Идентификация ультраструктурных деталей систем отростков астроцитов в нервной ткани головного мозга с использованием коррелятивной сканирующей зондовой и просвечивающей электронной микроскопии

Полный текст

Астроциты являются важнейшими компонентами нейронных цепей, наиболее распространенными глиальными клетками в центральной нервной системе и участвуют в синаптических, контурных и поведенческих функциях. Хорошо развитые протоплазматические астроциты содержат многочисленные отростки, имеющие сложную разветвленную форму. При нормальных физиологических процессах, таких как развитие и старение мозга, а также при патологических процессах, например эпилепсии, болезни Альцгеймера, наблюдаются значительные изменения в нейрон-астроцитарных взаимодействиях. В частности, данные изменения регулируются отростками астроцитов. Обнаружение и изучение патологий этих микроструктур стало возможно только благодаря инновационным подходам в микроскопии. Однако клеточные и молекулярные механизмы изменений в астроцитарных отростках малоизучены. Критически важным для понимания и дальнейшего исследования этих структур является возможность разрешить ультратонкие детали самих астроцитов и областей их контактов с другими структурами [1]. Мелкие астроцитарные отростки имеют наноразмеры, что исключает использование световой микроскопии без дополнительного маркирования ткани флуоресцентными метками и обусловливает необходимость использования методов микроскопии высокого разрешения [2]. Современные подходы позволяют сочетать различные методы визуализации и манипулирования тканями для получения трехмерной картины таких сложных структур, как астроциты [3–5]. Однако данные различных взаимодополняющих методов получения изображений с большим пространственным разрешением требуют разработки не только процедур накопления данных, но и методик идентификации элементов на изображениях, алгоритмов восстановления трехмерных структур.

В данной работе мы представляем результаты проведения сравнительного анализа коррелятивных измерений систем отростков астроцитов методами просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ) с использованием ультрамикротомии (УМТ). В предыдущих работах нами была разработана уникальная научная установка (http://ckp-rf.ru/usu/486825/), объединяющая в себе техники СЗМ и УМТ [6–8]. Эта разработка позволяет многократно производить сверхтонкие (до 20 нм) срезы с поверхности образца с последующим получением СЗМ-изображений, восстанавливая таким образом морфологию образца. Данная методика получила название "сканирующая зондовая нанотомография" (СЗНТ) и может быть использована для восстановления трехмерной ультраструктуры биологических объектов за счет интегрирования СЗМ-изображений поверхности образца после последовательных сверхтонких срезов. Данный метод представляется перспективным для исследования тонкой структуры астроцитов, тем более что получение СЗМ-изображений может быть дополнено измерениями пространственного распределения флуоресцентно-меченых объектов и спектральной информации методом конфокальной микроспектроскопии на тех же участках [7]. Для корректной интерпретации изображений, полученных с помощью СЗМ, и однозначного определения элементов астроцитов в случае исследования тканей мозга требовалось проведение предварительных корреляционных измерений с помощью просвечивающей электронной микроскопии.

Для измерений использована ткань мозга “генотипически здоровых” мышей линии 5хFAD. Ткань мозга мышей была фиксирована путем транскардиальной перфузии растворами альдегидов, извлечена и дополнительно фиксирована 1%-ным раствором тетраоксида осмия. Затем – обезвожена и заключена в акрилатную среду.

При помощи ультрамикротома, входящего в состав установки СЗНТ с алмазным ножом Diatome Ultra AFM 35 (Diatome AG, Швейцария), были получены сверхтонкие срезы образцов тканей толщиной 70 нм. Применяемые алмазные ножи позволяют получить не только малую толщину среза, но и достаточно гладкую поверхность, что критически важно для проведения измерений методом СЗМ.

Несколько последних срезов были перенесены на стандартные медные бленды для электронной микроскопии с покрытием из формвара. После чего образцы были контрастированы с использованием насыщенных водных растворов уранилацетата и цитрата свинца согласно [9].

ПЭМ-изображения срезов нервной ткани были получены в режиме СПЭМ (сканирующей электронной микроскопии в просвечивающем режиме) с использованием микроскопа Zeiss Merlin (Zeiss, Германия). Для получения достаточного контраста изображений были использованы ускоряющие напряжения 20–24 кВ, ток зонда 150–180 пА. Такие параметры измерений позволили получать изображения как в просвечивающем режиме, так и в режиме обратно отраженных электронов.

Поверхность блока залитого образца нервной ткани непосредственно после выполнения срезов была проанализирована при помощи СЗМ, входящего в состав установки СЗНТ. Для ориентации на поверхности образца были использованы обзорные изображения с малым увеличением, на которых можно было найти реперные особенности, например крупные образования характерной формы. Такие реперные особенности были использованы для согласования масштаба и угла поворота изображений СЗМ и СПЭМ.

