Modular nanotransporters capable of cause intracellular degradation of the N-protein of the SARS-CoV-2 virus in A549 cells with temporary expression of this protein fused with the fluorescent protein mRuby3

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

Modular nanotransporters (MNTs) have been created containing an antibody-like molecule, monobody, to the N-protein of the SARS-CoV-2 virus, as well as an amino acid sequence that attracts the E3 ligase Keap1 (E3BP). This MNT also included a site for cleavage of the E3BP monobody from the MNT in acidic endocytic compartments. It was shown that this cleavage by the endosomal protease cathepsin B leads to a 2.7-fold increase in the affinity of the E3BP monobody for the N-protein. Using A549 cells with transient expression of the N-protein fused with the fluorescent protein mRuby3, it was shown that incubation with MNT leads to a significant decrease in mRuby3 fluorescence. It is assumed that the developed MNTs can serve as the basis for the creation of new antiviral drugs against the SARS-CoV-2 virus.

Full Text

Введение

Необходимость в разработке новых противовирусных препаратов особенно ярко продемонстрировала пандемия коронавируса SARS-CoV-2. Наиболее часто используются низкомолекулярные ингибиторы вирусной активности [1]. Однако их можно подобрать не ко всем белковым мишеням, в отличие от антителоподобных молекул, которые можно получить к практически любому белковому антигену [2, 3]. Не удивительно, что в различных системах доставки биоактивных молекул все чаще используются разные антителоподобные молекулы [4]. Для вируса SARS-CoV-2 в качестве белка-мишени можно выбрать крайне необходимый для сборки вирусного капсида нуклеокапсидный белок, или N-белок [5–7]. К этому белку высокое сродство имеет полученная ранее антителоподобная молекула, монободи (NC2) [8]. Ранее мы разработали модульные нанотранспортеры (МНТ), содержащие в своем составе данное монободи и способные связываться в клетках-мишенях с N-белком [9], в настоящей работе обозначаемые как МНТ0. Следующий вариант МНТ, МНТ1, отличался от МНТ0 тем, что в него была дополнительно включена аминокислотная последовательность DPETGEYL (далее – Е3ВР), способная с высоким сродством связывать убиквитинлигазу Keap1 [10]. Мы предположили, что связывание МНТ1 одновременно с Keap1 и N-белком будет приводить к деградации N-белка как следствие его убиквитинирования [11]. В состав МНТ1, так же как и у МНТ0, был внесен сайт для отщепления Е3ВР-монободи от МНТ1 в закисляемых эндоцитозных компартментах. Настоящая работа посвящена как изучению взаимодействия МНТ1 и расщепленного МНТ1 с N-белком в растворе, так и влиянию МНТ1 на содержание N-белка в клетках А549, временно экспрессирующих этот белок.

Наработку и очистку N-белка и МНТ0 проводили, как это описано в [9]. Сайт-специфическим мутагенезом из МНТ, описанного ранее [9], получили ген, кодирующий МНТ следующего состава: affibody(EGFR)-HisTag-DTox-HMP-FKFL-E3BP-NC2, где affibody(EGFR) – аффибоди к рецептору эпидермального фактора роста, DTox – транслокационный домен дифтерийного токсина, HMP – гемоглобиноподобный белок E. coli, FKFL – сайт расщепления эндосомной протеазой катепсином В, E3BP – аминокислотная последовательность, привлекающая Е3-лигазу Keap1 и NC2 – монободи к N-белку. Экспрессию МНТ1 проводили в штамме E.coli Ros(DE3)pLysS. Автоиндукцию экспрессии МНТ1 проводили инкубацией в течение 48 ч при 18 °C. МНТ1 выделяли из растворимой фракции [12], а затем очищали аффинной хроматографией на носителе HisTrap FF (Cytiva). Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле продемонстрировал достаточную степень чистоты полученного МНТ1 (86.6%).

