Синтез флуоресцентного РНК-аптамерa Broccoli в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Актуальность. РНК-аптамеры — это короткие одноцепочечные олигонуклеотиды, которые могут связываться с молекулами-мишенями с высокой специфичностью и аффинностью. Такие мишени очень разнообразны и могут представлять собой как отдельные ионы, так и целые клетки. РНК-аптамеры широко применяются в биологии и медицине для проведения фундаментальных исследований, а также в практических целях, в терапии и диагностике. В настоящее время, для получения аптамеров РНК в основном используются методы химического синтеза или синтеза in vitro. Однако эти методы являются дорогими, трудоемкими и малопродуктивными. Поэтому методы синтеза in vivo становятся все более привлекательными для ученых, работающих над оптимизацией производства аптамеров.

Цель данной работы — разработка репортерной системы для оптимизации синтеза малых молекул РНК в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Материалы и методы. Флуоресцентный РНК-аптамер Broccoli был использован для получения репортерной системы, позволяющей оптимизировать условия синтеза коротких РНК in vivo в клетках дрожжей. Этот аптамер имеет размер около 112 п.н. и связывается с флуоресцентным красителем DFHBI-1T. Отдельно от аптамера краситель практически не светится. При связывании его с аптамером и облучении светом с длиной волны 482 нм наблюдается эмиссия поглощенного излучения с пиком при 505 нм.

Результаты. Получена репортерная система, обеспечивающая синтез флуоресцентного РНК-аптамера Broccoli в клетках дрожжей S. cerevisiae. Транскрипция молекул РНК, содержащих аптамер, обеспечивается за счет регулируемого промотора гена GAL1. В синтезируемом транскрипте содержатся рибозимы HH и HDV, которые обеспечивают вырезание последовательности РНК-аптамера.

Выводы. Репортерная система на основе РНК-аптамера Broccoli может быть использована для оптимизации синтеза РНК-аптамеров in vivo в клетках дрожжей S. cerevisiae. Это является актуальной задачей в связи с активным применением таких аптамеров в научных исследованиях, биотехнологии и медицине.

Об авторах

Усама Аль Шанаа

Санкт-Петербургский государственный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: st072427@student.spbu.ru
ORCID iD: 0000-0003-1462-1687
SPIN-код: 7453-9258

мл. научн. сотр. кафедры генетики и биотехнологии

Россия, Санкт-Петербург

Андрей Михайлович Румянцев

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: rumyantsev-am@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1744-3890
SPIN-код: 9335-1184
Scopus Author ID: 55370658800

канд. биол. наук, мл. научн. сотр. кафедры генетики и биотехнологии

Россия, Санкт-Петербург

Елена Викторовна Самбук

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: e.sambuk@spbu.ru
ORCID iD: 0000-0003-0837-0498
SPIN-код: 8281-8020
Scopus Author ID: 6603061322

д-р биол. наук, профессор кафедры генетики и биотехнологии

Россия, Санкт-Петербург

Марина Владимировна Падкина

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: m.padkina@spbu.ru
ORCID iD: 0000-0002-4051-4837
SPIN-код: 7709-0449
Scopus Author ID: 6602596755

