Lysosomal storage diseases. Sphingolipidoses — sphingomyelin lipidosis, or Niemann–Pick disease, Wolman disease

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

В предыдущих номерах журнала представлена общая характеристика лизосомных болезней накопления [2], дано подробное описание мукополисахаридозов [4–6] и цереброзидозов, к числу которых относятся болезни Фабри, Гоше и Фарбера [7]. Данный обзор посвящен описанию гликосфинголипидозов, сопровождающихся нарушением метаболизма и избыточным накоплением в ретикулоэндотелиальных клетках не только сфинголипидов, но и свободного холестерина. Прежде всего, это сфингомиелиновый липидоз, или болезнь Ниманна – Пика, — клинически полиморфная и генетически гетерогенная группа редких моногенных заболеваний. К детской форме I относятся классический острый тип А (нейронопатия) и хронический висцеральный тип B. Оба типа являются аллельными заболеваниями и обусловлены присутствием различных рецессивных мутаций в гене SMPD1 лизосомной кислой сфингомиелиназы (ASM) [43–45]. Юношеская и взрослая форма II, или хроническая нейронопатия тип C, — генетически гетерогенная группа заболеваний. В 95 % случаев у больных обнаруживаются мутации в гене NPC1 (тип С1) и в 5 % — в гене NPC2 (тип С2) [21, 30, 31]. Продуктами этих генов становятся трансмембранные белки, отвечающие за транспорт холестерина и других липидов. Болезнь накопления эфиров холестерина, или болезнь Вольмана, обусловлена наследственной недостаточностью лизосомной кислой липазы А [12, 37, 53]. Повышенный интерес к этим болезням связан с появлением и практической доступностью методов индивидуальной молекулярной диагностики, принципиальной возможностью проведения неонатального скрининга и разработкой безопасных и эффективных методов не только симптоматического, но и патогенетического лечения некоторых из этих тяжелых наследственных заболеваний.

БОЛЕЗНЬ НИМАННА – ПИКА, СФИНГОМИЕЛИНОВЫЙ ЛИПИДОЗ

Клиника и эпидемиология

Болезнь Ниманна – Пика, или сфингомиелиновый липидоз, — это генетически гетерогенная группа аутосомно-рецессивных заболеваний, обусловленных наследственной недостаточностью ферментов, участвующих в деградации сфингомиелина, а также в транспорте и метаболизме холестерина [8–10]. В основе патогенеза заболевания лежит накопление липидов, главным образом, сфингомиелина и свободного холестерина в ретикулоэндотелиальных и других типах клеток, что ведет к их избирательной гибели. Особенно чувствительны к этому дефекту клетки центральной нервной системы (ЦНС).

Характерные симптомы болезни Ниманна – Пика, как группы заболеваний, — гепатоспленомегалия, задержка физического и умственного развития. Серьезные неврологические расстройства включают прогрессирующую деменцию, спастические парезы и параличи с угнетением сухожильных рефлексов и судорожным синдромом на более поздних стадиях болезни. У больных могут нарушаются зрение и слух. При исследовании глазного дна нередко отмечается вишнево-красное пятно — симптом «вишневой косточки». В пунктате костного мозга, печени, селезенки, лимфатических узлов обнаруживаются крупные вакуолизированные клетки Пика, так называемые «пенистые» клетки.

В зависимости от времени дебюта выделяют детские, юношеские и взрослые формы. К детским формам (I) относятся классическая острая нейронопатия — тип А, и хроническая висцеральная форма — тип B. К юношеским и взрослым формам (II) относятся хроническая нейронопатия тип C и новошотландский вариант — тип D. Все формы отличаются высоким клиническим полиморфизмом.

У 85 % больных сфингомиелиновым липидозом типа А симптомы развиваются к 4–6 мес., смерть наступает в возрасте до 3 лет. Характерными симптомами болезни Ниманна – Пика типа А считаются задержка роста, дефицит веса, частые респираторные инфекции, затяжная неонатальная гипербилирубинемия. Родители могут предъявлять жалобы на рвоту, трудности при кормлении, склонность к запорам, беспричинные подъемы температуры, потерю приобретенных ранее навыков. При осмотре ребенка можно отметить выступающий живот за счет гепатоспленомегалии и слабость мышц передней брюшной стенки, диффузную мышечную гипотонию, ксантомы на коже, увеличение лимфатических узлов. Для детей характерна задержка психомоторного развития с переходом в интеллектуальный дефицит в более старшем возрасте, быстрое прогрессирование неврологической симптоматики от мышечной гипотонии и гипорефлексии к спастичности, мышечной ригидности и атетоидных движений, развитию судорожного синдрома [8]. При обследовании отмечают развитие анемии и тромбоцитопении, повышение трансаминаз, гиперлипидемию. Рентгенологически выявляют диффузные гpануляpные или pетикуляpные инфильтpаты в легких [11].

При форме В первые симптомы заболевания отмечаются в возрасте 2–6 лет, а неврологическая симптоматика не характерна. Возможна низкорослость. Характерны выступающий живот и гепатоспленомегалия, лимфаденопатия, частые респираторные инфекции. Для поражения легких характерно постепенное прогрессирование с развитием инфильтрации альвеол, интерстициальными и нодулярными изменениями и исходом в дыхательную недостаточность к 20–25 годам. Клиническая диагностика этой формы заболевания часто бывает затруднена. Пациенты с болезнью Ниманна – Пика типа В доживают до подросткового или взрослого возраста. Причинами летального исхода могут быть дыхательная недостаточность, цирроз печени и геморрагические симптомы как результат печеночной недостаточности и дефицита факторов свертывания крови [51].

Группы риска для выявления сфингомиелинового липидоза типа В: (1) кардиологические больные с низкими уровнями липопротеиной высокой плотности и (2) эндокринными нарушениями, сочетающимися с задержкой роста [76].

Болезнь Ниманна – Пика тип С характеризуется более поздним началом, преобладанием неврологической симптоматики в клинической картине. При юношеских формах дебют и скорость течения болезни могут значительно варьировать. При ретроспективном обследовании 70 пациентов из разных стран с типом С болезни Ниманна – Пика возраст начала клинических проявлений варьировал от неонатального периода до 55 лет. Смерть наступала в возрасте от 5 до 15 лет [87]. В зависимости от возраста манифестации выделяют следующие формы болезни типа С [9]:

• перинатальная (дебют до 3 мес.);
• ранняя младенческая (дебют в 3–24 мес.);
• поздняя младенческая (2–6 лет);
• ювенильная (6–15 лет);
• подростковая или взрослая форма (>15 лет).

