Approval of the method of electrophoretic separation and identification of some urine proteins in rats with toxic nephropathy

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

The aim of the article. The aim was to test the method for determining certain protein markers in rat urine by electrophoretic separation followed by mass spectrometric identification for early diagnostic of nephrotoxicity. The objectives of the study included assessing the reproducibility of the protein separation method, comparing rats urine protein profiles normal and after gentamicin sulfate administration, as well as a biochemical and morphological study of kidney biopsy specimens.

Materials and methods. Gentamicin sulfate (GS) was administered intramuscularly to rats of both sexes at a dose of 60 mg/kg b.w. for consequence 5 days. Daily urine was collected in the background, on the 3rd, 7th and 14th day from the start of the administration of GS in the metabolic cages. We measured the concentrations of total protein and creatinine in urine samples, the level of lipids in the homogenates of the kidneys. Electrophoretic separation of urine proteins was performed in the Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis. The gels were stained, and the stained zones were excised and enzymatic hydrolysis of the proteins was performed. Spectra of tryptic peptides were recorded on an ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF mass spectrometer (Bruker, Germany). Proteins were identified in the Biotools program by accessing the Mascot database (matrixscience.com).

Results. Assessment of reproducibility of the results of electrophoretic separation of rat urine proteins showed an acceptable value of the coefficient of variation (on average 8.03%) and the error of analysis (Δanalysis = 14.53%). It that normally in rats of males the alpha-2-uroglobulin precursor dominates in urine and in females immunoglobulin G light chains dominate was show. Against the background of the administration of GS, leukocytes in pathological concentrations appear in the urine in rats of both sexes; in males, the proteomic profile has a strong intraspecific dispersion, including due to sperm contamination; in females, well identified zones of albumin, alpha-1-antitrypsin, aminopeptidase M, beta-2-microglobulin, and transferrin was appear. A biochemical study of kidney homogenates an increase in total cholesterol (males) and triacylglycerides (females) revealed. Pathomorphological changes were similar in male and female rats in the form of fatty degeneration of the proximal tubule nephrothelium and leukocyte infiltration of interstitium and confirmed changes in the spectrum of urine proteins.

Conclusion. Based on the analysis of the experimental results it was found that the use of the technology of electrophoretic separation of proteins in PAGE under denaturing conditions followed by MALDI mass spectrometric identification (PAGE-MALDI-TOF/TOF) and densitometric determination of the percentage of protein fractions is applicable for the detection of nephrotoxicity. Due to gender differences in the protein spectrum it is preferable to examine the urine of female rats. Pathomorphological changes did not have gender differences.

About the authors

Konstantin V. Sivak

Smorodintsev Research Institute of Influenza

Author for correspondence.
Email: kvsivak@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-4064-5033
SPIN-code: 7426-8322
Scopus Author ID: 35269910300

PhD in Biology, Head of the Department of Preclinical Trials

Russian Federation, St. Petersburg

Yana A. Zabrodskaya

Smorodintsev Research Institute of Influenza; Petersburg Nuclear Physics Institute named by B.P. Konstantinov of NRC “Kurchatov Institute”; Peter the Great Saint Petersburg Polytechnic University

Email: zabryaka@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2012-9461

PhD in Physic, Researcher of the Department of Molecular Biology of Viruses

Russian Federation, St. Petersburg

Olga A. Dobrovolskaya

Smorodintsev Research Institute of Influenza

Email: dobrovolskaya.od@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-0857-4733

Researcher of the Laboratory of Genetic Engineering and Recombinant Protein Expression

