Effect of chromatin structure modifiers on the trans-acting heterochromatin position effect in Drosophila melanogaster

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

The heterochromatin position effect is manifested in the inactivation of euchromatin genes transferred to heterochromatin. In chromosomal rearrangements, genes located near the new eu-heterochromatin boundary in the rearrangement (cis-inactivation) and, in rare cases, genes of a region of the normal chromosome homologous to the region of the eu-heterochromatin boundary of the chromosome with the rearrangement (trans-inactivation) are subject to inactivation. The In(2)A4 inversion is able to trans-inactivate the UAS-eGFP reporter gene located on the normal chromosome. We knockdown a number of chromatin proteins using temperature-controlled RNA interference and investigated the effect of knockdown on trans-inactivation of the reporter. We found suppression of trans-inactivation by knockdowns of Su(var)2-HP2, a protein that binds to the key heterochromatin protein HP1a, SAYP, a subunit of the chromatin remodelling complex, and Eggless histone methyltransferase (SETDB1), which introduces a H3K9me3 histone mark, recognized by the HP1a protein. The method of studying the effects of gene knockdown on heterochromatin position effects presented in this work is of independent methodological interest.

Full Text

Введение

Гетерохроматиновый эффект положения (ЭП) приводит к изменениям структуры хроматина (гетерохроматинизации) и нарушениям экспрессии эухроматиновых генов при переносе к гетерохроматину. Хромосомная инверсия In(2)A4 (далее – A4) вызывает ЭП генов, расположенных рядом с новыми эу-гетерохроматиновыми границам (цис-инактивация), а также репортерных трансгенов, расположенных на гомологичной неперестроенной хромосоме (транс-инактивация) [1].

При цис-инактивации репрессия вызывается изменениями структуры хроматина, распространяющимися от гетерохроматина путем линейной самосборки комплекса белков и модификаций гистонов, включающего белок HP1a, узнающий вносимую метилтрансферазой Su(var)3-9 модификацию гистона H3K9me2/3 [2]. Транс-действующий эффект положения приводит к изменениям структуры хроматина и инактивации генов нормальной хромосомы в гетерозиготе с перестройкой. Предполагается, что транс-инактивация возникает в результате затягивания района нормальной хромосомы в гетерохроматиновый компартмент (область конденсированного хроматина внутри ядра с высокой концентрацией белков гетерохроматина) за счет соматической конъюгации гомологов [1, 3–5]). Транс-инактивация предполагает образование гетерохроматина de novo, ее молекулярные механизмы должны отличаться от цис-инактивации [1, 6], обзоры см. [2, 7, 8]. Различие механизмов цис- и транс-инактивации предполагает наличие факторов, влияющих только на транс-инактивацию. Такие факторы были обнаружены в ходе анализа эффектов мутаций генов-модификаторов ЭП на вызываемую A4 транс-инактивацию репортерного гена mini-white [1]. Мутации модификаторов ЭП Su(var)2-5 (HP1a), Eggless (SETDB1), Su(var)3-1 (JIL-1), Su(var)3-6 (Pp1-87B), Su(var)3-7 подавляли цис- и транс-инактивацию, тогда как мутации в гене SAYP, кодирующем субъединицу комплекса ремоделирования хроматина SWI/SNF, и в гене Ago2, компоненте системы РНК-интерференции и белке хроматина, специфически влияли на транс- но не на цис-инактивацию [1]. Метилтрансфераза гистонов Su(var)3-9, один из основных компонентов гетерохроматина, не влияла заметно на вызываемые A4 цис- и транс-инактивацию [1].