Для всех форм характерны гепатоспленомегалия, задержка психомоторного развития и мышечная гипотония. Холестаз и спленомегалия без признаков портальной гипертензии являются ранним и патогномоничным симптомокомплексом болезни Ниманна – Пика типа С. Тем не менее опираться на эти симптомы возможно только в раннем возрасте, так как признаки холестаза самопроизвольно разрешаются к возрасту 6–8 мес., в то время как гепатоспленомегалия может сохраняется длительно. Висцеральные проявления обычно предшествуют симптомам со стороны нервной системы [9].

При раннем дебюте неиммунная водянка, гепатоспленомегалия и асцит развиваются внутриутробно или вскоре после рождения ребенка, в дальнейшем появляются симптомы холестаза, снижение мышечного тонуса, развивается поражение легких (инфильтраты). У 10 % пациентов болезнь имеет фульминантное течение с развитием печеночной недостаточности и летальным исходом до возраста 1 года. Поздняя младенческая форма характеризуется появлением мозжечковых расстройств (атаксии), бульбарного и псевдобульбарного (дизартрия, дисфагия), судорожного синдромов, надъядерного пареза взора.

Поздние формы заболевания характеризуются медленным прогрессированием и дебютируют в подростковом возрасте или у взрослых. Первыми клиническими симптомами у этой группы пациентов могут быть либо большие психозы, либо офтальмоплегия или дистония с сохранением интеллектуальных функций. При ювенильной форме наблюдаются экстрапирамидные нарушения — гиперкинезы, брадикинезия, мышечная дистония, вертикальный парез взора, геластическая катаплексия. Пациенты, доживающие до подросткового или взрослого возраста, страдают когнитивными и психическими нарушениями, такими как психозы, имеют склонность к депрессии и развитию шизофреноподобных расстройств [9]. Вертикальный парез взора — один из самых важных диагностических признаков заболевания. Для взрослых пациентов характерны умеренная гепатоспленомегалия и относительно небольшое накопление сфингомиелина в гепатоцитах, клетках селезенки и костного мозга.

На основании опыта наблюдения за 87 американскими пациентами с болезнью Ниманна – Пика типа С1 выявлен средний возраст диагностики — 10 лет (около 50 % пациентов — до 7 лет) [29]. Средний возраст летального исхода составил 16 лет, хотя половина из них погибла до 12,5 лет. Наиболее частыми симптомами при рождении была желтуха (52 %) с последующим увеличением селезенки (36 %) и печени (31 %); менее частыми — асциты (19 %) и мышечная гипотония (6 %). При дальнейшем развитии ребенка неуклюжесть отмечается у 87 % больных, трудности с обучением — у 87 %, атаксия — у 83 %, дисфагия — у 80 % и вертикальный парез взора — у 81 %. Эти данные положены в основу диагностики болезни Ниманна – Пика II и составления национальной компьютерной базы данных пациентов [9, 10, 65].

Окуломоторные нарушения зачастую являются ключевыми признаками, позволяющими заподозрить болезнь Ниманна – Пика типа С. Обычно они начинаются в старшем младенческом возрасте с нарушения саккадических движений глаз. Симптомы могут быть пропущены при клиническом осмотре, если не оцениваются самопроизвольные движения глазных яблок. Первыми нарушаются вертикальные движения глаз, затем появляются нарушения движений по горизонтали. На начальных стадиях нарушаются самопроизвольные саккадические движения, при сохранении нормальных плавных движений глаз. С течением времени глазные симптомы прогрессируют до полного вертикального пареза взора [9].

С генетической точки зрения болезнь Ниманна – Пика делится на 3 типа. Детские формы сфингомиелинового липидоза типов А и В являются аллельными заболеваниями, так как обусловлены присутствием гомозиготных или компаунд-гетерозиготных инактивирующих мутаций в одном и том же гене SMPD1 лизосомной кислой сфингомиелиназы (ASM) [43–45].

Юношеские и взрослые формы II генетически гетерогенны [9, 10]. У 95 % пациентов с клиническим типом С обнаруживаются мутации в гене NPC1, вовлеченном в контроль внутриклеточного перемещения холестерина и других липидов. Это генетический тип С1, к которому относится также и новошотландский клинический тип D. У 5 % пациентов с юношескими и взрослыми формами болезни Ниманна – Пика обнаруживаются мутации в другом гене NPC2, белковый продукт которого участвует в связывании и транспорте холестерина. Это генетический тип С2. Точные взаимоотношения между белками, кодируемыми генами NPC1 и NPC2, до сих пор изучены недостаточно. Клиническая диагностика двух генетических типов сфингомиелинового липидоза С1 и С2 практически невозможна. Она может быть осуществлена только с привлечением данных молекулярно-генетического анализа [3, 20, 26].

Болезнь Ниманна – Пика относится к числу редких аутосомно-рецессивных заболеваний. Однако в некоторых этнических группах и генетических изолятах ее частота достаточно велика. Так, в 40 % всех случаев она встречается среди евреев-ашкеназов, и в этой популяции ее частота составляет 1 : 40 000. Необычно высокая частота висцеральной формы болезни зарегистрирована на севере Африки в Марокко, Алжире и Тунисе [84]. В других популяциях частота детских типов А и В болезни Ниманна – Пика оценивается как 1 : 250 000, а юношеских форм типа С — 1 : 100 000–120 000 [10]. Юношеский тип D заболевания с высокой частотой встречается в Новой Шотландии среди населения французского происхождения. Так, в одном из районов страны частота больных достигает 1 %, а частота гетерозигот колеблется в пределах от 10 до 26 % [30, 91].

При обобщении результатов параллельного экзомного секвенирования, выполненного в четырех независимых исследованиях, были получены несмещенные оценки частоты болезни Ниманна – Пика типа С и вариантов С1 и С2. Они составляют 1,12, 1,08 и 0,03 на 100 000 новорожденных соответственно. При этом происходит недооценка вариантов С1 с поздним началом, и требуется их дополнительный скрининг в группах высокого риска [90].

БОЛЕЗНЬ НИМАННА – ПИКА I, ТИПЫ A И B

Биохимические основы патогенеза

Первичный биохимический дефект при детских формах болезни типов A и B — отсутствие или снижение активности лизосомной сфингомиелиназы, катализирующей расщепление сфингомиелина, выполняющего функцию стабилизатора клеточных мембран, до фосфорилхолина и церамида. В результате нарушения катаболизма сфингомиелина происходит его накопление в лизосомах клеток многих органов больного. Одновременно происходит накопление других фосфолипидов и холестерина, также являющегося основным структурным компонентом мембран. Гистологически это выявляется в появлении «пенистых» клеток.

