Study of the association of ouib and nom with heterochromatin in Drosophila melanogaster

Full Text

У дрозофилы эухроматин и гетерохроматин представляют собой два независимых компартмента, отличающихся набором хроматиновых белков и нуклеосомных модификаций [1, 2]. В последних исследованиях было показано, что гетерохроматин активно транскрибируется, и в нем локализованы многие гены домашнего хозяйства, которые имеют высокий уровень экспрессии [2]. При этом промоторы генов, расположенных в эухроматине и гетерохроматине, могут эффективно инициировать транскрипцию только в своем компартменте [1, 2]. В отличие от прокариот бо´льшая часть промоторов высших эукариот, включая дрозофилу и человека, не имеет выраженных мотивов, с которыми могут связываться общие факторы транскрипции [3]. Согласно одной из моделей ключевую роль в организации промоторов играют белки, содержащие кластеры цинковых пальцев С2Н2-типа (С2Н2-белки), которые связываются со специфичными относительно длинными (12–15 п.н.) мотивами в промоторах генов, что приводит к формированию открытого хроматина и рекрутированию TFIID-комплекса [3, 4]. У дрозофилы существует обширный класс белков, которые содержат на С-конце кластер, состоящий из 5 С2Н2-доменов, а на N-конце находится ZAD (Zinc-finger Associated Domain) домен, который обеспечивает гомодимеризацию белка [5, 6]. ZAD-домен и C2H2-кластеры соединены неструктурированным линкером. Наиболее хорошо описанным у дрозофилы является белок М1BP, который связывается с мотивом, расположенным в примерно в 2000 промоторах, определяющих активность эухроматиновых генов [7, 8]. С неструктурированным линкером белка M1BP связывается белок СР190, который участвует в рекрутировании комплексов стимулирующих транскрипцию [9, 10].

Ген m1bp находится в кластере (85A9 на хромосомном плече 3R), который включает еще четыре гена, кодирующих ZAD-C2H2-белки – CG8159, ranshi, ouib и nom (рис. 1б). Все эти гены паралогичны и, предположительно, являются результатом тандемной дупликации в процессе эволюции. Неожиданно оказалось, что гены ouib и nom кодируют белки, которые связываются с промоторами генов, расположенными в гетерохроматине [11–13]. Ранее были найдены два других ZAD-C2H2-белка, odj и nnk, которые эффективно связываются с регуляторными последовательностями в гетерохроматине [14]. Было показано, что эти белки взаимодействуют с основным белком гетерохроматина НР1a, что, как предполагается, определяет преимущественную локализацию этих белков в гетерохроматиновом компартменте.

Целью настоящей работы стало исследование, каким образом белки ouib и nom приобретают способность связываться с промоторами генами, находящимися в областях гетерохроматина. Ранее было показано, что ZAD-домены даже близких С2Н2 паралогов преимущественно формируют только гомодимеры [5, 6]. Так как ZAD-домены белков M1BP, ouib и nom имеют высокую степень сходства последовательностей, то была протестирована способность ZAD-доменов к формированию гетеродимеров. Для этого мы использовали метод дрожжевой двугибридной системы (ДДС). Были созданы конструкции, в которых последовательности ZAD-доменов белков ouib, nom и M1BP были клонировали в одну рамку считывания с активационным доменом (АД) или ДНК-связывающим доменом (ДСД) белка GAL4. Поиск ортологов у видов Drosophila показал, что ортолог ouib присутствует у всех видов, тогда как его дупликация – ген nom произошла позже. Так, ортологи nom отсутствуют у D.virilis (рис. 1б). Мы протестировали в ДДС взаимодействие ZAD-доменов белков ouib и nom c ортологом ouib D.virilis (GJ22678). Анализ взаимодействия показал, что ZAD-домены M1BP, ouib и nom гомодимеризуются, но не образуют гетеродимеров. При этом оба белка паралога ouib и nom взаимодействуют с ортологом GJ22678 D. virilis (см. рис. 1в), что является дополнительным доказательством того, что они произошли от одного гена.