Ранее было показано [9, 10], что ген eGFP под контролем элемента UAS (UAS-eGFP), расположенный на нормальной хромосоме в области, гомологичной району эу-гетерохроматиновой границы A4, транс-инактивируется в гетерозиготе с A4. Tранс-инактивация UAS-eGFP в мальпигиевых сосудах имеет характерный для ЭП мозаичный характер (происходит только в части клеток, в других сохраняется активность гена). Влияние уровня экспрессии UAS-eGFP на разных стадиях развития на степень его транс-инактивации было исследовано при помощи комбинации активатора GAL4 и его термочувствительного репрессора GAL80ts [11]. Обнаружено, что высокий уровень транскрипции репортера на стадии эмбриона препятствует транс- инактивации на более поздних стадиях развития [9].

Для проверки роли ряда компонентов хроматина в транс-активации мы измерили степень репрессии гена-репортера UAS-eGFP под влиянием A4 на фоне нокдауна генов потенциальных модификаторов ЭП: SAYP, eggless, Polybromo, XNP, CG2116, E(var)3-9 и Su(var)2-HP2. Гены SAYP и eggless были выбраны для исследования, так как уже имелись данные об участии продуктов этих генов в транс-инактивации гена-репортера mini-white [1]. Polybromo и SAYP входят в ремоделирующий хроматин комплекс семейства SWI/SNF, белок Xnp/(dATRX) является АТФ-хеликазой, компонентом другого комплекса ремоделирования хроматина и взаимодействует с HP1a [12], CG2116 является транскрипционным фактором, компонентом междисков, а гены E(var)3-9 и Su(var)2-HP2 известны как модификаторы ЭП. E(var)3-9 – энхансер (необходим для противодействия гетерохроматиновой репрессии), Su(var)2-HP2 – супрессор, структурный компонент гетерохроматина.

Нокдаун исследуемых генов осуществляли при помощи GAL4-зависимых трансгенных конструкций UAS-RNAi, производящих двуцепочечную РНК к гену-мишени, и комбинации GAL4 и GAL80ts. Результаты нокдаунов показали участие в установлении транс-инактивации продуктов генов SAYP, Su(var)2-HP2 и метилтрансферазы гистонов eggless. Polybromo и E(var)3-9 участвуют в нормальной транскрипции UAS-eGFP.

Материалы и методы

Методы классической генетики. Культивирование, отбор и скрещивания мух проводили по стандартным протоколам.

Линии мух. Следующие линии мух были использованы для скрещиваний:

w67c23; In(2)A4/CyO содержит вызывающую транс-инактивацию хромосомную инверсию In(2)A4 (далее – A4), получена в ОМГК ИМГ РАН [1].

w*; UAS-eGFP/CyO; P{tub-GAL4}LL7; P{tubP-GAL80ts}7/TM3 Sb1 Ser1; содержит ген-репортер eGFP под контролем регуляторного элемента UAS (UAS-eGFP) в положении chr2L:21195077 (релиз генома дрозофилы R6) на хромосоме 2, а также гены GAL4 и GAL80ts под контролем промоторов тубулина на хромосоме 3. Создание линии, равно как и исследование транс-инактивации UAS-eGFP в мальпигиевых сосудах под влиянием In(2)A4, описано ранее [9, 10].

Линии, несущие UAS-RNAi для нокдаунов потенциальных генов – модификаторов транс-инактивации (egg, SAYP, Su(var)2-HP2, XNP, CG2116, E(var)3-9 и Polybromo) были получены из коллекции Transgenic RNAi Project (TRiP, https://fgr.hms.harvard.edu/fly-in-vivo-rnai). UAS-RNAi в составе трансгенов VALIUM10 или VALIUM2 расположен на хромосоме 3 (сайт встраивания attP2). Информация о линиях представлена на рис. 1 и 2.