Картирование и идентификация гена SMPD1

Определение аминокислотной последовательности фрагмента экстрагированной из мочи ASM позволило искусственно синтезировать смесь олигонуклеотидов, с помощью которых был проведен скрининг двух тканеспецифических библиотек генов фибробластов и плаценты человека с целью изоляции кДНК-овых последовательностей гена ASM — SMPD1 [68]. С использованием методов соматической гибридизации ген SMPD1 был картирован в коротком плече хромосомы 11 [67]. Его локализация в области 11p15 доказана методом гибридизации in situ. Ген SMPD1 расположен в импринтированной области генома и экспрессируется преимущественно с материнской хромосомы [72].

Отобранные кДНК-последовательности были использованы в дальнейшем в качестве зондов для изоляции геномной ДНК и анализа его экспрессии. Определена полная нуклеотидная последовательность гена ASM, а также достаточно протяженных районов, фланкирующих ген с двух сторон [73]. Кодирующая часть гена разделена на 6 экзонов, величина которых варьирует от 77 до 773 пар оснований. Cамый крупный экзон 2 кодирует 258 аминокислот, что составляет 44 % зрелого полипептида. Ген SMPD1 повсеместно экспрессируется, то есть относится к числу генов «домашнего хозяйства». Оказалось, что в различных тканях, в частности, в фибробластах и плаценте, в результате альтернативного сплайсинга образуются различные изоформы сфингомиелиназы.

Мутации в гене SMPD1

Идентификация мутаций в гене SMPD1 у пациентов с детскими формами сфингомиелинового липидоза послужила доказательством его причастности к развитию болезни [43, 80]. В настоящее время описано более 100 мутаций в гене SMPD1. Показано, что тяжелые мутации, такие как небольшие делеции, приводящие к сдвигу рамки считывания, нонсенс-мутации и аминокислотные замены, полностью разрушающие каталитическую активность сфингомиелиназы, обнаруживаются у пациентов с типом А болезни Ниманна – Пика. У пациентов с типом B найдены миссенс-мутации и делеции, не сопровождающиеся сдвигом рамки считывания. В опытах по сайт-направленному мутагенезу было показано, что при миссенс-мутациях сохраняется остаточная активность фермента.

Для детских форм заболевания характерно также присутствие мажорных мутаций, специфичных для различных этнических групп. Так, суммарная частота трех мутантных аллелей среди больных типом A евреев-ашкеназов сфингомиелинового липидоза достигает 65 %, что является основанием для скрининга гетерозиготных носителей мутаций в данной этнической группе [43–45]. Две из этих мутаций — L302P и делеция одного нуклеотида в 330-й позиции гена — полностью разрушают каталитическую активность фермента. Эти мутации не найдены у пациентов нееврейского происхождения или у пациентов с типом B заболевания. Третья мутация — R496L, является мажорной среди больных сфингомиелиновым липидозом типа А, но и в этом случае ее частота среди пациентов еврейского происхождения составляет 32 %, а нееврейского — только 5 % [44].

Частой среди пациентов с висцеральной формой заболевания в этнической группе евреев-ашкеназов является делеция трех нуклеотидов, приводящая к отсутствию аргинина в 608-м положении сфингомиелиназы — delR608 [44]. Эту мутацию гораздо реже находят у пациентов с типом B, принадлежащих к другим национальностям, за одним очень важным исключением. Оказалось, что в странах, расположенных в северо-западной части Африки, частота delR608 среди мутантных аллелей гена SMPD1 составляет около 80 % [84]. Удивительным можно рассматривать тот факт, что гомозиготы по delR608 характеризуются различной каталитической активностью сфингомиелиназы и варьирующей тяжестью течения сфингомиелинового липидоза. По-видимому, на проявление этой мутации могут оказывать влияние какие-то другие генетические или средовые факторы.

Экспериментальные модели

Создана трансгенная «нокаут»-линия с направленно разрушенным геном Asm мыши [60]. У гомозиготных мутантов наблюдались массивные накопления сфингомиелина в ретикулоэндотелиальной системе печени, селезенки, костного мозга, легких и ЦНС. Ганглиозный слой клеток Пуркинье мозжечка к 4 мес. оказался полностью разрушен, что на фенотипическом уровне проявлялось в виде тяжелого нарушения нейромоторики. В целом клиническая картина была сходна с нейровисцеральной формой сфингомиелинового липидоза А. Аналогичные результаты были получены на другой ASM-дефицитной «нокаут»-линии мышей [33]. Эти модели успешно используются для разработки ферментной заместительной терапии (ФЗТ) пациентов с болезнью Ниманна – Пика I [74].

С использованием новой технологии сконструирована еще одна трансгенная «нокаут»-линия мышей, в которой стабильно сохранялся низкий уровень фракция лизосомной сфингомиелиназы (L-SM) и полностью отсутствовала секреторная сфингомиелиназа (S-SM) [52]. В различных органах мутантных животных активность L-SM колебалась в пределах 1–14 %, и к 8 мес. уже присутствовали патологические накопления сфингомиелина. В мозге активность L-SM составляла от 11,5 до 18,2 %, однако клетки Пуркинье мозжечка были полностью сохранны. Этого было достаточно, чтобы даже при отсутствии S-SM у мутантных мышей не развивались тяжелые неврологические проявления сфингомиелинового липидоза, улучшалась общая жизнеспособность и увеличивалась продолжительность жизни по сравнению с Asm-мутантами.

Лабораторная диагностика и лечение

Диагностика заболевания основана на оценке клинических проявлений сфингомиелинового липидоза в сочетании с наличием «пенистых» клеток в пунктате костного мозга и печени, снижением активности сфингомиелиназы в лейкоцитах и накоплением холестерина, сфингомиелина и других фосфолипидов в биоптате печени. Подтверждением диагноза болезни Ниманна – Пика I является идентификация мутаций в гене SMPD1.

В качестве перспективного направления лечения пациентов с болезнью Ниманна – Пика I одной из первых была предложена фармакологическая шаперонотерапия, основанная на изучении молекулярных механизмов коррекции проницаемости лизосомных мембран, возникающей под влиянием различных форм стресса. Нарушение стабильности лизосом — один из главных маркеров стресс-индуцируемой клеточной гибели. При типах А и В болезни Ниманна – Пика, обусловленной наследственной недостаточностью ASM, также наблюдается заметное увеличение проницаемости лизосом. При стрессе происходит транслокация на лизосомы небольшого белка теплового шока Hsp70 и его связывание с одним из кофакторов лизосомного сфингомиелинового метаболизма (BMP), что в конечном счете и приводит к стабилизации лизосомных мембран [36]. Искусственное ингибирование взаимодействия Hsp70 с BMP с помощью антител к BMP или введения Trp90Phe-замены в Hsp70, так же как фармакологическое или генетическое ингибирование ASM, предотвращает Hsp70-опосредованную стабилизацию лизосомных мембран. Эти результаты открывают возможность для разработки новой стратегии лечения сфиномиелинового липидоза и других лизосомных болезней накопления с помощью рекомбинантной формы Hsp70. Однако этот подход не нашел пока дальнейшего продолжения.