Russian Federation, St. Petersburg

References

  1. Slater MB, Gruneir A, Rochon PA, et al. Identifying high-risk medications associated with acute kidney injury in critically ill patients: a pharmacoepidemiologic evaluation. Paediatr Drugs. 2017;19(1):59-67. https://doi.org/10.1007/s40272-016-0205-1.
  2. Сивак К.В. Механизмы нефропатологии токсического генеза // Патогенез. – 2019. – Т. 17. – № 2. – С. 16–29. [Sivak KV. Mechanisms of toxic nephropathology. Pathogenesis. 2019;17(2):16-29. (In Russ.)]. https://doi.org/ 10.25557/2310-0435.2019.02.16-29.
  3. Magalhães P, Pontillo C, Pejchinovski M, et al. Comparison of urine and plasma peptidome indicates selectivity in renal peptide handling. Proteomics Clin Appl. 2018;12(5):e1700163. https://doi.org/10.1002/prca.201700163.
  4. Rus-LASA. Директива Европейского парламента и Совета Европейского союза 2010/63/EU от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях. – СПб., 2012. – 48 с. [Rus-LASA. Directive of the European parliament and of the Council of the European Union 2010/63/EU for the protection of animals used for scientific purposes. Saint Petersburg; 2012. 48 р. (In Russ.)]
  5. Kimura J, Ichii O, Otsuka S, et al. Quantitative and qualitative urinary cellular patterns correlate with progression of murine glomerulonephritis. PLoS One. 2011;6(1):e16472. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0016472.
  6. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970;227(5259):680-685. https://doi.org/10.1038/ 227680a0.
  7. Antimonova OI, Lebedev DV, Zabrodskaya YA, et al. Changing times: fluorescence-lifetime analysis of amyloidogenic SF-IAPP fusion protein. J Struct Biol. 2019;205(1):78-83. https://doi.org/10.1016/j.jsb.2018.11.006.
  8. Стандартные технологические процедуры при проведении патологоанатомических исследований: клинические рекомендации RPS1.1. 2016 / П.Г. Мальков, Г.А. Франк, М.А. Пальцев; Российское общество патологоанатомов. – М.: Практическая медицина, 2017. – 135 с. [Standartnyye tekhnologicheskiye protsedury pri provedenii patologoanatomicheskikh issledovaniy: klinicheskiye rekomendatsii RPS1.1. 2016. P.G. Malkov, G.A. Frank, M.A. Pal’tsev. Russian Society of Pathologists. Moscow: Practical medicine; 2017. 135 p. (In Russ.)]
  9. Lehman-McKeeman LD, Caudill D. Biochemical basis for mouse resistance to hyaline droplet nephropathy: lack of relevance of the alpha 2u-globulin protein superfamily in this male rat-specific syndrome. Toxicol Appl Pharmacol. 1992;112(2):214-221. https://doi.org/10.1016/0041-008X(92)90190-4.
  10. Lehman-McKeeman LD, Caudill D. d-Limonene induced hyaline droplet nephropathy in alpha 2u-globulin transgenic mice. Fundam Appl Toxicol. 1994;23(4):562-568. https://doi.org/10.1006/faat.1994.1141.
  11. Ланда С.Б., Аль-Шукри С.Х., Горбачев М.И., и др. Патохимические особенности олигомерных форм белка Тамма – Хорсфалла при уролитиазе // Клиническая лабораторная диагностика. – 2016. – Т. 61. – № 6. – С. 335–341. [Landa SB, Al-Shukri SH, Gorbachev MI, et al. The pathochemical characteristics of oligomeric forms of Tamm-Horsfall protein under urolithiasis. Klinicheskaia laboratornaia diagnostika. 2016;61(6):335-341. (In Russ.)]. https://doi.org/10.18821/0869-2084-2016-6-335-341.
  12. Saunders DA, Begg EJ, Kirkpatrick CM, et al. Measurement of total phospholipids in urine of patients treated with gentamicin. Br J Clin Pharmacol. 1997;43(4):435-440. https://doi.org/10.1046/j.1365-2125.1997.00568.x.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. The determined zones of the PAGE-electrophoregrams of rat urine proteins (M — males and F — females) and their molecular weights (kDa). MM is a molecular weight marker (Bio-Rad). * the alpha-2u-globulin precursor or major urinary protein characteristic of males is indicated; # — number of sample

Download (148KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. Fragment of the mass spectrum of tryptic peptides (top), which reliably identified the protein alpha-2u globulin precursor (Rattus norvegicus), Score = 135 (threshold value 92). Ions and the corresponding numbers of amino acid residues are noted. The estimated sequences of the peptides, as well as their mass and error are presented below

Download (288KB)
Indexing metadata
4. Fig. 3. Fragment of the mass spectrum of tryptic peptides by which the Ig kappa chain (Rattus norvegicus) protein was reliably identified, Score = 78 (threshold value 72). Ions and the corresponding numbers of amino acid residues are noted (а). The table shows the expected sequences of the peptides, as well as their mass and error. The fragmentation spectrum of ion 1004.52, reliably identified as Ig kappa chain (Rattus norvegicus), Score = 46 (threshold 42), sequence WKIDGTER (b)

Download (335KB)
Indexing metadata
5. Fig. 4. Dynamics of leukocyturia in rats treated with gentamicin sulfate (a — males, b — female rats)

Download (744KB)
Indexing metadata
6. Fig. 5. Pathomorphological changes in the kidney in male (а) and female (b) rats after exposure to gentamicin. * fatty degeneration of the nephroepithelium; # leukocyte infiltration of interstitium. Paraffin sections, hematoxylin and eosin staining, x400 magnification

Download (624KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2019 Sivak K.V., Zabrodskaya Y.A., Dobrovolskaya O.A.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».