 

Рис. 1. Система для исследования влияния нокдауна генов – модификаторов эффекта положения на транс-инактивацию репортера UAS-eGFP, вызываемую инверсией In(2)A4: инверсия In(2)A4 вызывает мозаичную инактивацию репортера UAS-eGFP на нормальной хромосоме в мальпигиевых сосудах. Показано положение репортера UAS-eGFP на нормальной хромосоме относительно места разрыва A4 (пунктирная вертикальная линия). Ниже представлена структура инверсии A4, Гх – блоки гетерохроматина, в А4 блок разделен на большой и отделенный малый фрагменты ц – центромера. Цис-действующий эффект положения распространяется на эухроматин от основного и отделенного блоков гетерохроматина (синие стрелки), транс-инактивация влияет на репортер в гомологичной нормальной хромосоме. На фотографиях показана мозаичная экспрессия eGFP (отсутствие флуоресценции в отдельных клетках) при вызываемой In(2)A4 транс-инактивации (eGFP/A4), по сравнению с экспрессией eGFP при той же температуре, но на фоне хромосомы дикого типа (eGFP/+) (а); система для исследования нокдауна генов – модификаторов ЭП на транс-инактивацию (б). Генотип содержит: хромосомы 2 – инверсия A4 в гетерозиготе с нормальной хромосомой с транс-инактивируемым репортером UAS-eGFP; хромосомы 3 – хромосома с генами GAL4 и GAL80ts под тубулиновыми промоторами в гетерозиготе с хромосомой, содержащей трансген UAS-RNAi – источник дцРНК к одному из исследуемых генов-модификаторов (egg, SAYP, Su(var)2-HP2, XNP, CG2116, E(var)3-9 и Polybromo). GAL4 активирует транскрипцию UAS-eGFP, а также UAS-RNAi, вызывая нокдаун модификатора ЭП. GAL80ts инактивирует GAL4, подавляя транскрипцию с UAS-зависимых промоторов, при этом степень подавления снижается при повышении температуры. Нокдаун модификатора ЭП может выражаться в усилении или подавлении транс-инактивации (иллюстрации эффектов приведены на фото справа).

 

Рис. 2. Схема скрещиваний для получения генотипов, использованных для исследования эффектов нокдаунов компонентов хроматина на транс-инактивацию, таблица исследуемых генов и влияние нокдауна разной степени на жизнеспособность мух: ход скрещиваний и использованные в работе генотипы. Получены четыре генотипа, представляющие все возможные комбинации “наличие – отсутствие транс-инактивации” и “наличие – отсутствие нокдауна”. Во всех генотипах присутствуют гены GAL4 и GAL80ts. Отношение флуоресценции репортера в eGFP/A4 к eGFP/+ без UAS-RNAi (UAS-eGFP/A4; tubGAL4 tubGAL80ts/TM6 к UAS-eGFP/CyO; tubGAL4 tubGAL80ts/TM6) показывает уровень транс-инактивации без нокдауна гена-модификатора. Отношение флуоресценции репортера в eGFP/A4; UAS-RNAi к eGFP/+; UAS-RNAi (UAS-eGFP/A4; tubGAL4 tubGAL80ts/UAS-RNAi к UAS-eGFP/CyO; tubGAL4 tubGAL80ts/UAS-RNAi) показывает уровень транс-инактивации при нокдауне исследуемого гена. Отношение уровней транс-инактивации “нокдаун/без нокдауна” определяет степень влияния гена-модификатора на транс-инактивацию (а); влияние нокдауна исследуемых генов на жизнеспособность особей. Степень нокдауна увеличивается при повышении температуры, когда инактивация репрессора GAL80ts повышает концентрацию активного GAL4). Стадии развития обозначены как Л (личинка), К (куколка), В (взрослые). Соответственно, ЛКВ обозначает выживаемость на всех стадиях при данной температуре, ЛК – выживают личинки и куколки, Л – только личинки. В случае нокдауна XNP выживали самцы (б).