Доказана безопасность и эффективность ФЗТ ненейронопатической формы болезни Ниманна – Пика типа В с помощью внутривенных инъекций рекомбинантной кислой сфингомиелиназы (rhASM) — олипудазы альфа [89]. Разработаны и прошли первую фазу клинических испытаний оптимальные схемы индивидуального лечения больных в отношении необходимых доз и периодичности введения препарата, приводящие к устойчивому снижению накопления сфингомиелина и периодическому появлению церамида — продукта катаболизма сфингомиелина, уменьшению объема селезенки и печени в сочетании с улучшением общих показателей качества жизни [54].

Однако ФЗТ не может быть использована для лечения нейронопатической формы болезни Ниманна – Пика, так как вводимые препараты не проникают через гематоэнцефалический барьер. Это ограничение может быть преодолено с помощью генотерапии. На приматах показана безопасность прямой инъекции в церебелломедуллярную цистерну гена ASM человека в составе аденоассоциированного вектора, серотип 9 — AAV9-hASM [71]. Терапевтический эффект этой процедуры был оценен на модельной «нокаут»-линии мышей ASM-KO. После введения AAV9-hASM наблюдали длительную экспрессию трансгена во многих клетках головного и спинного мозга животных без появления каких-либо признаков токсичности или воспалительных реакций. Спустя 2 мес. после проведенной процедуры в мозге мышей не наблюдали свойственные этой линии проявления нейронопатического сфингомиелинового липидоза, такие как ухудшение моторики и памяти, накопление сфингомиелина, увеличение размеров лизосом и гибель нейронов. Активность ASM появлялась не только в мозге, но и в плазме крови, наряду с уменьшением накопления сфингомиелина и снижением воспаления в печени. Найдена минимальная доза трансгена, способная оказывать подобный терапевтический эффект [79]. Эти результаты показывают перспективность генотерапии для лечения болезни Ниманна – Пика типа А.

БОЛЕЗНЬ НИМАННА – ПИКА II, ЮВЕНИЛЬНЫЕ ФОРМЫ, ТИПЫ С1 И С2

Опыты по межаллельной комплементации, выполненные на культурах фибробластов больных, показали, что тип С болезни Ниманна – Пика II генетически неоднороден [78]. В небольшом проценте семей прослеживается сцепление заболевания с цитогенетическими маркерами длинного плеча хромосомы 14, а не 18q11.2, в которой расположен ген NPC1 [83]. Новый генетический вариант болезни Ниманна – Пика был обозначен как тип С2, а соответствующий мутантный ген — NPC2, в отличие от типа С1, обусловленного мутациями в гене NPC1.

Биохимические основы патогенеза

95 % юношеских форм болезни Ниманна – Пика типа С и новошотландский вариант тип D вместе составляют генетический тип С1, обусловленный наследственной недостаточностью большого мембранного гликопротеина, локализованного на поверхности лизосом и эндосом [85]. Основная функция этого высоко консервативного связанного с мембраной белка, кодируемого геном NPC1, — высвобождение холестерина и других гликолипидов из лизосом и эндосом, при этом он действует как трансмембранная молекулярная помпа [82]. Белок NPC1 состоит из 1278 аминокислот, содержит 13 трансмембранных доменов, 5 из которых формируют стеролчувствительную область, и 3 большие гидрофильные цитоплазматические петли с дилейциновыми мотивами, определяющими ассоциацию белка с эндосомами [20, 34]. Прослежена гомология белка NPC1 с некоторыми другими белками, участвующими во внутриклеточном гомеостазе холестерина, а также с морфогенетическим рецептором «Patched», дефектным у пациентов с синдромом базально-клеточных невусов.

С использованием методов иммуногистохимии, световой и электронной микроскопии показано, что в мозге мышей ген Npc1 экспрессируется в клетках глии и астроцитах и его продукт участвует в пресинаптических процессах, происходящих в нервных окончаниях [64]. Причем у трансгенных мышей с инактивированным геном Npc1 именно терминальные области дендритов и аксонов как первичные сайты нейродегенерации предшествуют появлению неврологических и поведенческих аномалий.

Сфингомиелиназная активность у больных, как правило, снижена и составляет в среднем около 38 % нормы. Однако при слиянии культивируемых клеток, полученных от пациентов с болезнью Ниманна – Пика типа С, с клетками пациентов типа A или B происходит восстановление сфингомиелиназной активности, то есть в гетерокарионах происходит комплементация исходных дефектов.

Более чем у 90 % больных, включая все тяжелые случаи, наблюдается очень низкая скорость эстерификации холестерина, вследствие чего неэстерифицированный холестерин в высокой концентрации накапливается в клетках. Полученные результаты были подтверждены в совместных межлабораторных исследованиях, выполненных на 70 пациентах с болезнью Ниманна – Пика типа С [87]. Авторы показали, что в культивируемых фибробластах больных резко понижена эстерификация холестерина при выращивании этих клеток в среде с добавлением чистых липопротеинов низкой плотности (ЛНП) человека. Промежуточная скорость эстерификации наблюдается в культивируемых фибробластах гетерозигот. Клинический фенотип очевидно коррелирует с уровнем биохимического дефекта. Неэстерифицированный холестерин накапливается не только в лизосомах, но на ранней стадии и в аппарате Гольджи [17]. Показано, что сфингомиелиназная недостаточность в фибробластах пациентов может быть скорректирована при удалении из культуральной среды липопротеиновой фракции [81]. Эти данные согласуются с предположением, что первичный дефект при типе С болезни Ниманна – Пика связан с клеточным транспортом и/или процессингом свободного холестерина. Снижение активности сфингомиелиназы происходит вследствие внутриклеточного накопления холестерина, то есть является вторичным признаком болезни. Четкой корреляции между характером нарушений холестеринового гомеостаза и клиническими проявлениями болезни не прослеживается, и у некоторых пациентов наблюдаются лишь небольшие изменения в клеточном транспорте холестерина — так называемый вариантный биохимический фенотип.

