Сравнение эффективности якорных белков ScAGα1p, KpCW51p, KpCW61p для поверхностного дисплея у дрожжей Komagataella phaffii

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Актуальность. Дрожжевой дисплей — эффективная технология выведения на поверхность клетки целевых белков посредством их слияния с белками клеточной стенки. Данная методика, в том числе, позволяет получать на основе дрожжей вакцинные препараты путем экспонирования на их клеточной поверхности белков-антигенов. Поиск и характеристика белков, позволяющих эффективно экспонировать целевые белки на поверхности клеток Komagataella phaffii, — актуальная задача.

Цель работы — сравнить эффективность белков клеточной стенки ScAGα1p, включая исследование нескольких вариантов кодирующей последовательности гена ScAGα1, а также KpCW51p, KpCW61p для экспонирования репортерного белка на поверхности клеток.

Материалы и методы. Изучаемые последовательности генов были проклонированы под контролем промотора гена АОХ1 в одной рамке считывания с геном репортерного белка eGFP и интегрированы в геном штамма Х-33 дрожжей K. phaffii.

Результаты. Иммуноцитохимический анализ и конфокальная микроскопия штаммов, экспонирующих на своей поверхности белок eGFP в условиях индукции промотора гена АОХ1, позволили выявить наиболее эффективный якорный белок. Наилучшие результаты были продемонстрированы при использовании белка ScAGα1 — альфа-агглютинина дрожжей Saccharomyces cerevisiae, структурный ген которого не содержал нативной 3'-некодирующей области.

Выводы. Полученные в работе плазмиды позволят получить штаммы дрожжей K. phaffii, эффективно экспонирующие на своей поверхности белки, в том числе антигены, которые можно будет использовать в качестве вакцинного препарата.

Об авторах

Михаил Александрович Цыганков

Санкт-Петербургский государственный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: mial.tsygankov@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2513-6655
SPIN-код: 1098-0995
Scopus Author ID: 56252740000

инженер-исследователь, биологический факультет, кафедра генетики и биотехнологии, лаборатория биохимической генетики

Россия, Санкт-Петербург

Андрей Михайлович Румянцев

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: rumyantsev-am@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1744-3890
SPIN-код: 9335-1184
Scopus Author ID: 55370658800

канд. биол. наук, ст. научн. сотр., биологический факультет, кафедра генетики и биотехнологии, лаборатория биохимической генетики

Россия, Санкт-Петербург

Анастасия Станиславовна Макеева

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: anastasimakeeva@mail.ru
SPIN-код: 1412-8449

инженер-исследователь, аспирантка, биологический факультет, кафедра генетики и биотехнологии, лаборатория биохимической генетики

Россия, Санкт-Петербург

Марина Владимировна Падкина

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: mpadkina@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4051-4837
SPIN-код: 7709-0449
Scopus Author ID: 6602596755

д-р биол. наук, профессор, биологический факультет, кафедра генетики и биотехнологии, лаборатория биохимической генетики