 

Регулируемый нокдаун генов-модификаторов эффекта положения. Были получены мухи, содержащие: репортер UAS-eGFP на хромосоме 2 в гетерозиготе с In(2)A4 (опыт) или с нормальной хромосомой (контроль); хромосому 3 с генами GAL4 и GAL80ts в гетерозиготе с хромосомой, несущей трансген UAS-RNAi (Рис. 1б, 2а). Комбинация в одном геноме GAL4 и его термочувствительного репрессора GAL80ts позволяет менять экспрессию генов под контролем UAS путем изменения температуры. GAL80ts полностью активен при 18 °C, денатурирует при 30 °C, в интервале 18–30 °C проявляет промежуточную активность [9, 10]. Сила нокдауна исследуемого гена пропорциональна уровню экспрессии UAS-RNAi, максимальна при 30 °C и минимальна при 18 °C. Так как сильный нокдаун имел летальный эффект, была подобрана температура, при которой нокдаун максимален, но мухи сохраняли жизнеспособность до взрослой стадии. При температуре 24 °C количество мРНК генов- модификаторов снижалось примерно в 2 раза, и наблюдалась выраженная транс-инактивация [9]. Схемы скрещиваний для получения нужных генотипов приведены на рис. 2а, информация о генах-модификаторах и эффектах нокдауна при разных температурах на жизнеспособность мух – на рис. 2б.

 

Рис 3. Попарное сравнение интенсивности флуоресценции клеток мальпигиевых сосудов у мух с UAS-eGFP в норме и при транс-инактивации без нокдауна (–RNAi) и при нокдауне одного из белков (–Xnp, –SAYP, –CG2116, –olybromo, –eggless, –E(var)3-9, –HP2).

 

Измерение уровня экспрессии eGFP в мальпигиевых сосудах. В мальпигиевых сосудах мозаичный ЭП хорошо выражен, а морфология ткани (крупные изолированные клетки, формирующие однослойные трубки) облегчает количественные измерения. Флуоресценцию eGFP измеряли в отдельных клетках мальпигиевых сосудов двухдневных мух, развивавшихся при 24 °C. Измерения проводили, как описано в [9]. Для каждого изображения мальпигиевого сосуда было получено 50–200 записей измерений флуоресценции eGFP, соответствующих отдельным клеткам. Данные были использованы для построения графиков распределений интенсивности флуоресценции eGFP и подсчета статистики в программах MS Excel и Knime (https://www.knime.com). В приложении Knime была создана последовательность обработки данных, состоящая из загрузки исходных измерений, удаления выбросов, построения скрипичных диаграмм и получения базовой статистики. Результаты получены для 2–4 экспериментов.

Оценку количества мРНК репортера UAS-eGFP проводили также при помощи количественной ПЦР. Данные количественной ПЦР коррелировали с данными по флуоресценции, хотя разницы по мРНК между генотипами оказалась ниже (не представлено). Прямое сравнение уровня флуоресценции eGFP и количества его мРНК затруднено, так как: 1) флуоресценцию измеряли в мальпигиевых сосудах, а мРНК выделяли из целых мух; 2) использованный способ определения относительных количеств мРНК eGFP (относительно мРНК Rpl32) не позволяет учесть возможные изменения экспрессии Rpl32 на фоне нокдауна.

Измерение содержания мРНК методом количественной ПЦР. РНК выделяли из взрослых мух возрастом 2 дня с использованием реактива Trizol, проводили обратную транскрипцию и количественную ПЦР. Относительные количества мРНК репортерного гена eGFP и генов-модификаторов определяли на ПЦР-амплификаторе с детекцией в реальном времени ДТ-96 (ДНК-технология) методом ΔCq относительно количества мРНК гена рибосомального белка Rpl32. Рассчет относительных количеств мРНК проводили в программе RealTime PCR от производителя прибора и Excel. Протокол выделения подробно описан в [10].

Результаты и обсуждение

Данные измерений транс-инактивации на фоне нокдаунов белков хроматина представлены на рис. 3.