Продукт гена NPC2 — консервативный среди млекопитающих секреторный гликопротеин с молекулярной массой 25–27 кД, состоящий из 151 аминокислот, 19 из которых представляют собой сигнальный пептид. При субклеточном фракционировании было показано, что этот гликопротеин оказался лизосомным белком, участвующим в связывании холестерина. Определена кристаллическая структура NPC2-белка и охарактеризованы его лигандные свойства [27]. При кислом и нейтральном pH белок связывает аналог холестерина — дигидроэргостерол. В дальнейшем было показано, что очищенный продукт гена NPC2 — это секреторный растворимый белок, специфично связывающий холестерин [39]. Оба белка — NPC2 и NPC2 — ответственны за выход холестерина из поздних эндосом и лизосом.

Картирование генов NPC1 и NPC2

Картированию гена NPC1 человека способствовала идентификация мутантного гена в генетической линии мышей C57BL/Ks, характеризующейся сниженной активностью сфингомиелиназы и внутриклеточным накоплением избытка сфингомиелина [57]. Предполагалось, что линия C57BL/Ks — это генетическая модель детских форм сфингомиелиноза типов A и B. Оказалось, что это не так. Локус Spm, мутантный в линии C57BL/Ks, был картирован в хромосоме 18 мыши в области, синтенной участкам двух хромосом человека — 5 и 18 [70]. На большой выборке семей был проведен анализ сцепления гена NPC1, ответственного за развитие сфинголипидоза типа С, с микросателлитными маркерами этих двух хромосом человека [21]. Никакого сцепления с маркерами хромосомы 5 не было найдено, тогда как сильное сцепление было обнаружено с маркерами перицентромерного района хромосомы 18. Эти данные были убедительно подтверждены в опытах по восстановлению холестеринового метаболизма в 3T3-мутантной линии клеток, полученной от spm/spm-мышей, при переносе в них фрагментов хромосомы 18 человека [41]. В дальнейших исследованиях было показано, что наиболее вероятная область локализации гена NPC1 — 18q11.2. Методом позиционного клонирования ген NPC1 был идентифицирован в этой цитогенетической области, что позволило изолировать его кДНК и определить ее нуклеотидную последовательность [16, 20]. Ген NPC1 состоит из 25 экзонов, распределенных на площади более чем в 47 кб геномной ДНК [58].

При скрининге эпидидимальной тканеспецифической библиотеки генов человека был идентифицирован неизвестный ранее ген HE1, выделена и проклонирована его кДНК [35]. Ген HE1 экспрессируется во всех исследованных тканях с образованием мРНК размером 0,9 кб [59]. Наивысший уровень экспрессии зарегистрирован в тестис, почках и печени, самый низкий — в легких и мышцах. С использованием метода радиационных гибридов ген HE1 был картирован в области 14q24.3. Учитывая локализацию гена HE1 и функции его продукта как лизосомного белка, участвующего в метаболизме холестерина, было высказано предположение, что мутации в этом гене ответственны за болезнь Ниманна – Пика типа С2 [59]. Оказалось, что продукт гена HE1 отсутствует в культивируемых фибробластах пациентов с типом С2. Более того, экзогенное введение рекомбинантного белка HE1 в фибробласты пациентов с типом С2 приводило к заметному снижению отложений холестерина ЛНП. Таким образом была доказана идентичность генов HE1 и NPC2.

Мутации в генах NPC1 и NPC2

Наиболее частый тип мутаций в гене NPC1 — замены нуклеотидов, сопровождающиеся заменой аминокислот в белке, то есть миссенс-мутации [20, 31, 32]. Так, среди 13 идентифицированных мутаций 8 были миссенс-типа, 3 — небольшими делециями со сдвигом рамки считывания и 2 — сплайсинговыми. При этом 7 из 8 аминокислотных замен были кластерированы в одном трансмембранном домене белка, что указывает на его высокую функциональную значимость.

В другом исследовании из 13 мутаций, идентифицированных у 12 больных, 10 оказались уникальными и находились в компаунд-гетерозиготном состоянии [16]. Были найдены 2 миссенс-мутации в гомозиготном состоянии у 4 неродственных пациентов, имеющих одинаковый гаплотип по внутригенным полиморфным маркерам, что указывает на возможность участия «эффекта основателя» в их распространении.

Проведено сопоставление спектра мутаций в гене NPC1 с уровнем иммунореактивных форм кодируемого этим геном белка в кожных фибробластах 30 неродственных пациентов с типом С1 болезни Ниманна – Пика, 9 из которых имели «вариантный» биохимический фенотип [55, 56]. У 14 больных обнаружены гомозиготные мутации. 32 идентифицированные мутации затрагивали практически все домены белка NPC1, но 11 из них были кластерированы в консервативном цистеин-богатом районе цитоплазматической петли. 3 миссенс-мутации, сопровождающиеся заменой аминокислот в стерол-чувствительном домене белка NPC1, а также мутации с преждевременной терминацией трансляции встречались исключительно у пациентов с ранней неврологической формой заболевания и классическими, то есть тяжелыми нарушениями в клеточном транспорте холестерина. У пациентов со взрослыми неневрологическими формами и/или «вариантным» биохимическим фенотипом были идентифицированы другие миссенс-мутации. Четкой корреляции между генотипом и фенотипом в этом случае не наблюдалось, хотя все 5 миссенс-мутаций, ассоциированных с «вариантным» биохимическим фенотипом, включая рекуррентную мутацию P1007A, приводили к аминокислотным заменам в цитоплазматическом районе белка.

При проведении молекулярно-генетического анализа в выборке из 143 неродственных пациентов с типом С болезни Ниманна – Пика мутантные аллели были идентифицированы в 88 % случаев, из них 114 различных мутаций в гене NPC1 и 7 — в гене NPC2 [62]. Наиболее частой была замена I1061T, которая составила 18 % всех мутантных аллелей гена NPC1. Район между кодонами 1038 и 1253, имеющий 35 % гомологии с соответствующим геном Patched, является «горячей» точкой мутагенеза. «Вариантный» биохимический фенотип часто встречается среди португальских больных [69]. В этой этнической группе у пациентов с тяжелым «классическим» фенотипом были найдены 2 сплайсинговые мутации. Все 3 миссенс-мутации (C177Y, R978C и P1007A), которые в различных комбинациях встречались у пациентов с «вариантным» биохимическим фенотипом, сопровождались аминокислотными заменами в цитоплазматических районах белка NPC1. В Испании при формах болезни с ранней неврологической симптоматикой часто встречается миссенс-мутация Q775P, а при детской форме с поздним началом преобладающая миссенс-мутация C177Y [25]. В Японии мажорной является сплайсинговая мутация 1553G-A [92].

