Antigenic peptide–thioredoxin fusion chimeras for in vitro stimulus of CD4⁺ TCR⁺ Jurkat T-cells

Full Text

CD4⁺ Т-клетки играют основную роль в регуляции иммунного ответа. Активация CD4⁺ Т-клеток зависит от узнавания антигенных пептидов, представленных в комплексах с молекулами главного комплекса гистосовместимости II класса (MHC-II) (pMHC), которые экспонируются на антигенпрезентирующих клетках (АПК) [1–3]. Необходимо тестирование множества потенциальных антигенных мишеней для точного определения иммуногенных эпитопов. Природные AПК, включающие B-клетки, дендритные клетки и макрофаги, не только экспрессируют молекулы MHC-II, но также обеспечивают костимулирующие сигналы (например, посредством CD80, CD86), необходимые для оптимальной активации CD4⁺ Т-клеток. Тем не менее, использование природных АПК сопряжено с различными проблемами из-за их ограниченной доступности. Существуют вычислительные методы прогнозирования иммуногенных эпитопов, однако эти алгоритмы в идеале требуют экспериментальной проверки [4, 5]. Искусственные АПК были разработаны как альтернативный подход к стимуляции CD4⁺ Т-клеток. Например, в качестве АПК можно использовать эритролейкозные клетки человека K562 или клеточные линии фибробластов мыши NIH/3T3, экспрессирующие как костимулирующие молекулы, так и HLA-DR [6, 7]. В настоящей работе мы определили эффективность trx-пептидов, полученных в прокариотической системе экспрессии, для связывания и активации антиген-специфичных клеток CD4⁺ Jurkat 76 TPR.

Мы использовали линию клеток HeLa, в которой отсутствует эндогенная экспрессия молекул MHC-II, тем самым предотвращая перекрестную презентацию антигенных пептидов. Ранее созданную клеточную линию CD80⁺ HeLa [8] трансдуцировали лентивирусами, кодирующими HLA-DRB1*01:01 и HLA-DRB1*15:01. Лентивирусы собирали через 48 часов после котрансфекции клеток HEK 293T конструкциями, содержащими кодирующую последовательность β/α-цепей MHC-II, разделенных пептидом 2A (T2A), и упаковывающими плазмидами. В качестве CD4⁺ Т-клеток использовали ранее разработанные клеточные линии – CD4⁺ HA1.7 TCR⁺ и CD4⁺ Ob.1A12 TCR⁺ Jurkat 76 TPR [8], полученные путем последовательной трансдукции CD4- и TCR-кодирующими лентивирусами клеточной линии Jurkat 76 TPR [8, 9]. TCR HA1.7 специфичен к фрагменту гемагглютинина А гриппа (HA_306–318) в комплексе с HLA-DRB1*01:01 и обладает высокой аффинностью к pMHC [10]. TCR Ob.1A12 специфичен к фрагменту основного белка миелина (MBP) (MBP_85–99) в комплексе с HLA-DRB1*15:01 и имеет низкую аффинность к pMHC благодаря аутоиммунному происхождению [11]. В клетках Jurkat 76 TPR отсутствует эндогенный αβ TCR, что снижает риск неправильного спаривания цепей TCR. Кроме того, эти клетки экспрессируют NFAT (ядерный фактор активированных Т-клеток)-зависимый флуоресцентный репортер GFP при стимуляции TCR или химерного антигенного рецептора (CAR), что можно легко оценить с помощью проточной цитометрии. В совокупности совместное культивирование клеток CD80⁺ HLA-DRB1⁺ HeLa и клеточных линий CD4⁺ TCR⁺ Jurkat 76 TPR представляет удобную платформу для оценки иммуногенности антигенных пептидов.

Высокополиморфные молекулы MHC-II имеют открытую борозду связывания пептидов, вмещающую длинные пептиды и даже белки, в отличие от MHC-I. Твердофазный синтез пептидов в случае относительно длинных молекул является дорогостоящим и труднодоступным. Чтобы решить эту проблему, мы использовали слитые пептиды, которые можно производить в E. coli в больших количествах с низкими затратами. Ранее мы продемонстрировали, что белок-носитель trx способствует связыванию пептидных эпитопов с сывороточными аутоантителами пациентов с рассеянным склерозом [12]. Кроме того, trx увеличивает выход экспрессии, улучшает растворимость и стабильность антигенных пептидов, что может быть критическим моментом для синтетических аналогов. Мы использовали ранее опубликованные конструкции, содержащие пептид (HA_306–318 (PKYVKQNTLKLAT) или MBP_81–104 (QDENPVVHFFKNIVTPRTPPPSQG)), связанный через серин-глициновый линкер с C-концом бактериального trx, меченного кластером 6xHis [13]. Конструкция, содержащая только trx-6His и серин-глициновый линкер, использовалась в качестве отрицательного контроля.