Пары слева направо (подписи внизу рисунка): отсутствие нокдауна (–RNAi), нокдаун одного из хроматиновых белков (остальные столбцы, указан выключаемый ген). В каждой паре (+) – норма (нет транс-инактивации), (A4) – транс-инактивация. Гистограмма, показывающая степень транс-инактивации репортера (a). Степень транс-инактивации рассчитана как Log2 отношения медианной интенсивности флуоресценции в UAS-eGFP/A4 (A4) к UAS-eGFP/+ (+), для контроля без нокдауна (-RNAi) флуоресценция снижена в ~ 6 раз. Гистограмма, показывающая влияние нокдауна на транс-инактивацию (б). Влияние нокдауна рассчитывается как Log2 отношения степени транс-инактивации при нокдауне к степени транс-инактивации в контроле (–RNAi). Положительные значения (оранжевые столбики) означают подавление транс-инактивации (уменьшение репрессии репортера), отрицательные (синие столбики) – усиление. В случае нокдауна Su(var)2-HP2 транс-инактивация ослабевает в ~3.5 раза. Скрипичные диаграммы, показывающие распределение интенсивностей флуоресценции в мальпигиевых сосудах (в). Графики показывают симметрично отраженную кривую распределения результатов измерений, внутри кривой – “ящик с усами”, диаграмма с квартилями и выбросами, для тех же измерений. Ось y – интенсивность флуоресценции в условных единицах. Зелeная линия – медианное значение интенсивности флуоресценции для контроля (UAS-eGFP/+; без нокдауна и транс-инактивации), черная линия – медианное значение интенсивности флуоресценции при транс-инактивации без нокдауна. На графиках видно: транс-инактивацию (столбик –RNAi, разница между + и A4), влияние нокдауна на нормальную транскрипцию репортера (увеличение экспрессии в образцах без транс-инактивации (+) в –SAYP, –egg и снижение в –Polybromo и –E(var)3-9) и влияние нокдауна на степень транс- инактивации (изменения отношения A4 к + внутри столбца). Нокдауны SAYP, Eggless и HP2 заметно снижают транс-инактивацию, тогда как нокдауны Xnp, CG2116 и Polybromo ее слабо усиливают. Нокдаун E(var)3-9 на транс-инактивацию не влиял

Обнаружено, что нокдауны генов СG2116 (кодирует белок междисков политенных хромосом) и XNP (последний отвечает за поддержание стабильности центромер и теломер, правильную локализацию HP1a и встраивание в хроматин вариантного гистона H3.3) не оказывают заметного влияния на степень транс-инактивации репортера или на уровень его экспрессии в целом.

Нокдаун метилтрансферазы Eggless/SETDB1 приводит к подавлению транс-инактивации UAS-eGFP, аналогично ранее описанному подавлению транс-инактивации mini-white под влиянием A4 при мутации в eggless [1]. Интересно, что метилтрансфераза Su(var)3-9 не влияла на репрессию репортера mini-white в той же системе [1]. Eggless, как и Su(var)3-9, вносит репрессорную модификацию H3K9me3 и, возможно, в случае A4 Eggless функционально заменяет Su(var)3-9. Нокдаун Eggless также приводит к повышению уровня экспрессии UAS-eGFP в норме (без влияния A4), это указывает на роль Eggless в контроле нормальной транскрипции UAS-eGFP.

Любопытным представляется результат нокдауна Polybromo и SAYP: оба белка являются субъединицами комплекса ремоделирования хроматина PBAP (один из SWI/SNF комплексов) и физически взаимодействуют между собой [13-15]. Комплексы ремоделирования (ремоделеры), при их склонности к сохранению консервативной архитектуры из нескольких субъединиц, также описываемых как консервативные, в действительности достаточно разнообразны функционально. Некоторые из них формируют хроматин промоторов генов [14], но все они объединяются в одно большое семейство ремоделеров SWI/SNF. На примере элегантного и детального исследования ремоделера млекопитающих cBAF семейства SWI/SNF было обнаружено, что его субъединицы представляют собой белки, несущие районы протяженных IDR [16], склонных к формированию белок-белковых взаимодействий. Работа продемонстрировала роль IDRs в ремоделировании хроматина. При этом онкогенные факторы часто представляют собой мутантные варианты субъединиц сВАF. Нокдаун Polybromo не оказывает достоверного влияния на транс-инактивацию (но вызывает снижение экспрессии репортера в опыте и контроле, что указывает на участие белка в активации транскрипции UAS-eGFP в норме), а нокдаун SAYP вызывает сильное подавление транс-инактивации. Видимо, SAYP имеет отдельную функцию в установлении гетерохроматиновой репрессии, реализуемую независимо от Polybromo. Нокдаун SAYP также вызывал дерепрессию UAS-eGFP в норме, это указывает на роль SAYP в формировании репрессированного эухроматина.