Обнаружение у одного из больных нонсенс-мутации E20X в гене NPC2, которая нарушала связывание холестерина и поддержание его нормального внутриклеточного содержания, рассматривали как окончательное доказательство причастности этого гена к развитию болезни Ниманна – Пика типа С2 [38]. Эта мажорная мутация составляет по разным данным от 34 до 56 % всех мутантных аллелей в гене NPC2 [55, 56, 88]. Идентификация этой и других мутаций в гене NPC2 позволила определить функционально значимые районы белка [62]. Из 16 идентифицированных мутантных аллелей было только 5 разных мутаций — 2 нонсенс-типа (E20X и E118X) и по одной — делеция 1 нуклеотида (27delG), сплайсинговая мутация (IVS2+5G-A) и миссенс-мутация (S67P). В 7 исследованных семьях гомозиготы по мутациям E20X, E118X и S67P, а также компаунд-гетерозиготы по E20X и 27delG имели тяжелое течение заболевания, которое закончилось летальным исходом чаще всего от дыхательной недостаточности в возрасте от 6 мес. до 4 лет.

Экспериментальные модели

Описаны спонтанные генетические линии мышей с фенотипическими аномалиями, сходными с теми, которые наблюдаются при болезни Ниманна – Пика [49]. Показано, что в одной из этих линий (BALB/c) произошла инактивация гена Npc1 за счет инсерции ретропозона Npc1(–/–). У гомозиготных мутантов этой линии рано развивается неврологическая симптоматика, наблюдается заметная потеря веса, стерильность и ранняя гибель животных. Трансгенное введение мышам этой линии нормального гена NPC1 человека с обеспечением его избирательной экспрессии в ЦНС предотвращает процесс нейродегенерации [48]. У трансгенных мышей восстанавливается плодовитость и значительно увеличивается продолжительность жизни. Однако полной коррекции неврологического фенотипа не наблюдается, так как в некоторых нейронах и клетках глии сохраняется избыточное накопление GM2- и GM3-ганглиозидов. У трансгенных животных наблюдается также коррекция висцеральных нарушений в печени и селезенке. Авторы делают вывод, что неврологические аномалии при болезни Ниманна – Пика первично обусловлены недостаточностью белка NPC1 в ЦНС, а не являются вторичным эффектом висцеральных нарушений.

В ряде работ показано, что нарушение внутриклеточного транспорта ЛНП-холестерина приводит к снижению синтеза оксистерола и стероидов. В связи с этим на мышиной Npc1(–/–)-модели были проведены испытания возможности использования нейростероида аллопрегнанолона (allopregnanolone) и синтетического лиганда оксистерола для лечения болезни Ниманна – Пика [42]. Назначение этих препаратов мутантным животным увеличивает продолжительность их жизни и заметно отодвигает появление неврологической симптоматики.

Путем направленного трансгеноза сконструирована условно нулевая модельная линия мышей, у которых ген Npc1 инактивирован только в зрелых клетках Пуркинье мозжечка [25]. У таких животных наблюдается возрастзависимое ухудшение двигательных функций, включая атаксию, нарушение равновесия, появление круговых движений. Однако вес и продолжительность жизни условных мутантов сохраняются в пределах нормы. При гистологическом исследовании выявляется прогрессирующая потеря клеток Пуркинье в определенной области мозжечка, причем пространственно-временные характеристики этой селективной нейродегенерации сходны с теми, которые наблюдаются у полных нулевых мутантов. Субпопуляция клеток Пуркинье, расположенных в заднем отделе мозжечка, устойчива к клеточной гибели, несмотря на отсутствие продукта гена Npc1. Таким образом, атаксический фенотип нулевых мутантов по гену Npc1 определяется селективной гибелью клеток Пуркинье, а не их дисфункцией.

Некоторые синтетические препараты (U18666A) способны индуцировать изменения внутриклеточного метаболизма, сходные с теми, которые наблюдаются при болезни Ниманна – Пика [47]. Эти изменения сопровождаются лизосомными накоплениями сфингозина и уменьшением уровня лизосомного кальция. Сфингозин сам по себе способен индуцировать нарушения внутриклеточного гомеостаза кальция концентрационно-зависимым образом. При этом накопление холестерина, сфингомиелина и глицеросфинголипида вторично. Введение Npc1(–/–)-мышам препарата циркумина, способного повышать содержание кальция в цитоплазме, на 35 % увеличивает продолжительность жизни мутантных животных и на три недели замедляет развитие болезни. Авторы предполагают, что продукт гена NPC1 участвует в высвобождении сфингозина из лизосом. Накопление сфингозина в лизосомах при болезни Ниманна – Пика изменяет внутриклеточную концентрацию кальция, что, в свою очередь, приводит к нарушению эндоцитозного транспорта.

Для исследования функций белка NPC2 и его возможных взаимодействий с белком NPC1 созданы мышиные гипоморфные модели, в которых уровень экспрессии гена NPC2 в различных тканях составлял от 0 до 4 % [77]. Фенотипы нулевых мутантов по одному из генов NPC1 или NPC2, так же как двойных мутантов, были сходны по началу болезни, ее развитию, вовлечению нервной системы и характеру липидных накоплений. Это доказывает, что функции обоих белков связаны с транспортом липидов от лизосом к другим внутриклеточным сайтам.

Лабораторная диагностика и лечение

Клиническая и биохимическая диагностика болезни Ниманна – Пика II такая же, как и при форме I. Лучшие диагностические тесты, наряду с регистрацией характерных неврологических расстройств, — дефектная индукция эстерификации холестерина и накопление холестерина в везикулах, регистрируемое цитохимически после окрашивания клеток филипином [86]. Дифференциальная диагностика болезни Ниманна – Пика типов С1 и C2 возможна только при идентификации мутаций в соответствующих генах NPC1 или NPC2.

Первый препарат, который был предложен для лечения болезни Ниманна – Пика типа С — это миглустат (Zavesca, Brazaves) — небольшой иминосахар, участвующий в обратном регулировании синтеза глюкоцерамида, который катализирует первый шаг в синтезе гликосфинголипидов. Миглустат способен проникать через гематоэнцефалический барьер и потенциально может использоваться для лечения неврологических нарушений [50, 66]. Миглустат может также опосредованно участвовать в регуляции внутриклеточного гомеостаза кальция путем влияния на концентрацию глюкозилцерамида и накопление сфингозина — предполагаемого пускового фактора в патогенезе заболевания [9]. Безопасность и эффективность миглустата была показана на экспериментальных моделях болезни Ниманна – Пика типа С, что позволило перейти к клиническим испытаниям. В различных независимых исследованиях показано, что при ежедневном приеме препарата происходит стабилизация или улучшение многих неврологических проявлений заболевания, прежде всего исчезает вертикальный парез взора, который служит одним из маркеров прогрессирования заболевания. Наиболее часто при приеме препарата отмечаются нежелательные явления: умеренная диарея, метеоризм, потеря веса и тремор. Все эти проявления имеют тенденцию к снижению со временем и успешно контролируются.

