Quantitative description of the N-protein of the SARS-CoV-2 virus degradation in cells stably expressing it under the influence of new modular nanotransporters

Full Text

При разработке новых противовирусных препаратов, в частности против коронавируса SARS-CoV-2, часто бывает необходимо получение модельных клеточных систем для изучения данного вируса. Для большинства вирусов существуют ключевой белок или белки, без которых невозможно образование вирусного капсида. Примером одного из таких белков может служить нуклеокапсидный белок или N-белок вируса SARS-CoV-2 [1–3]. Так, обычное взаимодействие с этим белком антителоподобных молекул может привести к нарушению образования вирусного капсида, т.е. препятствовать распространению вирусной инфекции [4]. Взаимодействие с данным белком различных препаратов удобнее всего исследовать на клетках, с временной или стабильной экспрессией данного белка. В данной работе в качестве модели были получены две линии клеток, со стабильной экспрессией N-белка вируса SARS-CoV-2. Многие системы доставки широко используют различные антителоподобные молекулы [5]. Так, ранее мы показали, что модульные нанотранспортеры (МНТ), содержащие NC2 монободи [6] к N-белку вируса SARS-CoV-2, способны связываться с этим белком как в растворе, так и в клетке [7]. Если включить в эти МНТ аминокислотную последовательность DPETGEYL, способную с высоким сродством связываться с убиквитинлигазой Keap1 [8], то одновременное связывание МНТ с Keap1 и N-белком предположительно должно привести к деградации N-белка как следствие его убиквитинирования [9]. Настоящая работа посвящена количественному описанию процесса деградации N-белка в клетках под влиянием МНТ, для чего прежде всего была оценена внутриклеточная концентрация N-белка в полученных линиях клеток.

Клетки А549 и А431 со стабильной экспрессией N-белка, слитого с флуоресцентным белком mRuby3 (N-mRuby3), получали путем лентивирусной трансфекции клеток, используя плазмиды pMD2.G, psPAX2 и pHAGE N-mRuby3 (из SARS-CoV-2) IRES puro (Addgene). Рекомбинантные лентивирусные частицы получали контрасфекцией клеток HEK293T в 25 см² флаконе с помощью 2.3 мкг pMD2.G, 4.3 мкг psPAX2 и 10.2 мкг pHAGE N-mRuby3 (from SARS-CoV-2) IRES puro, используя Calcium Phosphate Transfection Reagent (Thermo Fisher Scientific). Суспензию вируса собирали спустя 72 ч после трансфекции. Лентивирус сконцентрировали, используя Lenti-X concentrator (Takara Bio), согласно прилагаемому фирмой протоколу. Клетки аденокарциномы легких человека А549 и эпидермоидной карциномы человека А431 были рассеяны в 24-луночные плашки (1 ∙ 10⁴ клеток на лунку) за один день перед вирусной инфекцией. Для осуществления лентивирусной трансфекции лентивирусные частицы добавлялись в культуральную среду, содержащую 10 мкг/мл polybrene (Sigma-Aldrich). Стабильные клеточные линии отбирали на среде, содержащей 1 мкг/мл пиромицина (Acros Organics). Наличие трансфекции клеток слитым белком N-mRuby3 определяли как визуально, с помощью конфокальной микроскопии в канале mRuby3, используя мультифотонный сканирующий микроскоп LSM 510 META NLO (Carl Zeiss, Германия) и объектив с увеличением 20´ (NA 0.4), так и с помощью вестерн-блота с антителами на N-белок (PA5-116894, Invitrogen) (рис. 1а).

 

Рис. 1. Вестерн-блот с антителами на N-белок вируса SARS-CoV-2 для лизатов трансфицированных N-mRuby3 клеток А549 (1) и клеток А431 (2) и рекомбинантного N-белка концентраций: 200 нМ (3), 600 нМ (4) и 1000 нМ (5). М – белковые стандарты (а); калибровочная кривая зависимости суммарной интенсивности полосы на вестерн-блоте от концентрации N-белка (б).