Поскольку при использовании СЗМ разрешение изображений ограничено количеством точек, в которых проводятся измерения, для выделения тонких астроцитарных структур были получены СЗМ-изображения меньшего размера с существенно более высоким латеральным разрешением. На рисунке приведены комплементарные ПЭМ- и СЗМ-изображения участков астроцитов. На ПЭМ-изображениях желтыми контурами отмечены участки, которые мы идентифицируем как астроциты. Соответствующие структуры на СЗМ-изображениях отмечены стрелками. Видно, что применение электронной микроскопии позволяет получить изображения более высокого качества. Однако СЗМ-изображения имеют достаточную детализацию для определения характерных деталей нервной ткани. Анализ приведенных данных позволяет заключить, что наиболее уверенно на СЗМ-изображениях можно регистрировать тонкие отростки астроцитов (веточки, листочки) толщиной 50–100 нм в окрестностях синапсов и щелевых контактов, которые выглядят как окружающие их удлиненные двух- или трехслойные структуры. Изучение подобных астроцитарно-нейронных взаимодействий является важной задачей, поскольку подвергается изменениям при ряде патологий. Приведенные изображения были получены для выполненного сверхтонкого среза при помощи ПЭМ и поверхности блока после среза при помощи СЗМ. Однако, несмотря на максимально приближенные к комплементарности объекты, коррелятивная морфология наблюдаемых структур не полностью совпадает, что говорит о том, что морфология астроцитарных участков может заметно изменяться на масштабе нескольких толщин среза, которая составляет всего несколько десятков нанометров.

 

Комплементарные ПЭМ- и СЗМ-изображений участков астроцитов. Обзорные изображения (слева) и увеличенные участки (справа). На увеличенных изображениях тонкие отростки астроцитов на ПЭМ-изображениях отмечены цветом, символами указаны комплементарные области.

 

Таким образом, на основании коррелятивных измерений методами СЗМ и ПЭМ в работе показано, что сканирующая зондовая микроскопия может применяться для эффективной визуализации тканей головного мозга и исследования особенностей строения астроцитов с пространственным разрешением на нанометровом уровне. При этом методически можно рекомендовать выполнение измерений с разрешением не более 2 нм/px. При анализе изображений в первую очередь необходимо регистрировать удлиненные двух- или трехслойные структуры толщиной от 50 до 100 нм, располагающиеся вокруг синапсных структур размерами около 1 мкм. Данные удлиненные структуры с высокой вероятностью являются тонкими астроцитарными отростками, которые можно сегментировать для последующей трехмерной реконструкции. Использование СЗНТ для последовательного удаления тонких слоев с поверхности блока и получения СЗМ-изображений тканей головного мозга даст возможность восстановить трехмерную картину распределений астроцитарных участков.

При этом важно отметить, что использование СЗМ для анализа поверхности блоков не требует контрастирования с применением соединений тяжелых металлов. Это может играть важную роль для минимизации нарушений клеточных структур, вызываемых фиксацией и контрастированием. Кроме того, соединения тяжелых металлов, используемые для контрастирования в электронной микроскопии, в большинстве случаев значительно снижают эффективность использования флуоресцентных маркеров. Таким образом, использование СЗНТ как метода исследований трехмерной ультраструктуры нервной ткани также расширяет возможности применения и коррелятивных методик флуоресцентной микроскопии.

Благодарности

Авторы благодарят Сутягину О. И. за помощь в подготовке биологических образцов.

Источник финансирования

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (проект № 22-14-00168) в части получения образцов и выполнения ПЭМ-исследований.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм и стандартов

Все исследования проводились в соответствии с принципами биомедицинской этики, изложенными в Хельсинкской декларации 1964 г. и последующих поправках к ней, а также в соответствии с Директивой 2010/63/EU об использовании животных для экспериментальных исследований и с этическими регламентами ИБХ РАН по содержанию и использованию животных, учитывающими этические и юридические нормы Rus-LASA и международные GLP-стандарты. Настоящее исследование одобрено комиссией ИБХ РАН по контролю за содержанием и использованием животных, протокол № 337/2021 от 15.11.2021 г.

Об авторах

О. И. Агапова

ФГБУ “Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В. И. Шумакова” Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: igor.agapov@gmail.com
Россия, Москва

А. Е. Ефимов

ФГБУ “Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В. И. Шумакова” Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: igor.agapov@gmail.com
Россия, Москва

Е. А. Образцова

ФГБУН “Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова” РАН; ФГАОУ ВО “Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)”

Email: igor.agapov@gmail.com
Россия, Москва; Долгопрудный

К. Е. Мочалов

ФГБУН “Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова” РАН

Email: igor.agapov@gmail.com
Россия, Москва

Д. О. Соловьева

ФГБУН “Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова” РАН

Email: igor.agapov@gmail.com
Россия, Москва

В. А. Олейников

ФГБУН “Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова” РАН; ФГАОУ ВО “Национальный исследовательский ядерный университет “МИФИ”

Email: igor.agapov@gmail.com
Россия, Москва; Москва

И. И. Агапов

ФГБУ “Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В. И. Шумакова” Министерства здравоохранения Российской Федерации

Автор, ответственный за переписку.
Email: igor.agapov@gmail.com
Россия, Москва

С. В. Готье

ФГБУ “Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В. И. Шумакова” Министерства здравоохранения Российской Федерации; ФГАОУ ВО “Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова” Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский университет)

Email: igor.agapov@gmail.com

академик

Россия, Москва; Москва

Список литературы

Дополнительные файлы