В последние годы во всем мире интенсивно развивается трансляционная медицина, направленная на внедрение современных научных достижений в практику здравоохранения. Так, в Национальном Институте Здоровья (NIH) США создана программа лечения редких и запущенных болезней (Therapeutics for Rare and Neglected Diseases — TRND), цель которой состоит в объединении усилий академической науки, непрофильных организаций, фармацевтических и биотехнологических компаний для разработки новых терапевтических подходов и лечения тяжелых наследственных заболеваний. Одной из первых задач этой программы был поиск и испытание препаратов для лечения пациентов с болезнью Ниманна – Пика типа С [61]. Основанием для исследования служили результаты успешного применения нейростероида аллопрегнанолона и его синтетического лиганда оксистерола для коррекции свойственных мышам трансгенной линии Npc1(–/–) неврологических нарушений, сходных с клиническими проявлениями типа С1 болезни Ниманна – Пика [42]. Оказалось, что при использовании только одного лиганда — 2-гидроксипропил-бета-циклодекстрина (HPβCD) — лечение происходит более эффективно по сравнению с комбинированной терапией [22]. При систематическом введении HPβCD мышам, моделирующим типы С1 и С2 болезни Ниманна – Пика, наблюдается значительное снижение во многих органах мутантных животных лизосомного накопления холестерина, замедление процесса нейродегенерации и значительное увеличение продолжительности жизни. При введении препарата непосредственно в ЦНС Npc(1–/–)-мышей процесс нейродегенерации полностью прекращается [46].

Описан новый биомаркер — N-пальмитоил-О-фосфохолинэзерин (PPCS) — для диагностики болезни Ниманна – Пика типа С и оценки эффективности лечения этого заболевания с использованием препарата 2-гидроксипропил-бета-циклодекстрина (HPβCD) [75]. Для определения содержания HPβCD в плазме и спиномозговой жидкости разработан высокочувствительный метод жидкостной хроматографии — тандемной масс-спектрометрии. При содержании PPCS в плазме выше 248 нг/мл чувствительность диагностики составляет 100 % и специфичность — 96,6 %. При болезни Ниманна – Пика типа С1 содержание PPCS в спиномозговой жидкости достоверно повышено и это повышение коррелирует с тяжестью неврологических проявлений заболевания. При лечении путем интратекального введения HPβCD содержание PPCS не меняется, в то время как при внутривенном введении (IV клинические испытания) у всех больных плазменные уровни PPCS достоверно снижаются.

Клинические примеры болезни Ниманна – Пика типа С

В настоящий момент в медико-генетическом центре Санкт-Петербурга наблюдаются 4 пациента с болезнью Ниманна – Пика типа С в возрасте от 13 до 24 лет (см. таблицу).

 

Таблица / Table Характеристика пациентов с болезнью Ниманна – Пика типа С Characteristics of patients with Niemann–Pick type C disease
Пациент, возраст / Patient, years	Первые симптомы заболевания, возраст / Time of first symptoms, years old	Возраст диагностики, лет / Time of diagnosing, years old	Особенности клинических проявлений на момент установления диагноза / Symptoms at the time of diagnosing	Молекулярно-генетическое исследование / Genetic base	Дифференциальный диагноз / Differential diagnosis
Пациент № 1, 13 лет / Patient 1, 13 YO	2 года / 2 YO	8,5	Атаксия, дизартрия, вертикальный парез взора / Ataxia, dysarthria, vertical gase paresis	20/22 экзоны гена NPC1 (c.3019C>G/c.3325delA) / 20/22 exons NPC1 gene (c.3019C>G/c.3325delA)	–/NA
Пациент № 2, 24 года / Patient 2, 24 YO	2 года / 2 YO	20	Дизартрия, скандированная речь, дизграфия, снижение памяти и внимания, атаксия, мышечная гипотония, интенционный тремор, брадикинезия, вертикальный парез взора, психозы, нарушение походки / Dysarthria, scanned speech, dysgraphia, decreased memory and attention, ataxia, muscle hypotonia, intentional tremor, bradykinesia, vertical gase paresis, psychosis, gait disturbance	Экзоны 19/12 гена NPC1 с.2861С>T (p.Ser954Leu)/с.1883А>G (p.Tyr628Cys) / 19/12 exons NPC1 gene с.2861С>T (p.Ser954Leu)/с.1883А>G (p.Tyr628Cys)	Атаксия Фридрейха. Резидуально-органическое поражение центральной нервной системы: атрофические изменения головного мозга, гипоплазия червя мозжечка / Ataxia Friedreich. Residual organic lesion of the central nervous system: atrophic changes in the brain, hypoplasia of the cerebellar vermis
Пациент № 3, 23 года / Patient 3, 23 YO	5–6 лет / 5–6 YO	20	Атаксия, периодические падения, неразборчивая смазанная речь, дисфагия. Мышечная слабость. Вертикальный парез взора. Оживление сухожильных рефлексов, патологические стопные знаки, деформация стоп, нарушение походки / Ataxia, intermittent falls, slurred speech, dysgraphia, muscle hypotonia, vertical gase paresis, increased tendom reflexes, pathological foot reflexes, foot deformity, gait disturbance	Ген NPC1 p.Gly992Arg/p.Arg1059Term / NPC1 gene p.Gly992Arg/ p.Arg1059Term	Наследственная моторно-сенсорная нейропатия (болезнь Шарко – Мари). Спастическая параплегия Штрюмпеля / Hereditary motor-sensory neuropathy (Charcot–Marie’s disease). Strumpel’s spastic paraplgia
Пациент № 4, 26 лет / Patient 4, 26 YO	15 лет / 15 YO	24	Дисфагия, дисфония, дизартрия. Атаксия. Вертикальный парез взора. Повышение сухожильных рефлексов. Нарушение походки / Dysphagia, dysphonia, dysarthria, ataxia, vertical gase paresis, increased tendom reflexes, gait disturbance	Ген NPC1, экзон 0 с.3019С>G (p.Pro1007Ala) в гомозиготном состоянии / NPC1 gene, exon 0 с.3019С>G (p.Pro1007Ala) in the homozygous state	Атаксия неясного генеза, спиноцеребеллярная атаксия? При магнитно-резонансной томографии картина церебеллярной атрофии / Ataxia of unknown origin, spinocerebellar ataxia? MRI picture of cerebellar atrophy