Нокдаун Su(var)2-HP2 подавляет транс-инактивацию репортера примерно в той же степени, что и SAYP. Белок Su(var)2-HP2 взаимодействует с ключевым белком гетерохроматина НР1a, который рассматривается как определяющий компактизацию гетерохроматина по механизму фазовой сепарации с участием белков с районами функционально важных неупорядоченных аминокислотных последовательностей (IDRs) [17–19]. В настоящее время механизмы фазовой сепарации рассматриваются как регуляторные при образования разнообразных субклеточных компартментов, необходимых для обеспечения важнейших биологических процессов, перечисление которых можно найти в обзорах [18], осуществляемых с участием функционально важных IDRs [20].

Таким образом, среди исследованных генов Su(var)2-HP2, SAYP и eggless необходимы для транс-действующей гетерохроматиновой репрессии. Полученные данные согласуются с ранее имеющейся информацией о роли SAYP в транс-инактивации репортеров mini-white в паре с A4 [1], тем самым указывая на SAYP как универсальный компонент транс-инактивации. Роль Su(var)2-HP2 в процессе ранее не была известна. Участие белков Su(var)2-HP2 и SAYP в процессе транс-инактивации обнаруживает роль в этом явлении белков, содержащих IDRs, и механизмов фазовой сепарации.

Перспективы. Использованный в работе подход может быть применен для исследования роли любых хроматиновых белков в эктопической гетерохроматинизации эухроматина, для этого требуется наличие источника дцРНК к интересующему гену под контролем UAS на хромосоме 3. Комбинация GAL4-GAL80ts позволяет путем изменения температуры, осуществлять нокдаун интересующего гена на любой стадии развития и тем самым исследовать, на каком этапе онтогенеза необходима функция продукта изучаемого гена.

Благодарности

Выражаем благодарность А. Ю. Коневу за ценные замечания.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Источники финансирования

Часть работы, связанная с морфологическим анализом флуоресцентных изображений, была выполнена при финансовой поддержке Российского научного Фонда (грант № 19-74-20178-П). Часть работы, связанная с генетическими исследованиями выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 19-14-00382-П).

Соблюдение этических норм и стандартов

В соответствии с пунктом 3 главы 1 Директивы 2010/63/ЕС от 22.09.2010 г. о защите животных, используемых в научных целях, требования биоэтики не распространяются на объект данного исследования.

×

About the authors

А. А. Solodovnikov

National Research Centre “Kurchatov Institute”

Email: slavrov.defy@gmail.com
Russian Federation, Moscow

S. А. Lavrov

National Research Centre “Kurchatov Institute”

Author for correspondence.
Email: slavrov.defy@gmail.com
Russian Federation, Moscow

A. S. Shatskikh

National Research Centre “Kurchatov Institute”

Email: slavrov.defy@gmail.com
Russian Federation, Moscow

V. A. Gvozdev

National Research Centre “Kurchatov Institute”