 

Экспрессию МНТ проводили в штамме E. coli Ros(DE3)pLysS. Автоиндукцию экспрессии МНТ проводили инкубацией в течение 48 ч при 18 °C. МНТ выделяли из растворимой фракции [10], а затем очищали аффинной хроматографией на носителе HisTrap FF (Cytiva). Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле продемонстрировал достаточную степень чистоты полученного МНТ (86.6%).

В результате анализа, проведенного так же, как это описано в [11], 69–87 изображений открепленных от подложки клеток были определены объемы клеток и их ядер; они дали следующие значения: объемы клеток – 1814 ± 87 и 1450 ± 37 мкм³, объемы ядер – 374 ± 28 и 160 ± 7 мкм³ для клеток А549 и А431 соответственно. Слитый белок N-mRuby3 находился преимущественно в цитоплазме клеток А549 и А431. Объемы цитоплазмы клеток составляли 1439 ± 91 и 1289 ± 38 мкм³ для клеток А549 и А431 соответственно. Эти размеры использовали в дальнейшем для расчета концентрации N-mRuby3 в цитоплазме.

Полученные клетки А549 и А431 собрали с подложки с помощью обработки трипсином и последующего центрифугирования. Затем клетки суспендировали в 100 мкл фосфатного буфера (рН 8.0), содержащего cOmplete (EDTA free protease inhibitor cocktail, 11873580001, www.sigmaaldrich.com) и 10 мМ EDTA. Количество клеток в изучаемых образцах измеряли на проточном цитофлуориметре MACSQuant Analyzer (Miltenyi Biotec GmbH, Франция). Клетки были лизированы тремя циклами замораживания в жидком азоте-оттаивания при 37 °C. При лизисе клеток N-белок выходит из них и распределяется во всем объеме образца. Отношение объема образца к суммарному объему цитоплазмы всех клеток, которые были в образце до лизиса, т.е. так называемый коэффициент разбавления, было 126–280 и 197–371 для клеток А549 и А431, соответственно (по 3–4 образца с разной концентрацией клеток).

Измерение концентрации белка N-mRuby3 в лизатах клеток А549 и А431 проводили, с помощью калибровочных растворов N-белка известных концентраций. Используемый для этих целей N-белок получали и очищали, как описано в [7]; чистота N-белка составила 98.9%. Полученные лизаты клеток А549 и А431 наносили на полиакриламидный гель вместе с N-белком известной концентрации. После электрофореза проводили иммуноблоттинг: образцы переносили на 0.22-мкм нитроцеллюлозную мембрану и прокрашивали антителами на N-белок и вторичными антителами goat-antirabbit+Peroxidase (G21234, ThermoFisher Scientific) (см. рис. 1а). По известной концентрации N-белка строили калибровочные зависимости (см. рис. 1б), а по ним рассчитывали концентрацию N-белка в изучаемых образцах. Зная коэффициент разбавления белка N-mRuby3 при лизисе клеток и концентрацию N-белка в лизатах, рассчитали концентрацию N-mRuby3 в цитоплазме клеток: 19.0 ± 1.3 и 9.0 ± 1.8 мкМ для клеток А549 и А431 соответственно.

Различия в концентрациях N-mRuby3 в клетках А549 и А431 хорошо заметны при флуоресцентной их микроскопии: интенсивность флуоресценции клеток А549 заметно выше, чем клеток А431. Если рассчитать среднюю флуоресценцию mRuby3 в области клеток и вычесть из нее среднюю флуоресценцию шумового сигнала (для мест, где нет клеток), то отношение флуоресценции mRuby3 для клеток А549 к флуоресценции клеток А431 составит 1.6 ± 0.2. Это близко к определенному нами отношению концентраций N-mRuby3 для этих двух линий клеток (2.1 ± 0.4). Таким образом, различие флуоресценции клеток А549 и А431 отражает различие концентраций белка N-mRuby3 в этих клетках.