 

Рис. 1. Доменная структура белков ouib и nom. Указаны порядковые номера аминокислотных остатков, соответствующих границам доменов (а); геномное расположение генов m1bp, ouib и nom в кластере у D. melanogaster и D. virilis. Для обозначения ортологов использованы одинаковые цвета (б); исследование взаимодействия между ZAD-доменами в ДДС. Фрагменты ZAD были слиты с ДНК-связывающим доменом GAL4 (ДСД), и исследовано их взаимодействие с фрагментами, слитым с активационным доменом GAL4 (АД). Результаты представлены в колонках, где + и – означают наличие или отсутствие взаимодействия соответственно. В качестве положительного контроля проверялась способность ZAD-доменов к димеризации, а в качестве отрицательного контроля выполнялось тестирование на наличие взаимодействия только с активационным (АД) или ДНК-связывающим (ДСД) доменом белка GAL4 (в); исследование взаимодействия полноразмерных белков Ouib и Nom, слитых с АД GAL4, с полноразмерными белками СР190 и HP1a, слитыми с ДСД GAL4 (г). Остальные обозначения – такие же, как в (в).

 

Известно, что многие белки, ассоциированные с гетерохроматином, взаимодействуют с белком Hp1a через аминокислотный мотив PxVxL (где х – любая аминокислота). Однако, анализ последовательностей ouib и nom не выявил данного мотива. Для проверки прямого взаимодействия белков с HP1a в ДДС были получены конструкции, в которых последовательности кДНК белков ouib и nom были клонированы в одну рамку считывания с АД GAL4 и конструкция, в которой кДНК белка HP1a находилась в одной рамке считывания с ДСД GAL4. В результате, в ДДС прямое взаимодействие ouib и nom с HP1a не обнаружено (см. рис. 1г).

Многие ZAD-C2H2-белки, имеющие сайты связывания в промоторах генов, взаимодействуют с белком CP190, в том числе рекрутирование СР190 является важным для функциональной активности M1BP [9]. Мы проверили прямое взаимодействие паралогов ouib и nom с CP190 в ДДС (рис. 1в). Оказалось, что ouib и nom тоже взаимодействуют с CP190, который связывается исключительно с эухроматиновыми промоторами. Это предполагает роль ouib и nom в организации эухроматиновых промоторов.

Для исследования полногеномного распределения сайтов связывания белков ouib и nom была использована модель политенных хромосом из ядер слюнных желез личинок третьего возраста. Политенные хромосомы состоят из междисков, которые представляют собой промоторы, контролирующие экспрессию генов домашнего хозяйства, и дисков, которые соответствуют преимущественно неактивным генам [15]. Области конститутивного гетерохроматина хорошо визуализируются в области прицентромерного гетерохроматина и в теломерах на концах хромосом. Так как ouib и nom не экспрессируются в слюнных железах, мы использовали индуцируемую систему UAS/GAL4 для экспрессии этих белков. С этой целью были созданы генетические конструкции, в которых кДНК белков nom и ouib в одной рамке считывания с эпитопом HA были клонированы в вектор pUAS, который содержит последовательность UAS (Upstream activating sequence) и attB-сайт для интеграции в геном дрозофилы (рис. 2а). Полученные конструкции были встроены в одно и тоже место генома в сайт attP 38D с использованием системы интеграции phiC31. Для эктопической экспрессии генов мы скрещивали мух линии, содержащей конструкт pUAS-OuibxHA или pUAS-NomxHA, с мухами линии, экспрессирующей GAL4 под контролем сильного тубулинового промотора (tub:GAL4), который обеспечивает высокий уровень транскрипции во всех тканях. Экспрессию белка подтверждали анализом белкового лизата из взрослых мух методом вестерн-блот с использованием антител к HA (см. рис. 2б).

 

Рис. 2. Схема генетической конструкции, используемой для создания трансгенных мух, экспрессирующих белок, слитый с HA-эпитопом (а); вестерн-блот анализ белковых экстрактов из 2–3-дневных самцов, экспрессирующих OuibxHA и NomxHA, окрашенные антителами к HA-эпитопу (б); политенные хромосомы слюнных желез личинок мух, экспрессирующих OuibxHA и NomxHA. Политенные хромосомы были окрашены антителами к эпитопу HA, ДНК окрашена DAPI. Для сравнения приведено иммуноокрашивание политенных хромосом из лиинии Oregon-R кроличьими антителами к гетерохроматиновому белку odj (в). Стрелками показано положение хромоцентра на разных препаратах политенных хромосом. Масштаб – 10 мкм.