Email: slavrov.defy@gmail.com

Academician

Russian Federation, Moscow

References

  1. Abramov Y.A., Shatskikh A.S., Maksimenko O.G., et al. The Differences Between Cis- and Trans-Gene Inactivation Caused by Heterochromatin in Drosophila // Genetics, 2016, Т. 202 №. 1, C. 93–106.
  2. Elgin S.C., Reuter G. Position-effect variegation, heterochromatin formation, and gene silencing in Drosophila // Cold Spring Harb Perspect Biol, 2013, Т. 5 №. 8, C. a017780.
  3. Sass G.L., Henikoff S. Pairing-dependent mislocalization of a Drosophila brown gene reporter to a heterochromatic environment // Genetics, 1999, Т. 152 №. 2, C. 595–604.
  4. Sage B.T., Csink A.K. Heterochromatic self-association, a determinant of nuclear organization, does not require sequence homology in Drosophila // Genetics, 2003, Т. 165 №. 3, C. 1183–1193.
  5. Shatskikh A.S., Abramov Y.A., Lavrov S.A. Trans-inactivation: Repression in a wrong place // Fly (Austin), 2017, Т. 11 №. 2, C. 96-103.
  6. Nisha P., Plank J.L., Csink A.K. Analysis of chromatin structure of genes silenced by heterochromatin in trans // Genetics, 2008, Т. 179 №. 1, C. 359–373.
  7. Politz J.C., Scalzo D., Groudine M. Something silent this way forms: the functional organization of the repressive nuclear compartment // Annu Rev Cell Dev Biol, 2013, Т. 29, C. 241–270.
  8. Grewal S.I.S. The molecular basis of heterochromatin assembly and epigenetic inheritance // Mol Cell, 2023, Т. 83 №. 11, C. 1767–1785.
  9. Солодовников А.А., Гвоздев В.А., Лавров С.А. Высокий уровень транскрипции гена на стадии эмбриона приводит к подавлению его гетерохроматиновой транс-инактивации у взрослых особей Drosophila melanogaster // Биохимия, 2020, Т. 85 №. 4, C. 547–555.
  10. Шацких А.С., Оленкина О.М., Солодовников А.А. и др. Системы регулируемой экспрессии генов как инструмент исследования гетерохроматинового эффекта положения у Drosophila melanogaster // Биохимия, 2018, Т. 83 №. 5, C. 712–723.
  11. Fujimoto E., Gaynes B., Brimley C. J., et al. Gal80 intersectional regulation of cell-type specific expression in vertebrates // Dev Dyn, 2011, Т. 240 №. 10, C. 2324–2334.
  12. Meyer-Nava S., Torres A., Zurita M., et al. Molecular effects of dADD1 misexpression in chromatin organization and transcription // BMC Mol Cell Biol, 2020, Т. 21 №. 1, C. 17.
  13. Nakayama T., Shimojima T., Hirose S. The PBAP remodeling complex is required for histone H3.3 replacement at chromatin boundaries and for boundary functions // Development, 2012, Т. 139 №. 24, C. 4582–4590.
  14. Shidlovskii Y.V., Bylino O.V., Shaposhnikov A.V., et al. Subunits of the PBAP Chromatin Remodeler Are Capable of Mediating Enhancer-Driven Transcription in Drosophila // Int J Mol Sci, 2021, Т. 22 №. 6.
  15. Chalkley G.E., Moshkin Y.M., Langenberg K., et al. The transcriptional coactivator SAYP is a trithorax group signature subunit of the PBAP chromatin remodeling complex // Mol Cell Biol, 2008, Т. 28 №. 9, C. 2920–2929.
  16. Patil A., Strom A.R., Paulo J. A., et al. A disordered region controls cBAF activity via condensation and partner recruitment // Cell, 2023, Т. 186 №. 22, C. 4936–4955 e4926.
  17. Keenen M.M., Brown D., Brennan L.D., et al. HP1 proteins compact DNA into mechanically and positionally stable phase separated domains // Elife, 2021, Т. 10.
  18. Babu M.M. The contribution of intrinsically disordered regions to protein function, cellular complexity, and human disease // Biochem Soc Trans, 2016, Т. 44 №. 5, C. 1185–1200.
  19. Cermakova K., Hodges H.C. Interaction modules that impart specificity to disordered protein // Trends Biochem Sci, 2023, Т. 48 №. 5, C. 477–490.
  20. Banerjee P.R., Holehouse A.S., Kriwacki R., et al. Dissecting the biophysics and biology of intrinsically disordered proteins // Trends Biochem Sci, 2023.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. System for studying the effect of knockdown of position effect modifier genes on trans-inactivation of the UAS-eGFP reporter caused by In(2)A4 inversion: In(2)A4 inversion causes mosaic inactivation of the UAS-eGFP reporter on the normal chromosome in Malpighian vessels. The position of the UAS-eGFP reporter on the normal chromosome relative to the A4 break site is shown (dashed vertical line). Below is the structure of inversion A4, Gx - blocks of heterochromatin, in A4 the block is divided into large and separated small fragments c - centromere. The cis-acting position effect extends to euchromatin from the main and separated blocks heterochromatin (blue arrows), trans-inactivation affects the reporter on the homologous normal chromosome. Photographs show mosaic eGFP expression (lack of fluorescence in individual cells) during In(2)A4-induced trans-inactivation (eGFP/A4), compared to eGFP expression at the same temperature but in a wild-type chromosome background (eGFP/+) (A); system for studying the knockdown of genes – modifiers of EP for trans-inactivation (b). The genotype contains: chromosomes 2 – A4 inversion in a heterozygote with a normal chromosome with a trans-inactivable UAS-eGFP reporter; chromosome 3 – a chromosome with the GAL4 and GAL80ts genes under tubulin promoters in a heterozygote with the chromosome, containing a UAS-RNAi transgene – a source of dsRNA to one of the modifier genes under study (egg, SAYP, Su(var)2-HP2, XNP, CG2116, E(var)3-9 and Polybromo). GAL4 activates transcription of UAS-eGFP as well as UAS-RNAi, causing knockdown of the EP modifier. GAL80ts inactivates GAL4 by suppressing transcription from UAS-dependent promoters, and the degree of suppression decreases with increasing temperature. Knockdown of the EP modifier can be expressed in increased or suppressed trans-inactivation (illustrations of the effects are shown in the photo on the right).