Штамм E. coli BL21(DE3) трансформировали ДНК, кодирующей соответствующие экспрессирующие trx-слитые конструкции, и свежетрансформированные бактерии выращивали в жидкой среде до достижения оптической плотности OD₆₀₀ = 0.6. После индукции изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом (IPTG) клетки выращивали при 37 °C в течение еще 16 часов, затем лизировали. Trx-пептиды очищали с помощью аффинной хроматографии на агарозе никель-нитрилотриуксусной кислоты (Ni-NTA) (рис. 1). Чистота выделенных белков превышала 90% при анализе с помощью электрофореза SDS-PAGE. Активацию клеток CD4⁺ TCR⁺ Jurkat 76 TPR по экспрессии GFP оценивали методом проточной цитометрии. Презентацию trx-пептидов осуществляли одновременно с совместной инкубацией клеток CD80⁺ HLA-DRB1⁺ HeLa и клеток CD4⁺ TCR⁺ Jurkat 76 TPR. Примечательно, что молекулы MHC-II AПК изначально нагружены низкоаффинным пептидом CLIP, что способствует стабильности комплекса MHC-II, который впоследствии вытесняется другими экзогенными пептидами [14]. В нашей экспериментальной системе HLA-DRB1, экспонированный на HeLa, может быть загружен эндогенными пептидами с относительно высоким сродством. Однако высокие концентрации trx-пептидов эффективно вытесняют эндогенные пептиды.

 

Рис. 1. Схематическое изображение использования trx-пептидов для активации CD4⁺ TCR⁺ клеток Jurkat 76 TPR. Trx-пептиды экспрессировались в E. coli с последующей очисткой с помощью Ni-NTA. Полученный белок загружали на HLA-DRB1*01:01 или HLA-DRB1*15:01 клеточных линий CD80⁺ HeLa и инкубировали с соответствующей клеточной линией CD4⁺ TCR⁺ Jurkat 76 TPR. Последующая активация клеточной линии CD4⁺ TCR⁺ Jurkat 76 TPR происходила за счет образования тримолекулярного комплекса и оценивалась благодаря экспрессии GFP, вызванной активацией NFAT.

 

CD4⁺ HA1.7 TCR⁺ клетки Jurkat 76 TPR (100 000 клеток на лунку) инкубировали совместно с CD80⁺ HLA-DRB1*01:01⁺ клеточной линией HeLa (10 000 клеток на лунку) с различными концентрациями rx-HA (0.5, 1, 5, 10 и 20 мкМ) в течение 16 часов в 96-луночном круглодонном планшете (рис. 2). Синтетический пептид HA_306–318 (PKYVKQNTLKLAT) служил положительным контролем. Повышение концентрации носителя trx приводило к активации клеток CD4⁺ HA1.7 TCR⁺ Jurkat 76 TPR. Однако процент клеток GFP⁺ CD4⁺ HA1.7 TCR⁺ Jurkat 76 TPR, инкубированных с 20 мкМ носителя trx, был статистически ниже, чем наблюдавшийся при инкубации с 0.5 мкМ trx-HA (p < 0.001). Несмотря на то, что синтетический пептид HA демонстрировал более высокий потенциал активации клеток CD4⁺ HA1.7 TCR⁺ Jurkat 76 TPR по сравнению с trx-HA, инкубация при концентрациях 5 и 10 мкМ не показала статистически значимой разницы между trx-пептидом и синтетическим пептидом.

 

Рис. 2. Стимуляция CD4⁺ HA1.7⁺ TCR Jurkat 76 TPR клетками CD80⁺ HLA-DRB1*01:01⁺ HeLa, праймированными эпитопами MHC-II. CD4⁺ HA1.7 TCR⁺ Jurkat 76 TPR клетки инкубировали с CD80⁺ HLA-DRB1*01:01⁺ HeLa в течение 16 часов с синтетическим пептидом HA или trx-HA в концентрации 0.5, 1, 5, 10 и 20 мкМ. Носитель trx использовали в качестве отрицательного контроля. Анализ проводили с помощью проточной цитометрии. Значения указывают процент активированных клеток, экспрессирующих GFP. Показаны репрезентативные профили проточной цитометрии. Процент GFP-положительных клеточных линий CD4⁺ HA1.7 TCR⁺ Jurkat 76 TPR, инкубированных с CD80⁺ HLA-DRB1*01:01⁺ HeLa, загруженными синтетическим пептидом HA или trx-HA в концентрации 0.5, 1, 5, 10 и 20 мкМ, показан как среднее ± стандартное отклонение трех повторов эксперимента (нижний рисунок). Статистический анализ проводился с использованием t-критерия Уэлча: ** – р < 0.01, *** – р < 0.001.

