). Недавно было показано, что в 2020 г. подо льдом доминировали хлореллоподобные зеленые водоросли, а на всех исследованных станциях Иркутского водохранилища, опосредованно прилегающего к озеру Байкал, обнаружена Chlorella vulgaris Beijerinck. (Bashenkhaeva et al., 2020; Firsova et al., 2023). Массовая гибель эндемичных губок Lubomirskia baikalensis началась в Байкале в 2011 г. (Belikov et al., 2019). Ранее нами было показано, что существенные изменения произошли в микробных сообществах губки L. baikalensis и культуре клеток примморф. Выявлены существенный сдвиг микробных сообществ и массовая гибель основных симбиотических зеленых водорослей Choricystis и их частичная замена другими водорослями в сообществах губок. (Belikov et al., 2019; Chernogor et al., 2020).

Проект последовательности генома штамма Chlorella sp. BAC9706 (Petrushin et al., 2020) был подготовлен для расширения наших молекулярно-биологических знаний об этих микроводорослях и для сравнения их с эндосимбиотическим штаммом водоросли в будущем. В этом исследовании мы собрали полный митохондриальный геном штамма микроводоросли BAC9706, морфологически похожего на водоросли типа Chlorella.

2. Материалы и методы

2.1. Секвенирование и сборка ДНК

Геномная ДНК была выделена, как описано ранее (Petrushin et al., 2020), и секвенирована с использованием платформы Illumina MiSeq. Проект сборки был создан с использованием SPAdes v. 3.15.4 (Bankevich et al., 2012). Этот проект сборки содержал 5837 контигов со значением N50 44 654 п.н., а самый большой контиг имел длину 317 606 п.н.

Полученные контиги полногеномной сборки были выровнены с референсными геномами, полученными из NCBI, с использованием BLASTn для идентификации митохондриального контига.

2.2. Аннотация митогенома

Для аннотации генома мы использовали инструмент GeSeq (Tillich et al., 2017) с параметрами по умолчанию для генов, кодирующих белок, тРНК и рРНК с NC_045362 последовательности штамма Chlorella vulgaris NJ-7 в качестве референса для митохондриального генома. Гены, кодирующие белок, были проверены вручную с помощью выравнивания гомологичных митогеномов из других штаммов Chlorella vulgaris с использованием поиска BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Белки, кодируемые в интронах (orf), были идентифицированы путем перевода нуклеотидной последовательности в последовательность белка с использованием инструмента перевода со стандартными генетическими кодами (https://web.expasy.org/translate/). Полная последовательность митохондриальной ДНК была загружена в базу данных GenBank (номер доступа PQ043348). Для визуализации геномных карт использовался OGDRAW (Greiner et al., 2019), для подготовки файлов для отправки в Genbank мы использовали GB2sequin (https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/GenBank2Sequin.html) (Lehwark and Greiner, 2019).

2.3. Филогенетический анализ

Для определения филогенетической связи рода Chlorella было построено дерево максимального правдоподобия с использованием MEGA11 (Tamura et al., 2021). Все доступные в настоящее время последовательности полных хорошо аннотированных митохондриальных геномов, принадлежащих к порядку Chlorellales, были выбраны из NCBI. Из них мы извлекли все кодирующие белок последовательности, выполнили выравнивания и объединили их. Для улучшения выравниваний были удалены последовательности из удаленных таксонов. Окончательное филогенетическое дерево основано на последовательностях митохондриальных белков, представляющих 31 конкатенированный кодирующий белок митохондриальный ген (3 из 34 аннотированных генов, кодируемых интронами, были исключены из анализа).

3. Результаты и обсуждение

3.1. Нуклеотидный состав и структура генома

Полный митохондриальный геном Chlorella sp. BAC9706 был идентифицирован как кольцевая двухцепочечная молекула длиной 90770 п.н. и расположен между родственными штаммами UTEX259 (98062 п.н.) и NJ-7 (87477 п.н.). Нуклеотидный состав штамма Chlorella sp. BAC9706 составляет 35,2 % A, 35,0 % T, 15,1 % G и 14,6 % C, с более высоким смещением AT (70,2 %). Содержание AT в митогеноме штамма BAC9706 было немного выше, чем у двух родственных штаммов, и составило 70,0 % (Таблица 1).

 

Таблица 1. Распределения нуклеотидов в штаммах.

Нуклеотиды	BAC9706		UTEX259		NJ-7
	Число, п.н.	%	Число, п.н.	%	Число, п.н.	%
Аденин (A)	31978	35.2	34356	35.0	30602	35.0
Цитозин (C)	13285	14.6	14462	14.7	12883	14.7
Гуанин (G)	13728	15.1	14965	15.3	13348	15.3
Тимин(T)	31779	35.0	34279	35.0	30644	35.0
Пурины (A+G)	45706	50.4	49321	50.3	43950	50.2
Пиримидины(C+T)	45064	49.6	48741	49.7	43527	49.8
C + G	27013	29.8	29427	30.0	26231	30.0
A + T	63757	70.2	68635	70.0	61246	70.0
Общая длина	90770		98062		87477

 

Митохондриальный геном штамма BAC9706 содержит 34 гена, кодирующих белки (PCG), 27 генов тРНК и 3 гена рРНК. Из них в общей сложности 19 PCG кодируются на тяжелой (H) цепи, а 15 генов расположены на легкой (L) цепи (Рис. 1). Общая длина генов, кодирующих белки, составляет 26969 п.н., что составляет 29,7% от всего митохондриального генома. Порядок генов в митохондриальном геноме идентичен порядку генов двух родственных штаммов хлореллы.