Download (263KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. Scheme of crosses to obtain genotypes used to study the effects of knockdowns of chromatin components on trans-inactivation, a table of the genes studied and the effect of knockdown of varying degrees on the viability of flies: the course of crosses and the genotypes used in the work. Four genotypes were obtained, representing all possible combinations of “presence – absence of trans-inactivation” and “presence – absence of knockdown”. All genotypes contain the GAL4 and GAL80ts genes. The ratio of reporter fluorescence in eGFP/A4 to eGFP/+ without UAS-RNAi (UAS-eGFP/A4; tubGAL4 tubGAL80ts/TM6 to UAS-eGFP/CyO; tubGAL4 tubGAL80ts/TM6) shows the level of trans-inactivation without modifier gene knockdown. Reporter fluorescence ratio in eGFP/A4; UAS-RNAi to eGFP/+; UAS-RNAi (UAS-eGFP/A4; tubGAL4 tubGAL80ts/UAS-RNAi to UAS-eGFP/CyO; tubGAL4 tubGAL80ts/UAS-RNAi) shows the level of trans-inactivation upon knockdown of the gene under study. The ratio of trans-inactivation levels “knockdown/without knockdown” determines the degree of influence of the modifier gene on trans-inactivation (a); the effect of knockdown of the studied genes on the viability of individuals. The extent of knockdown increases with increasing temperature when inactivation of the GAL80ts repressor increases the concentration of active GAL4). Developmental stages are designated as L (larva), K (pupa), V (adults). Accordingly, LKV denotes survival at all stages at a given temperature, LK - larvae and pupae survive, L - only larvae. In the case of XNP knockdown, males survived (b).

Download (431KB)
Indexing metadata
4. Fig. 3. Pairwise comparison of the fluorescence intensity of Malpighian vessel cells in flies with UAS-eGFP under normal conditions and with trans-inactivation without knockdown (–RNAi) and with knockdown of one of the proteins (–Xnp, –SAYP, –CG2116, –olybromo, –eggless , –E(var)3-9, –HP2).

Download (209KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2024 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».