д-р биол. наук, профессор кафедры генетики и биотехнологии

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

  1. Barnett J.A. A history of research on yeasts 10: foundations of yeast genetics // Yeast. 2007. Vol. 24, No. 10. P. 799–845. doi: 10.1002/yea.1513
  2. Botstein D., Fink G.R. Yeast: an experimental organism for 21st Century biology // Genetics. 2011. Vol. 189, No. 3. P. 695–704. doi: 10.1534/genetics.111.130765
  3. Goffeau A., Barrell B.G., Bussey H., et al. Life with 6000 Genes // Science. 1996. Vol. 274, No. 5287. P. 546–567. doi: 10.1126/science.274.5287.546
  4. Karathia H., Vilaprinyo E., Sorribas A., Alves R. Saccharomyces cerevisiae as a model organism: a comparative study // PLoS One. 2011. Vol. 6, No. 2. ID e16015. doi: 10.1371/journal.pone.0016015
  5. Bolotin-Fukuhara M., Dumas B., Gaillardin C. Yeasts as a model for human diseases // FEMS Yeast Research. 2010. Vol. 10, No. 8. P. 959–960. doi: 10.1111/j.1567-1364.2010.00693.x
  6. Guthrie C., Fink G.R. Guide to yeast genetics and molecular biology. Academic Press, Cambridge, 1991. 194 p.
  7. Pronk J.T. Auxotrophic yeast strains in fundamental and applied research // Appl Environ Microbiol. 2002. Vol. 68, No. 5. P. 2095–2100. doi: 10.1128/AEM.68.5.2095-2100.2002
  8. Lohr D., Venkov P., Zlatanova J. Transcriptional regulation in the yeast GAL gene family: a complex genetic network // FASEB J. 1995. Vol. 9, No. 9. P. 777–787. doi: 10.1096/fasebj.9.9.7601342
  9. Nielsen J. Yeast systems biology: model organism and cell factory // Biotechnol J. 2019. Vol. 14, No. 9. ID e1800421. doi: 10.1002/biot.201800421
  10. Macreadie I., Dhakal S. “The awesome power of yeast” // Microbiology Australia. 2022. Vol. 43, No. 1. P. 19–21. doi: 10.1071/ma22007
  11. Szczebara F.M., Chandelier C., Villeret C., et al. Total biosynthesis of hydrocortisone from a simple carbon source in yeast // Nat Biotechnol. 2003. Vol. 21, No. 2. P. 143–149. doi: 10.1038/nbt775
  12. Paddon C.J., Westfall P.J., Pitera D.J., et al. High-level semi-synthetic production of the potent antimalarial artemisinin // Nature. 2013. Vol. 496, No. 7446. P. 528–532. doi: 10.1038/nature12051
  13. Klussmann S. The Aptamer Handbook: Functional Oligonucleotides And Their Applications // John Wiley & Sons. 2006. 500 p. doi: 10.1002/3527608192
  14. Lee J.F. Aptamer Database // Nucleic Acids Research. 2004. Vol. 32, No. S1. P. 95D–D100. doi: 10.1093/nar/gkh094
  15. Ellington A.D., Szostak J.W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands // Nature. 1990. Vol. 346. P. 818–822. doi: 10.1038/346818a0
  16. Tuerk C., Gold L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase // Science. 1990. Vol. 249, No. 4968. P. 505–510. doi: 10.1126/science.2200121
  17. Filonov G.S., Moon J.D., Svensen N., Jaffrey S.R. Broccoli: rapid selection of an RNA mimic of green fluorescent protein by fluorescence-based selection and directed evolution // J Am Chem Soc. 2014. Vol. 136, No. 46. P. 16299–16308. doi: 10.1021/ja508478x
  18. Paige J.S., Wu K.Y., Jaffrey S.R. RNA Mimics of Green Fluorescent Protein // Science. 2011. Vol. 333, No. 6042. P. 642–646. doi: 10.1126/science.1207339
  19. Filonov G.S., Kam C.W., Song W., Jaffrey S.R. In-gel imaging of RNA processing using broccoli reveals optimal aptamer expression strategies // Chem Biol. 2015. Vol. 22, No. 5. P. 649–660. doi: 10.1016/j.chembiol.2015.04.018
  20. Song W., Strack R.L., Jaffrey S.R. Imaging bacterial protein expression using genetically encoded RNA sensors // Nat Methods. 2013. Vol. 10, No. 9. P. 873–875. doi: 10.1038/nmeth.2568
  21. McConnell E.M., Nguyen J., Li Y. Aptamer-based biosensors for environmental monitoring // Front Chem. 2020. Vol. 8. ID434. doi: 10.3389/fchem.2020.00434
  22. Wiedman G.R., Zhao Y., Mustaev A., et al. An Aptamer-based biosensor for the azole class of antifungal drugs // mSphere. 2017. Vol. 2, No. 4. ID e00274–17. doi: 10.1128/mSphere.00274-17.
  23. Wu S., Zhang H., Shi Z., et al. Aptamer-based fluorescence biosensor for chloramphenicol determination using upconversion nanoparticles // Food Control. 2015. Vol. 50. P. 597–604. doi: 10.1016/j.foodcont.2014.10.003
  24. Eissa S., Zourob M. In vitro selection of DNA aptamers targeting β-lactoglobulin and their integration in graphene-based biosensor for the detection of milk allergen // Biosens Bioelectron. 2017. Vol. 91. P. 169–174. doi: 10.1016/j.bios.2016.12.020
  25. Yang Y.B., Yang X.D., Zou X.M., et al. Ultrafine graphene nanomesh with large on/off ratio for high-performance flexible biosensors // Adv Funct Mater. 2017. Vol. 27, No. 19. ID 1604096. doi: 10.1002/adfm.201604096
  26. Alizadeh N., Memar M.Y., Moaddab S.R., Kafil H.S. Aptamer-assisted novel technologies for detecting bacterial pathogens // Biomed Pharmacother. 2017. Vol. 93. P. 737–745. doi: 10.1016/j.biopha.2017.07.011
  27. Hoffmann S., Hoos J., Klussmann S., Vonhoff S. RNA aptamers and spiegelmers: synthesis, purification, and post-synthetic PEG conjugation // Curr Protoc Nucleic Acid Chem. 2011. Vol. 4. doi: 10.1002/0471142700.nc0446s46
  28. Kartje Z.J., Janis H.I., Mukhopadhyay S., Gagnon K.T. Revisiting T7 RNA polymerase transcription in vitro with the Broccoli RNA aptamer as a simplified real-time fluorescent reporter // J Biol Chem. 2021. Vol. 296. ID100175. doi: 10.1074/jbc.RA120.014553
  29. Duman-Scheel M. Saccharomyces cerevisiae (Baker’s Yeast) as an interfering RNA expression and delivery system // Curr Drug Targets. 2019. Vol. 20, No. 9. P. 942–952. doi: 10.2174/1389450120666181126123538
  30. Garrait G., Jarrige J.F., Blanquet-Diot S., Alric M. Genetically engineered yeasts as a new delivery vehicle of active compounds to the digestive tract: in vivo validation of the concept in the rat // Metab Eng. 2009. Vol. 11, No. 3. P. 148–154. doi: 10.1016/j.ymben.2009.01.001
  31. Phelps M.P., Seeb L.W., Seeb J.E. Transforming ecology and conservation biology through genome editing // Conserv Biol. 2020. Vol. 34, No. 1. P. 54–65. doi: 10.1111/cobi.13292
  32. Juergens H., Varela J.A., Gorter de Vries A.R., et al. Genome editing in Kluyveromyces and Ogataea yeasts using a broad-host-range Cas9/gRNA co-expression plasmid // FEMS Yeast Res. 2018. Vol. 18, No. 3. ID foy012. doi: 10.1093/femsyr/foy012
  33. Hanahan D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids // J Mol Biol. 1983. Vol. 166, No. 4. P. 557–580. doi: 10.1016/S0022-2836(83)80284-8
  34. Meilhoc E., Teissie J. Electrotransformation of Saccharomyces cerevisiae // Methods Mol Biol. 2020. Vol. 2050. P. 187–193. doi: 10.1007/978-1-4939-9740-4_21
  35. Filonov G.S., Jaffrey S.R. RNA Imaging with dimeric Broccoli in live bacterial and mammalian cells // Curr Protoc Chem Biol. 2016. Vol. 8, No. 1. P. 1–28. doi: 10.1002/9780470559277.ch150174
  36. Nelissen F.H., Leunissen E.H., van de Laar L., et al. Fast production of homogeneous recombinant RNA — towards large-scale production of RNA // Nucleic Acids Res. 2012. Vol. 40, No. 13. P. e102. doi: 10.1093/nar/gks292