Для получения расщепленного МНТ1 инкубировали 4 мкМ МНТ1 с 4 мкг/мл активированного катепсина В (Native human Cathepsin B protein (ab90387, Abcam)). Активацию катепсина В проводили, как описано в [14]. Расщепление МНТ1 проводилось при рН 5.5 с добавлением 0.001% SDS, чтобы избежать агрегации МНТ1. Взаимодействие МНТ1 и расщепленного МНТ1 с N-белком изучали так же, как описано в [13], методом термофореза на приборе Monolith NT.115 Series (NanoTemper Technologies GmbH, Германия) в буфере 10 мМ NaH2PO4, 150 мМ NaCl, pH 8.0. N-белок был помечен флуоресцентным красителем AF488, как это описано в [13] и с той же степенью модификации. Трансфекция клеток А549 плазмидой (3–4% трансфицированных клеток), кодирующей N-белок, слитый с флуоресцентным белком mRuby3, осуществлялась по [13].

При фиксированной концентрации N-белка, меченного AF488, (5 нМ) методом термофореза были получены зависимости относительной флуоресценции (за 100% принята флуоресценция до начала термофореза) через 20 с после начала термофореза от концентрации МНТ1 (рис. 1, квадраты) или расщепленного МНТ1 (см. рис. 1, полые треугольники). Для каждого эксперимента получали три-четыре такие зависимости, и весь эксперимент повторяли три-четыре раза. По каждой кривой определяли константу диссоциации комплекса МНТ1 или расщепленного МНТ1 с N-белком, ее усредняли по всем 12–17 кривым и определяли относительную ошибку ее измерения. Константы диссоциации комплексов МНТ1 или расщепленного МНТ1 с N-белком составили 47 ± 3 и 17 ± 4 нМ соответственно. Для расщепленного МНТ1 это значение близко к константе для свободного монободи NC2 (6.7 нМ [8]). Таким образом, расщепление МНТ1 катепсином В приводит к увеличению его сродства к N-белку приблизительно в три раза.

 

Рис. 1. Зависимости относительной интенсивности флуоресценции (за 100% принята интенсивность флуоресценции до начала термофореза) через 20 с после начала термофореза от концентрации МНТ1 или расщепленного МНТ1 при постоянной концентрации N-белка, меченного AF488 (5 нМ). Указана стандартная ошибка определения относительной интенсивности флуоресценции (14–17 повторов).

 

За процессом деградации слитого белка N-mRuby3 в клетках А549 с временной экспрессией данного белка наблюдали с использованием проточной цитофлуориметрии на приборе MACSQuant Analyzer (Miltenyi Biotec, Франция) в канале флуоресценции 571–601 нм, флуоресценцию возбуждали лазером с длиной волны 561 нм. Клетки с временной экспрессией белка N-mRuby3 инкубировали с 500 нМ МНТ1 или МНТ0 в течение заданного времени, отмывали, снимали с подложки и изучали в канале флуоресценции mRuby3 на проточном цитофлуориметре. На рис. 2 показана зависимость флуоресценции клеток А549 от времени инкубации с МНТ1 или МНТ0. На 5 часов средняя флуоресценция клеток А549 достоверно (р < 0.05, U-критерий Манна Уитни) ниже в случае, когда клетки инкубировали с МНТ1, по сравнению с инкубацией с МНТ0. Уменьшение флуоресценции mRuby3 можно связать с деградацией слитого белка N-mRuby3. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что включение в разработанные нами МНТ аминокислотной последовательности, привлекающей Е3-лигазу Keap1, может приводить к деградации N-белка в клетках-мишенях.

 

Рис. 2. Относительная флуоресценция клеток А549 (флуоресценция клеток, к которым не добавлялся МНТ была принята за 100%) при их инкубации различные времена с 500 нМ МНТ1 или 500 нМ МНТ0. Указаны средние значения с соответствующей среднеквадратичной ошибкой (n = 3–9).

 

Как мы показали ранее, отщепление монободи от МНТ0 приводит к существенному уменьшению константы диссоциации комплекса N-белка с этим монободи (с 116 ± 20 до 10 ± 3 нМ) [9]. В настоящей работе заметное увеличение сродства наблюдается и для МНТ1 (константа диссоциации уменьшается с 47 ± 3 до 17 ± 4 нМ). Иными словами, отщепленный фрагмент в клетке-мишени будет взаимодействовать с N-белком заметно лучше, чем полноразмерный МНТ. Известно, что конкурентное взаимодействие с N-белком потенциально способно нарушить весь процесс сборки новых вирусных частиц [15], а значит, подавить распространение вируса в организме. В настоящей работе на это воздействие на N-белок накладывается еще его вероятная деградация за счет привлечения к нему E3-лигазы, что, по нашему мнению, должно кардинально сказаться на сборке вирусного капсида.