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

  1. Smith G.P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface // Science. 1985. Vol. 228, No. 4705. P. 1315–1317. doi: 10.1126/science.4001944
  2. Ueda M. Establishment of cell surface engineering and its development // Biosci Biotechnol Biochem. 2016. Vol. 80, No. 7. P. 1243–1253. doi: 10.1080/09168451.2016.1153953
  3. Schreuder M.P., Brekelmans S., van den Ende H., Klis F.M. Targeting of a heterologous protein to the cell wall of Saccharomyces cerevisiae // Yeast. 1993. Vol. 9, No. 4. P. 399–409. doi: 10.1002/yea.320090410
  4. Boder E.T., Wittrup K.D. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries // Nat Biotechnol. 1997. Vol. 15, No. 6. P. 553–557. doi: 10.1038/nbt0697-553
  5. Kurtzman C.P. Biotechnological strains of Komagataella (Pichia) pastoris are Komagataella phaffii as determined from multigene sequence analysis // J Ind Microbiol Biotechnol. 2009. Vol. 36, No. 11. P. 1435–1438. doi: 10.1007/s10295-009-0638-4
  6. Kim S.-Y., Sohn J.-H., Pyun Y.-R., Choi E.-S. A cell surface display system using novel GPI-anchored proteins in Hansenula polymorpha // Yeast. 2002. Vol. 19, No. 13. P. 1153–1163. doi: 10.1002/yea.911
  7. Tanaka T., Yamada R., Ogino C., Kondo A. Recent developments in yeast cell surface display toward extended applications in biotechnology // Appl Microbiol Biotechnol. 2012. Vol. 95, No. 3. P. 577–591. doi: 10.1007/s00253-012-4175-0
  8. Bielen A., Tepariс R., Vujaklija D., Mrsa V. Microbial anchoring systems for cell-surface display of lipolytic enzymes // Food Technol Biotechnol. 2014. Vol. 52, No. 1. P. 16–34.
  9. Wasilenko J.L., Sarmento L., Spatz S., Pantin-Jackwood M. Cell surface display of highly pathogenic avian influenza virus hemagglutinin on the surface of Pichia pastoris cells using alpha-agglutinin for production of oral vaccines // Biotechnol Prog. 2010. Vol. 26, No. 2. P. 542–547. doi: 10.1002/btpr.343
  10. Lei H., Jin S., Karlsson E., et al. Yeast surface-displayed H5N1 avian influenza vaccines // J Immunol Res. 2016. Vol. 2016. ID4131324. doi: 10.1155/2016/4131324
  11. Angelini A., Chen T.F., de Picciotto S., et al. Protein Engineering and selection using yeast surface display // Methods Mol Biol. 2015. Vol. 1319. P. 3–36. doi: 10.1007/978-1-4939-2748-7_1
  12. Cherf G.M., Cochran J.R. Applications of yeast surface display for protein engineering // Methods Mol Biol. 2015. Vol. 1319. P. 155–175. doi: 10.1007/978-1-4939-2748-7_8
  13. Pack S.P., Park K., Yoo Y.J. Enhancement of β-glucosidase stability and cellobiose-usage using surface-engineered recombinant Saccharomyces cerevisiae in ethanol production // Biotechnology Letters. 2002. Vol. 24. P. 1919–1925. doi: 10.1023/A:1020908426815
  14. Andreu C., Del Olmo M.L. Yeast arming systems: pros and cons of different protein anchors and other elements required for display // Appl Microbiol Biotechnol. 2018. Vol. 102, No. 6. P. 2543–2561. doi: 10.1007/s00253-018-8827-6
  15. Mattanovich D., Callewaert N., Rouzé P., et al. Open access to sequence: browsing the Pichia pastoris genome // Microb Cell Fact. 2009. Vol. 8. ID53. doi: 10.1186/1475-2859-8-53
  16. Cereghino J.L., Cregg J.M. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris // FEMS Microbiol Rev. 2000. Vol. 24, No. 1. P. 45–66. doi: 10.1111/j.1574-6976.2000.tb00532.x
  17. Падкина М.В., Самбук Е.В. Перспективы использования дрожжевого дисплея в биотехнологии и клеточной биологии (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. 2018. Т. 54, № 4. С. 337–351. doi: 10.7868/S0555109918040013
  18. Ahmad M., Hirz M., Pichler H., Schwab H. Protein expression in Pichia pastoris: recent achievements and perspectives for heterologous protein production // Appl Microbiol Biotechnol. 2014. Vol. 98, No. 12. P. 5301–5317. doi: 10.1007/s00253-014-5732-5
  19. Prabhu A.A., Boro B., Bharali B., et al. Gene and process level modulation to overcome the bottlenecks of recombinant proteins expression in Pichia pastoris // Curr Pharm Biotechnol. 2017. Vol. 18, No. 15. P. 1200–1223. doi: 10.2174/1389201019666180329112827
  20. Cereghino G.P.L., Cereghino J.L., Ilgen C., Cregg J.M. Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris // Curr Opin Biotechnol. 2002. Vol. 13, No. 4. P. 329–332. doi: 10.1016/S0958-1669(02)00330-0
  21. Gaboardi G.C., Alves D., de los Santos D.G., et al. Influence of Pichia pastoris X-33 produced in industrial residues on productive performance, egg quality, immunity, and intestinal morphometry in quails // Sci Rep. 2019. Vol. 9, No. 1. ID 15372. doi: 10.1038/s41598-019-51908-0
  22. Mergler M., Wolf K., Zimmermann M. Development of a bisphenol A-adsorbing yeast by surface display of the Kluyveromyces yellow enzyme on Pichia pastoris // Appl Microbiol Biotechnol. 2004. Vol. 63, No. 4. P. 418–421. doi: 10.1007/s00253-003-1361-0
  23. Wang Q., Li L., Chen M., et al. Construction of a novel system for cell surface display of heterologous proteins on Pichia pastoris // Biotechnol Lett. 2007. Vol. 29, No. 10. P. 1561–1566. doi: 10.1007/s10529-007-9430-6
  24. Zhang L., Liang S., Zhou X., et al. Screening for glycosylphosphatidylinositol-modified cell wall proteins in Pichia pastoris and their recombinant expression on the cell surface // Appl Environ Microbiol. 2013. Vol. 79, No. 18. P. 5519–5526. doi: 10.1128/AEM.00824-13
  25. Yang J., Huang K., Xu X., et al. Cell Surface Display of Thermomyces lanuginosus Lipase in Pichia pastoris // Front Bioeng Biotechnol. 2020. Vol. 8. ID544058. doi: 10.3389/fbioe.2020.544058
  26. Matsuda T., Cepko C.L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro // PNAS USA. 2004. Vol. 101, No. 1. P. 16–22. doi: 10.1073/pnas.2235688100
  27. Wu S., Letchworth G.J. High efficiency transformation by electroporation of Pichia pastoris pretreated with lithium acetate and dithiothreitol // Biotechniques. 2004. Vol. 36, No. 1. P. 152–154. doi: 10.2144/04361DD02
  28. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Москва: Мир, 1984.
  29. graphpad.com [Электронный ресурс]. GraphPad Prism software [дата обращения: 2022 Oct 10]. Доступ по ссылке: https://www.graphpad.com/
  30. Lipke P.N., Kurjan J. Sexual agglutination in budding yeasts: structure, function, and regulation of adhesion glycoproteins // Microbiol Rev. 1992. Vol. 56, No. 1. P. 180–194. doi: 10.1128/mr.56.1.180-194.1992

