Модульные нанотранспортеры, способные вызывать внутриклеточную деградацию N-белка вируса SARS-CoV-2 в клетках А549 с временной экспрессией этого белка, слитого с флуоресцентным белком mRuby3

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Созданы модульные нанотранспортеры (МНТ), содержащие антителоподобную молекулу, монободи, к N-белку вируса SARS-CoV-2, а также аминокислотную последовательность, привлекающую Е3-лигазу Keap1 (Е3BP). В данный МНТ также был введен сайт отщепления E3BP-монободи от МНТ в кислых эндоцитозных компартментах. Показано, что данное отщепление эндосомной протеазой катепсином В приводит к увеличению сродства E3BP-монободи к N-белку в 2.7 раза. На клетках А549 с временной экспрессией N-белка, слитого с флуоресцентным белком mRuby3, было показано, что инкубация с МНТ приводит к достоверному уменьшению флуоресценции mRuby3. Предполагается, что разработанные МНТ могут служить основой для создания новых противовирусных препаратов против вируса SARS-CoV-2.

Полный текст

Введение

Необходимость в разработке новых противовирусных препаратов особенно ярко продемонстрировала пандемия коронавируса SARS-CoV-2. Наиболее часто используются низкомолекулярные ингибиторы вирусной активности [1]. Однако их можно подобрать не ко всем белковым мишеням, в отличие от антителоподобных молекул, которые можно получить к практически любому белковому антигену [2, 3]. Не удивительно, что в различных системах доставки биоактивных молекул все чаще используются разные антителоподобные молекулы [4]. Для вируса SARS-CoV-2 в качестве белка-мишени можно выбрать крайне необходимый для сборки вирусного капсида нуклеокапсидный белок, или N-белок [5–7]. К этому белку высокое сродство имеет полученная ранее антителоподобная молекула, монободи (NC2) [8]. Ранее мы разработали модульные нанотранспортеры (МНТ), содержащие в своем составе данное монободи и способные связываться в клетках-мишенях с N-белком [9], в настоящей работе обозначаемые как МНТ0. Следующий вариант МНТ, МНТ1, отличался от МНТ0 тем, что в него была дополнительно включена аминокислотная последовательность DPETGEYL (далее – Е3ВР), способная с высоким сродством связывать убиквитинлигазу Keap1 [10]. Мы предположили, что связывание МНТ1 одновременно с Keap1 и N-белком будет приводить к деградации N-белка как следствие его убиквитинирования [11]. В состав МНТ1, так же как и у МНТ0, был внесен сайт для отщепления Е3ВР-монободи от МНТ1 в закисляемых эндоцитозных компартментах. Настоящая работа посвящена как изучению взаимодействия МНТ1 и расщепленного МНТ1 с N-белком в растворе, так и влиянию МНТ1 на содержание N-белка в клетках А549, временно экспрессирующих этот белок.

Наработку и очистку N-белка и МНТ0 проводили, как это описано в [9]. Сайт-специфическим мутагенезом из МНТ, описанного ранее [9], получили ген, кодирующий МНТ следующего состава: affibody(EGFR)-HisTag-DTox-HMP-FKFL-E3BP-NC2, где affibody(EGFR) – аффибоди к рецептору эпидермального фактора роста, DTox – транслокационный домен дифтерийного токсина, HMP – гемоглобиноподобный белок E. coli, FKFL – сайт расщепления эндосомной протеазой катепсином В, E3BP – аминокислотная последовательность, привлекающая Е3-лигазу Keap1 и NC2 – монободи к N-белку. Экспрессию МНТ1 проводили в штамме E.coli Ros(DE3)pLysS. Автоиндукцию экспрессии МНТ1 проводили инкубацией в течение 48 ч при 18 °C. МНТ1 выделяли из растворимой фракции [12], а затем очищали аффинной хроматографией на носителе HisTrap FF (Cytiva). Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле продемонстрировал достаточную степень чистоты полученного МНТ1 (86.6%).