 

Рис.1. Карта митохондриального генома штамма Chlorella sp. BAC9706.

 

Гены, кодирующие белки, включают 13 для рибосомальных белков (rpl5-6, 16, rps2-4, 7, 10-14, 19), 9 для НАД(Ф)Н-хинон оксидоредуктаз (nad1–7, 9 и nad4L), 5 для АТФ-синтаз (atp1, atp4, atp6, atp8 и atp9), 3 для coxs (cox1–3), 1 для cob и 3 orf для предполагаемых белков. Были идентифицированы гены транспортной РНК для всех 20 аминокислот, в которых тРНК-Met, тРНК-Leu триплицированы, а тРНК-Ser, тРНК-Arg и тРНК-Gly дублированы. Все PCG имеют типичный инициирующий кодон ATG и стоп-кодон TAA, за исключением rps13, rps14, atp8, atp9, cox2, nad3, которые используют стоп-кодон TAG. Среди генов, кодирующих белок, nad5 является самым длинным геном с длиной 2019 п.н., в то время как самым коротким является ген atp9 с длиной 225 п.н. Количество оснований в 13 PCG следует схеме A (35,2%) > T (35,00%) > G (15,1%) > C (14,6%), что позволяет предположить, что AT более предпочтителен в PCG.

3.2. Филогенетический анализ

Филогенетический анализ с использованием митохондриальных геномов видов Chlorellales показал, что штамм BAC9706 тесно связан с другими штаммами C. vulgaris - UTEX259, NJ-7, ITBBA3-12, KNUA007, и они сгруппированы в линию Chlorella со 100% поддержкой бутстрепа (Рис. 2).

 

Рис.2. Филогенетическое дерево максимального правдоподобия штамма Chlorella sp. BAC9706 на основе митохондриальных конкатенированных генов, кодирующих белок, из таксонов Chlorellales.

 

3.3. Выравнивание всего митогенома

Анализ выравнивания всего генома для трех штаммов C. vulgaris - UTEX259, NJ-7 и Chlorella sp. BAC9706 (Рис. 3) показывает следующие основные различия в митохондриальных геномах: в штамме UTEX259 интрон гена cox1 содержит orf441, который отсутствует в двух других геномах; существенные различия находятся в гене, кодирующем 23S рРНК, и в прилегающей области, аналогично, низкая консервативность наблюдается рядом с геном, кодирующим 16S рРНК.

 

Рис.3. Выравнивание целых геномов для трех штаммов Chlorella - UTEX259 (MK948103), NJ7 (NC_045362) и Chlorella sp. BAC9706 (PQ043348). CDS показаны желтым цветом, рРНК - розовым, а тРНК - синим. Светло-зеленый линейный график показывает сохранение соответствующей области выравнивания.

 

Таким образом, основные различия между тремя близкородственными штаммами связаны с межгенными областями, близкими к генам рРНК.

4. Выводы

В этом исследовании мы успешно собрали и проанализировали полный митохондриальный геном зеленых водорослей Chlorophyta озера Байкал. Полногеномное секвенирование следующего поколения зеленых водорослей Chlorella-like и биоинформатический анализ выявили кольцевую двухцепочечную молекулу с типичным набором митохондриальных генов.

Построенное филогенетическое дерево однозначно указывает на то, что штамм Chlorella-like BAC9706 является одним из представителей вида водорослей Chlorella vulgaris, байкальского экотипа C. vulgaris.

Благодарности

Выражаем благодарность Д. Кузьмину, В. Шарову, К. Крутовскому и С. Феранчуку за помощь в администрировании и проведении вычислений на вычислительном кластере. Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках государственного задания № 0279-2021-0011.

Конфликт интересов

Авторы настоящим заявляют, что данная исследовательская работа и написание рукописи соответствовали этическим стандартам, и ни у кого из авторов нет потенциального конфликта интересов. Мы также заявляем, что данное исследование не финансировалось никаким агентством, кроме RSF.

Об авторах

Ю. А. Панова

Сибирский федеральный университет; Лимнологический институт Сибирского отделения Российской академии наук

Email: sergeibelikov47@gmail.com
Россия, Академгородок, 13а, Красноярск, 660036; ул. Улан-Баторская, 3, Иркутск, 664033

Л. И. Черногор

Лимнологический институт Сибирского отделения Российской академии наук

Email: sergeibelikov47@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-9702-306X
Россия, ул. Улан-Баторская, 3, Иркутск, 664033

С. И. Беликов

Лимнологический институт Сибирского отделения Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: sergeibelikov47@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-7206-8299
Россия, ул. Улан-Баторская, 3, Иркутск, 664033

Список литературы

Дополнительные файлы