За процессом деградации слитого белка N-mRuby3 в клетках А431 и А549 наблюдали с использованием проточной цитофлуориметрии на приборе CytoFLEX S (Beckman Coulter) MACSQuant Analyzer (Miltenyi Biotec, Франция) в канале флуоресценции 564–606 нм, флуоресценцию возбуждали лазером с длиной волны 561 нм. Клетки с временной экспрессией белка N-mRuby3 инкубировали с 500 нМ МНТ в течение заданного времени, отмывали, снимали с подложки и изучали на проточном цитофлуориметре. В Таблице показаны значения флуоресценции клеток А431 и А549 при различных временах инкубации с МНТ. Считая, что падение флуоресценции обусловлено деградацией белка N-mRuby3, и зная концентрации N-белка в изучаемых линиях клеток, можно рассчитать зависимость концентрации N-белка, подвергающегося деградации, от времени инкубации с МНТ (рис. 2). Оказалось, что для клеток А431 и А549 эти зависимости дают одну и ту же начальную скорость деградации N-белка, равную 84 ± 7 нМ/ч (рис. 2). Следует отметить, что реальная скорость деградации N-белка может быть больше, так как флуоресцентный белок mRuby3, как и другие флуоресцентные белки, может деградировать не полностью [12], а значит, даже после деградации возможна остаточная флуоресценция mRuby3.

 

Рис. 2. Зависимость между концентрацией N-белка, подвергающегося деградации, и временем инкубации с 500 мМ МНТ клеток А431 и А549, стабильно экспрессирующих N-белок, слитый с mRuby3. Указаны средние значения с соответствующей среднеквадратичной ошибкой (n = 8–17).

 

Таблица 1. Относительная флуоресценция клеток А431 и А549 (флуоресценция клеток, к которым не добавлялся МНТ, была принята за 100%) при их инкубации различные времена с 500 нМ МНТ. Указаны средние значения с соответствующей среднеквадратичной ошибкой (n = 8–17).

Время инкубации, ч	А431	А549
0	100.00 ± 0.48	100.00 ± 0.77
15	86.04 ± 3.31	94.89 ± 2.44
24	74.63 ± 3.41	89.20 ± 1.36
39	60.55 ± 1.59	85.69 ± 1.30
48	63.35 ± 1.94	88.43 ± 1.11

 

Таким образом, в предложенной работе были получены линии клеток А431 и А549 со стабильной экспрессией N-белка, слитого с флуоресцентным белком mRuby3. МНТ, добавленный к этим клеткам, вызывал деградацию N-белка. Была определена начальная скорость деградации N-белка в клетках, и показано, что она одинакова для клеток А431 и А549. Предложенные МНТ могут стать основой будущего противовирусного препарата, а сам подход к количественному анализу процесса деградации можно применить для анализа эффективности широкого класса препаратов, направленных на подавление активности различных вирусов.

Источники финансирования

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 21-14-00130). Авторы выражают благодарность Бунину Е. С. за помощь в выполнении вестерн-блоттинга и Сабурову А. С. за помощь в выделении белков. Эксперименты были выполнены с использованием оборудования Центра коллективного пользования ИБГ РАН.

Соблюдение этических стандартов

В данной работе отсутствуют исследования человека или животных.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

Y. V. Khramtsov

Institute of Gene Biology, RAS

Author for correspondence.
Email: alsobolev@yandex.ru
Russian Federation, Moscow

A. V. Ulasova

Institute of Gene Biology, RAS

Email: alsobolev@yandex.ru
Russian Federation, Moscow

T. N. Lupanova

Institute of Gene Biology, RAS

Email: alsobolev@yandex.ru
Russian Federation, Moscow

G. P. Georgiev

Institute of Gene Biology, RAS

Email: alsobolev@yandex.ru

Academician

Russian Federation, Moscow

A. S. Sobolev

Institute of Gene Biology, RAS; Lomonosov Moscow State University

Email: alsobolev@yandex.ru

Corresponding Member

Russian Federation, Moscow; Moscow

References

Supplementary files