Для получения расщепленного МНТ1 инкубировали 4 мкМ МНТ1 с 4 мкг/мл активированного катепсина В (Native human Cathepsin B protein (ab90387, Abcam)). Активацию катепсина В проводили, как описано в [14]. Расщепление МНТ1 проводилось при рН 5.5 с добавлением 0.001% SDS, чтобы избежать агрегации МНТ1. Взаимодействие МНТ1 и расщепленного МНТ1 с N-белком изучали так же, как описано в [13], методом термофореза на приборе Monolith NT.115 Series (NanoTemper Technologies GmbH, Германия) в буфере 10 мМ NaH2PO4, 150 мМ NaCl, pH 8.0. N-белок был помечен флуоресцентным красителем AF488, как это описано в [13] и с той же степенью модификации. Трансфекция клеток А549 плазмидой (3–4% трансфицированных клеток), кодирующей N-белок, слитый с флуоресцентным белком mRuby3, осуществлялась по [13].

При фиксированной концентрации N-белка, меченного AF488, (5 нМ) методом термофореза были получены зависимости относительной флуоресценции (за 100% принята флуоресценция до начала термофореза) через 20 с после начала термофореза от концентрации МНТ1 (рис. 1, квадраты) или расщепленного МНТ1 (см. рис. 1, полые треугольники). Для каждого эксперимента получали три-четыре такие зависимости, и весь эксперимент повторяли три-четыре раза. По каждой кривой определяли константу диссоциации комплекса МНТ1 или расщепленного МНТ1 с N-белком, ее усредняли по всем 12–17 кривым и определяли относительную ошибку ее измерения. Константы диссоциации комплексов МНТ1 или расщепленного МНТ1 с N-белком составили 47 ± 3 и 17 ± 4 нМ соответственно. Для расщепленного МНТ1 это значение близко к константе для свободного монободи NC2 (6.7 нМ [8]). Таким образом, расщепление МНТ1 катепсином В приводит к увеличению его сродства к N-белку приблизительно в три раза.

 

Рис. 1. Зависимости относительной интенсивности флуоресценции (за 100% принята интенсивность флуоресценции до начала термофореза) через 20 с после начала термофореза от концентрации МНТ1 или расщепленного МНТ1 при постоянной концентрации N-белка, меченного AF488 (5 нМ). Указана стандартная ошибка определения относительной интенсивности флуоресценции (14–17 повторов).

 

За процессом деградации слитого белка N-mRuby3 в клетках А549 с временной экспрессией данного белка наблюдали с использованием проточной цитофлуориметрии на приборе MACSQuant Analyzer (Miltenyi Biotec, Франция) в канале флуоресценции 571–601 нм, флуоресценцию возбуждали лазером с длиной волны 561 нм. Клетки с временной экспрессией белка N-mRuby3 инкубировали с 500 нМ МНТ1 или МНТ0 в течение заданного времени, отмывали, снимали с подложки и изучали в канале флуоресценции mRuby3 на проточном цитофлуориметре. На рис. 2 показана зависимость флуоресценции клеток А549 от времени инкубации с МНТ1 или МНТ0. На 5 часов средняя флуоресценция клеток А549 достоверно (р < 0.05, U-критерий Манна Уитни) ниже в случае, когда клетки инкубировали с МНТ1, по сравнению с инкубацией с МНТ0. Уменьшение флуоресценции mRuby3 можно связать с деградацией слитого белка N-mRuby3. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что включение в разработанные нами МНТ аминокислотной последовательности, привлекающей Е3-лигазу Keap1, может приводить к деградации N-белка в клетках-мишенях.

 

Рис. 2. Относительная флуоресценция клеток А549 (флуоресценция клеток, к которым не добавлялся МНТ была принята за 100%) при их инкубации различные времена с 500 нМ МНТ1 или 500 нМ МНТ0. Указаны средние значения с соответствующей среднеквадратичной ошибкой (n = 3–9).

 

Как мы показали ранее, отщепление монободи от МНТ0 приводит к существенному уменьшению константы диссоциации комплекса N-белка с этим монободи (с 116 ± 20 до 10 ± 3 нМ) [9]. В настоящей работе заметное увеличение сродства наблюдается и для МНТ1 (константа диссоциации уменьшается с 47 ± 3 до 17 ± 4 нМ). Иными словами, отщепленный фрагмент в клетке-мишени будет взаимодействовать с N-белком заметно лучше, чем полноразмерный МНТ. Известно, что конкурентное взаимодействие с N-белком потенциально способно нарушить весь процесс сборки новых вирусных частиц [15], а значит, подавить распространение вируса в организме. В настоящей работе на это воздействие на N-белок накладывается еще его вероятная деградация за счет привлечения к нему E3-лигазы, что, по нашему мнению, должно кардинально сказаться на сборке вирусного капсида.