Мы предполагаем, что разработанные МНТ могут послужить основой для создания новых противовирусных препаратов против вируса SARS-CoV-2. Причем примененный в данной работе подход в перспективе может оказаться эффективным против не только этого вируса, но и других вирусов.

Источники финансирования

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 21-14-00130). Эксперименты были выполнены с использованием оборудования Центра коллективного пользования ИБГ РАН.

Соблюдение этических стандартов

В данной работе отсутствуют исследования человека или животных.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

×

About the authors

Y. V. Khramtsov

Institute of Gene Biology, RAS

Author for correspondence.
Email: alsobolev@yandex.ru
Russian Federation, Moscow

A. V. Ulasov

Institute of Gene Biology, RAS

Email: alsobolev@yandex.ru
Russian Federation, Moscow

T. N. Lupanova

Institute of Gene Biology, RAS

Email: alsobolev@yandex.ru
Russian Federation, Moscow

G. P. Georgiev

Institute of Gene Biology, RAS

Email: alsobolev@yandex.ru

Academician

Russian Federation, Moscow

A. S. Sobolev

Institute of Gene Biology, RAS; Lomonosov Moscow State University

Email: alsobolev@yandex.ru

Corresponding 

Russian Federation, Moscow; Moscow

References

  1. Clercq E.D., Li G. // Clin Microbiol Rev. 2016. V. 29. P. 695–747.
  2. Gebauer M., Skerra A. // Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2020. V. 60. P. 391-415.
  3. Shipunova V.O., Deyev S.M. // Acta Naturae. 2022. V. 14. № 1(52). P. 54–72.
  4. Tolmachev V.M., Chernov V.I., Deyev S.M. // Russ Chem Rev. 2022. V. 91. № 3. RCR5034
  5. Surjit M., Lal S.K. // Infect Genet Evol. 2008. V. 8. P. 397–405.
  6. Wu C., Zheng M. // Preprints. 2020. 2020020247.
  7. Prajapat M., Sarma P., Shekhar N., et al. // Indian J Pharmacol. 2020. V. 52. P. 56.
  8. Du Y., Zhang T., Meng X., et al. // Preprints. 2020. doi: 10.21203/rs.3.rs-25828/v1.
  9. Khramtsov Y.V., Ulasov A.V., Lupanova T.N., et al. // Dokl Biochem Biophys. 2023. V. 510. P. 87–90.
  10. Lu M., Liu T., Jiao Q. et al. // Eur J Med Chem. 2018. V. 146. P. 251–259.
  11. Fulcher L.J., Hutchinson L.D., Macartney T.J., et al. // Open biology. 2017. V. 7. 170066.
  12. Slastnikova T.A., Rosenkranz A.A., Khramtsov Y.V., et al. // Drug Des Devel Ther. 2017. V. 11. P. 1315–1334.
  13. Khramtsov Y.V., Ulasov A.V., Lupanova T.N., et al. // Dokl Biochem Biophys. 2022. V. 506.
  14. Kern H.B., Srinivasan S., Convertine A.J., et al. // Mol Pharmaceutics. 2017. V. 14(5). P. 1450–1459.
  15. Wang S., Dai T., Qin Z., et al. // Nat. Cell Biol. 2021. V. 23. P. 718–732.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. Dependence of the relative fluorescence intensity (the fluorescence intensity before the start of thermophoresis is taken as 100%) 20 s after the start of thermophoresis on the concentration of MNT1 or cleaved MNT1 at a constant concentration of N-protein labeled with AF488 (5 nM). The standard error of relative fluorescence intensity determination is indicated (14–17 replicates).

Download (61KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. Relative fluorescence of A549 cells (the fluorescence of cells to which MNT was not added was taken as 100%) when they were incubated for various times with 500 nM MNT1 or 500 nM MNT0. Mean values with corresponding standard error are shown (n = 3–9).

Download (47KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2024 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».