 

Иммуноокрашивание политенных хромосом показало неожиданные результаты. Оказалось, что белки ouib и nom имеют множество сайтов связывания в междисках политенных хромосом, но при этом не наблюдается связывания в прицентромерных гетерохроматиновых районах. Таким образом, эктопически экспрессируемые белки не рекрутируются сами по себе в гетерохроматиновый компартмент (см. рис. 2в). Это отличает белки nom и ouib от белка odj, который активно связывается с гетерохроматином политенных хромосом (см. рис. 2в).

Наиболее вероятно, что ген, кодирующий M1BP, является основателем кластера генов (85A9), так как его экспрессия намного выше и белок имеет консервативные среди дрозофил мотивы связывания в промоторах большой группы генов. Остальные гены кластера, за исключением ranshi, имеют слабый уровень экспрессии и, вероятно, связываются с промоторами небольшого количества генов. Так, было показано, что белки nom и ouib определяют активность промоторов генов nvd и spok, расположенных в гетерохроматине [11,.12]. При этом активация этих промоторов является основной функцией белков nom и ouib. Как и M1BP, белки nom и ouib связываются с СР190, рекрутирование которого на промоторы определяет формирование зоны открытого хроматина и активацию транскрипции. Таким образом, белки nom и ouib по строению и функциям похожи на M1BP. Более того, при избыточной экспрессии белки nom и ouib связываются с промоторами (междисками) генов домашнего хозяйства, которые находятся в эухроматине и не наблюдается их ассоциации с прицентромерным гетерохроматином. ZAD-домены трех близких паралогов M1BP, nom и ouib формируют только гомодимеры. Таким образом, ZAD-домены определяют функциональную независимость недавно возникших С2Н2-белков и блокируют их взаимодействие с M1BP. Полученные результаты свидетельствуют о том, что механизм рекрутирования nom и ouib в гетерохроматиновые районы принципиально отличается от описанного ранее для odj и nnk, для которых показано взаимодействие через консенсусный мотив с HP1a. Белки nom и ouib не взаимодействуют напрямую с основным гетерохроматиновым белком HP1a.

Наиболее вероятно, что nom и ouib рекрутируются в гетерохроматиновый компартмент с помощью белка-партнера, который также участвует в формирование активных промоторов nvd и spok генов. Одним из потенциальных белков-партеров может быть большой (около 2000 а.о.) ZAD-C2H2 белок Molting Defective (Mld), который также связывается с промоторами nvd и spok [12]. Белок Mld эффективно экспрессируется на всех стадиях развития и, вероятно, имеет много различных функций в регуляции экспрессии генов. Необходимы дальнейшие исследования для ответа на вопрос, могут ли белки ouib и nom рекрутироваться в гетерохроматиновый компартмент в результате взаимодействия с другими ZAD-C2H2-белками, которые ассоциированы с основными гетерохроматиновыми белками.

Источник финансирования

Исследование выполнено за счет Российского научного фонда, грант № 22-24-00894.

Соблюдение этических норм и стандартов

В соответствии с пунктом 3 главы 1 Директивы 2010/63/ЕС от 22.09.2010 г. о защите животных, используемых в научных целях, требования биоэтики не распространяются на объект данного исследования.

Конфликт интересов

Авторы статьи подтверждают отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.

About the authors

Y. V. Pekina

Institute of Gene Biology RAS

Email: v.babosha@gmail.com
Russian Federation, Moscow

V. A. Babosha

Institute of Gene Biology RAS

Author for correspondence.
Email: v.babosha@gmail.com
Russian Federation, Moscow

P. G. Georgiev

Institute of Gene Biology RAS

Email: v.babosha@gmail.com

academician

Russian Federation, Moscow

А. А. Fedotova

Institute of Gene Biology RAS

Email: annafedotova@list.ru
Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files