Мы предполагаем, что разработанные МНТ могут послужить основой для создания новых противовирусных препаратов против вируса SARS-CoV-2. Причем примененный в данной работе подход в перспективе может оказаться эффективным против не только этого вируса, но и других вирусов.

Источники финансирования

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 21-14-00130). Эксперименты были выполнены с использованием оборудования Центра коллективного пользования ИБГ РАН.

Соблюдение этических стандартов

В данной работе отсутствуют исследования человека или животных.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

×

Об авторах

Ю. В. Храмцов

Институт биологии гена Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: alsobolev@yandex.ru
Россия, Москва

А. В. Уласов

Институт биологии гена Российской академии наук

Email: alsobolev@yandex.ru
Россия, Москва

Т. Н. Лупанова

Институт биологии гена Российской академии наук

Email: alsobolev@yandex.ru
Россия, Москва

Г. П. Георгиев

Институт биологии гена Российской академии наук

Email: alsobolev@yandex.ru

академик

Россия, Москва

А. С. Соболев

Институт биологии гена Российской академии наук; Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова

Email: alsobolev@yandex.ru

член-корреспондент

Россия, Москва; Москва

Список литературы

  1. Clercq E.D., Li G. // Clin Microbiol Rev. 2016. V. 29. P. 695–747.
  2. Gebauer M., Skerra A. // Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2020. V. 60. P. 391-415.
  3. Shipunova V.O., Deyev S.M. // Acta Naturae. 2022. V. 14. № 1(52). P. 54–72.
  4. Tolmachev V.M., Chernov V.I., Deyev S.M. // Russ Chem Rev. 2022. V. 91. № 3. RCR5034
  5. Surjit M., Lal S.K. // Infect Genet Evol. 2008. V. 8. P. 397–405.
  6. Wu C., Zheng M. // Preprints. 2020. 2020020247.
  7. Prajapat M., Sarma P., Shekhar N., et al. // Indian J Pharmacol. 2020. V. 52. P. 56.
  8. Du Y., Zhang T., Meng X., et al. // Preprints. 2020. doi: 10.21203/rs.3.rs-25828/v1.
  9. Khramtsov Y.V., Ulasov A.V., Lupanova T.N., et al. // Dokl Biochem Biophys. 2023. V. 510. P. 87–90.
  10. Lu M., Liu T., Jiao Q. et al. // Eur J Med Chem. 2018. V. 146. P. 251–259.
  11. Fulcher L.J., Hutchinson L.D., Macartney T.J., et al. // Open biology. 2017. V. 7. 170066.
  12. Slastnikova T.A., Rosenkranz A.A., Khramtsov Y.V., et al. // Drug Des Devel Ther. 2017. V. 11. P. 1315–1334.
  13. Khramtsov Y.V., Ulasov A.V., Lupanova T.N., et al. // Dokl Biochem Biophys. 2022. V. 506.
  14. Kern H.B., Srinivasan S., Convertine A.J., et al. // Mol Pharmaceutics. 2017. V. 14(5). P. 1450–1459.
  15. Wang S., Dai T., Qin Z., et al. // Nat. Cell Biol. 2021. V. 23. P. 718–732.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Зависимости относительной интенсивности флуоресценции (за 100% принята интенсивность флуоресценции до начала термофореза) через 20 с после начала термофореза от концентрации МНТ1 или расщепленного МНТ1 при постоянной концентрации N-белка, меченного AF488 (5 нМ). Указана стандартная ошибка определения относительной интенсивности флуоресценции (14–17 повторов).

Скачать (61KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Относительная флуоресценция клеток А549 (флуоресценция клеток, к которым не добавлялся МНТ была принята за 100%) при их инкубации различные времена с 500 нМ МНТ1 или 500 нМ МНТ0. Указаны средние значения с соответствующей среднеквадратичной ошибкой (n = 3–9).

Скачать (47KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024

Согласие на обработку персональных данных

 

Используя сайт https://journals.rcsi.science, я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных») даю согласие на обработку персональных данных на этом сайте (текст Согласия) и на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика» (текст Согласия).