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Схема репортерной конструкции, содержащей тандемный аптамер Broccoli, рибозимы Hammerhead (HH), Hepatitis Delta Virus (HDV) и сайты рестрикции (HindIII и XhoI) (a); вторичная структура основной части конструкции, демонстрирующая правильную укладку рибозима HH за счет добавленных в последовательность комплементарных участков (плеч гомологии) (b)

Скачать (124KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Общая схема конструирования плазмиды pYES2x2Broccoli. Указаны: элементы репортерной конструкции [красным — рибозимы типов Hammerhead (HH) и Hepatitis Delta Virus (HDV), зеленым — тандемный повтор аптамера Broccoli]; элементы, необходимые для поддержания плазмид в бактериях (серым — бактериальный ориджин репликации ori и ген устойчивости к ампициллину AmpR); элементы, необходимые для поддержания плазмид в клетках дрожжей и экспрессии репортерной конструкции (синим — промотор PGAL, терминатор CYC1, селективный маркер — ген URA3, ориджин репликации 2m ori)

Скачать (202KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Электрофореграммы результатов ПЦР-амплификации фрагментов экспрессионной кассеты в составе плазмиды pYES2x2Broccoli (a–c) и рестрикционного анализа (d): a, дорожка 1 — промотор гена GAL1, амплифицированный с использованием специфических праймеров PGAL-F и PGAL-R (530 п.н.); b, дорожка 1 — тандемный повтор x2Broccoli (292 п.н.), амплифицированный с использованием праймеров Broccoli 2F и Broccoli 2R; с, дорожка 2 — полноразмерная кассета экспрессии (1167 п.н.), включающая промотор гена GAL1, аптамеры Broccoli, рибозимы HH и HDV и терминатор CYC1, амплифицированая с использованием праймеров PGAL-F и CYC1-R; d, дорожка 3 — результаты рестрикционного анализа плазмиды pYES2x2Broccoli, имеющей два сайта рестрикции BglI (один сайт в конструкции экспрессионной кассеты, а другой вне ее), в результате которого наблюдается два фрагмента ДНК: 1510 и 4658 п.н. Использовали маркеры размерами ДНК 100 п.н. и 1 т.п.н. (Евроген). Размеры полученных фрагментов соответствуют теоретически ожидаемым

Скачать (101KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Средние значения флуоресценции (при длине волны 520 нм) суспензий клеток дрожжей S. cerevisiae, инкубированных в средах с глюкозой и галактозой. Измерения проводили в четырех повторностях. Указан 95 % доверительный интервал

Скачать (55KB)
Метаданные
6. Последовательность экспрессионной кассеты в составе плазмиды pYES2x2Broccoli

Скачать (597KB)
Метаданные

© Шанаа У.А., Румянцев А.М., Самбук Е.В., Падкина М.В., 2022

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.
 


Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».