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Схема плазмид, полученных в работе: a — плазмида с репортерным геном eGFP; b — полученные плазмиды с геном eGFP и генами белков клеточной стенки. 5'AOX1 — промотор гена AOX1, α-factor — альфа-фактор дрожжей; PTEF1 — дрожжевой промотор гена TEF1; PEM7 — бактериальный промотор; CYC1 TT — терминаторная область дрожжевого гена CYC1; Zeocin — ген устойчивости к зеоцину; pUC ori — ориджин-репликации; AOX1 TT — область терминации транскрипции гена AOX1; eGFP — ген репортерного белка; ScAGα1l (long), ScAGα1, KpCW51, KpCW61 — белки клеточной стенки; XhoI, XbaI, AgeI — сайты узнавания рестриктаз

Скачать (171KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Электрофореграмма продуктов ПЦР с праймерами к генам ScAGα1long, ScAGα1, KpCW51, KpCW61. М — маркер NL001 (Евроген, Россия); 1 — ScAGα1long (ожидаемый фрагмент — 1421 п.н.), 2 — ScAGα1 (ожидаемый фрагмент — 985 п.н.), 3 — KpCW51 (ожидаемый фрагмент — 612 п.н.), 4 — KpCW61 (ожидаемый фрагмент — 171 п.н.)

Скачать (237KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Электрофореграмма продуктов ПЦР на матрице хромосомной ДНК дрожжевых трансформантов с генами ScAGα1long, ScAGα1, KpCW51, KpCW61 в одной рамке считывания с геном репортерного белка eGFP с использованием обратных праймеров к соответствующим генам белков клеточной стенки и прямым праймером к гену белка eGFP (1–3) или праймером к фрагменту гена AOX1 (4). М — маркер NL001 (Евроген, Россия); K+ — положительные контроли (плазмиды, которыми трансформировали исходный дрожжевой штамм); K– — отрицательные контроли (ПЦР реакционные смеси не содержащие матриц ДНК); 1 — ScAGα1long (ожидаемый фрагмент — 2158 п.н.); 2 — ScAGα1 (ожидаемый фрагмент — 1717 п.н.); 3 — KpCW51 (ожидаемый фрагмент — 1344 п.н.), 4 — KpCW61 (ожидаемый фрагмент — 1225 п.н.)

Скачать (256KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Конфокальная микроскопия полученных штаммов с репортерным белком eGFP. В качестве контрольного варианта (K–) использовали клетки исходного штамма K. phaffii X-33

Скачать (219KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Флуоресценция клеток с белком eGFP (a) и меченых красителем Cy3-антител к белку eGFP (b). Данные представлены со стандартной ошибкой среднего. K– — исходный штамм X-33

Скачать (84KB)
Метаданные

© Цыганков М.А., Румянцев А.М., Макеева А.С., Падкина М.В., 2022

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.
 


Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».