 

При инкубации CD4⁺ Ob.1A12 TCR⁺ Jurkat 76 TPR с CD80⁺ HLA-DRB1*15:01⁺ HeLa носитель trx практически не способствовал активации (рис. 3). Инкубация с 20 мкМ носителя trx привела к статистически менее значимому проценту популяции GFP⁺, чем инкубация с 0.5 мкМ trx-MBP_81–104 (p < 0.01). Предполагается, что низкая аффинность Ob.1A12 TCR может снижать неспецифическую активацию. По аналогии с CD4⁺ HA1.7 TCR⁺ Jurkat 76 TPR синтетический пептид (MBP_85–99 (ENPVVHFFKNIVTPR)) продемонстрировал большую способность активировать клетки CD4⁺ Ob.1A12 TCR⁺ Jurkat 76 TPR по сравнению с trx-MBP. Инкубация с 10 мкМ синтетического или trx-пептида продемонстрировала статистически незначимую разницу в уровне активации.

 

Рис. 3. Стимуляция CD4⁺ Ob.1A12 TCR⁺ Jurkat 76 TPR клетками CD80⁺ HLA-DRB1*15:01⁺ HeLa, праймированными эпитопами MHC-II. Клетки CD4⁺ Ob.1A12 TCR⁺ Jurkat 76 TPR инкубировали с CD80⁺ HLA-DRB1*15:01⁺ HeLa в течение 16 часов с синтетическим пептидом MBP или trx-MBP в концентрации 0.5, 1, 5, 10 и 20 мкМ. Носитель trx использовали в качестве отрицательного контроля. Анализ проводили с помощью проточной цитометрии. Значения указывают процент активированных клеток, экспрессирующих GFP. Показаны репрезентативные профили проточной цитометрии. Процент GFP-положительных клеточных линий CD4⁺ Ob.1A12 TCR⁺ Jurkat 76 TPR, инкубированных с CD80⁺ HLA-DRB1*15:01⁺ HeLa, загруженными синтетическим пептидом MBP или trx-MBP в концентрации 0.5, 1, 5, 10 и 20 мкМ, показан как среднее ± стандартное отклонение трех экспериментальных повторов (нижний рисунок). Статистический анализ проводился с использованием t-критерия Уэлча: * – p < 0.05, ** – p < 0.01, *** – p < 0.001.

 

В заключение наши результаты демонстрируют функциональную значимость trx-пептидов для антиген-специфического взаимодействия и стимуляции клеточных линий CD4⁺ TCR⁺ Jurkat 76 TPR. Разработанная методология может быть особенно полезна при анализе криптических эпитопов MHC-II, проблематичных с точки зрения химического синтеза, растворимости, необычной конформации и вторичной структуры.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы хотели бы поблагодарить Judith Leitner и Peter Steinberger из Венского медицинского университета (Австрия) за предоставление клеточной линии Jurkat 76 TPR.

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (грант № 23-44-00043).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Эта работа не содержит исследований с участием людей и животных.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

I. A. Ishina

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: ishina.irina.a@gmail.com
Russian Federation, Moscow

M. Y. Zakharova

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: mariya.zakharova333@gmail.com
Russian Federation, Moscow

I. N. Kurbatskaia

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: ishina.irina.a@gmail.com
Russian Federation, Moscow

A. E. Mamedov

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: ishina.irina.a@gmail.com
Russian Federation, Moscow

A. A. Belogurov

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences; Evdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry

Email: ishina.irina.a@gmail.com

Department of Biological Chemistry

Russian Federation, Moscow; Moscow

Y. P. Rubtsov

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: ishina.irina.a@gmail.com
Russian Federation, Moscow

A. G. Gabibov

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences; Higher School of Economics; Lomonosov Moscow State University

Email: ishina.irina.a@gmail.com

Academician of the RAS, Department of Life Sciences, Department of Chemistry

Russian Federation, Moscow; Moscow; Moscow

References

Supplementary files