 

Подробно мы остановимся на описании пациента № 2. Это молодой мужчина 24 лет. Первые симптомы заболевания отмечались с возраста 2 лет. Мальчика беспокоили боли в мышцах. В связи с неспецифичностью жалоб подробного исследования предпринято не было. В младшем школьном возрасте возникли трудности в обучении (со 2-го класса). В 13–14 лет обращали на себя внимание «растянутая речь», неловкость движений, спленомегалия (по данным ультразвукового исследования). С 16 лет начали беспокоить: головокружения, запрокидывание головы, неловкость движений. В связи с данными жалобами инициировано неврологическое обследование, выполнена магнитно-резонансная томография головного мозга, на которой выявили умеренные атрофические изменения вещества головного мозга, признаки гипоплазии червя мозжечка. Мальчик был консультирован в Медико-генетическом центре, первоначально была заподозрена атаксия Фридрейха. В 20 лет клиническая картина состояла в следующем: дизартрия, скандированная речь, дизграфия, снижение памяти и внимания, шаткость походки, интенционный тремор, «полые стопы», у молодого человека появились психозы (периодически стал «забывать, как жевать пищу», появилась дисфагия при попытке проглотить плохо пережеванную пищу, замкнутость, страхи, расширение зрачков). При осмотре отмечались: вертикальный парез взора, редкие мигания, диффузная мышечная гипотония, глубокие сухожильные рефлексы были оживлены, с расширенными зонами. Брадикинезия, движения размашистые. Походка атактическая. Координационные пробы — грубые интенционные движения. Для исключения болезни Ниманна – Пика типа С проведено исследование: биохимическая диагностика лизосфингомиелин-509 6,23 МоМ (норма 0,15–3,7 МоМ), 7-кетохолестерин 181 нг/мл (норма 10–75 нг/мл), триол 76,6 нг/мл (норма 2–50 нг/мл). В связи с положительной биохимической диагностикой проведена молекулярно-генетическая диагностика. Выявлены 2 патогенных варианта в гене NPC1 в компаунд-гетерозиготном состоянии: в экзоне 19 с.2861С>T (p.Ser954Leu) и экзоне 12 с.1883А>G (p.Tyr628Cys). С возраста 20 лет молодой человек начал получать субстрат-редуцирующую терапию препаратом миглустат. Основным побочным эффектом терапии является периодическая тромбоцитопения с быстрым восстановлением при пропуске нескольких приемов препарата. К возрасту 24 лет (4 года субстратредуцирующей терапии) в клинической картине сохраняются: дизартрия, скандированная речь, дизграфия, дизлексия, шаткость походки, тремор. Психозы на фоне терапии стали реже, возникают только в весенний и осенний периоды, не требуют специальной медикаментозной коррекции. Снизился уровень тревожности, пациент может оставаться дома один. При объективном осмотре не отмечается гепатоспленомегалия, сохраняется вертикальный парез взора, атаксия, шаткость походки, неточность при выполнении координационных проб. У молодого человека оформлена 2-я группа инвалидности, но остаются проблемы с трудоустройством в связи с невозможностью самостоятельного передвижения по городу, речевыми проблемами, нарушениями мелкой моторики (письмо, точность движений). Сохраняется атаксия, повышена травматизация в быту. В настоящий момент получает лечение гипсовой лонгетой из-за падения дома и получения травмы связок голеностопного сустава. Таким образом, можно отметить проблемы ранней диагностики болезни Ниманна – Пика типа С в клинической практике. Только у одного пациента диагноз был установлен в детском возрасте. Кроме того, клинически мы не видим значимого эффекта субстрат-редуцирующей терапии. Состояние пациентов в целом стабилизировалось, но недостаточно для осуществления социальной интеграции в общество и возможности полной независимости от ухаживающих родственников.

БОЛЕЗНЬ ВОЛЬМАНА, БОЛЕЗНЬ НАКОПЛЕНИЯ ЭФИРОВ ХОЛЕСТЕРИНА

Клиника и эпидемиология

Болезнь Вольмана — это редкое аутосомно-рецессивное заболевание, обусловленное наследственной недостаточностью лизосомной кислой липазы А. Основной патогенетический механизм связан с нарушением гомеостаза липидов и отложением большого количества нерастворимых эфиров холестерина и триглицеридов в лизосомах клеток большинства тканей. При этом размеры и количество лизосом резко возрастают, что приводит к гибели клеток и нарушению функций соответствующих тканей. При гистологическом анализе в большинстве тканей наблюдается вакуолизация клеток, появление «пенистых» клеток. Дополнительно развивается кальцификация надпочечников. Основные клинические проявления заболевания выражаются в дисфункции печени и дислипидемии вследствие накопления эфиров холестерина и триглицеридов преимущественно в печени, сосудах и ретикулоэндотелиальной системе. Особенно чувствительны к накоплению липидов печень, почки, селезенка, надпочечники, лимфоидная ткань, стенки тонкого кишечника и сосудов, а в нервной системе — области активной миелинизации. Наблюдается массивная инфильтрация этих органов макрофагами, нагруженными эфирами холестерина и триглицеридами. В зависимости от начала заболевания выделяют две клинические формы — неонатальную и более позднюю, которую называют болезнью накопления эфиров холестерина.

При классической неонатальной форме болезнь развивается вскоре после рождения или в течение первого полугодия жизни и проявляется в виде гепатоспленомегалии, персистирующей рвоты, диареи, стеатореи, прогрессирующей анемии. Возможны приступы субфебрильной лихорадки. Наблюдается выраженная задержка физического и психомоторного развития. Рентгенологически выявляется кальцификация и увеличение надпочечников. Больные чаще всего погибают в первом полугодии жизни, иногда в начале второго года от кахексии, рекуррентных инфекций, прогрессирующих неврологических расстройств.

Болезнь накопления эфиров холестерина характеризуется поздним началом, варьирующим в диапазоне от 2 до 10 лет, а иногда до более чем 20 лет. Течение заболевания прогредиентное, медленно прогрессирующее. Неврологическая симптоматика, как правило, отсутствует. Основное, а иногда единственное проявление заболевания — гепатомегалия, обусловленная инфильтрацией печени макрофагами, нагруженными эфирами холестерина. Следствием гепатомегалии может быть фиброз и цирроз печени. Пациенты могут предъявлять жалобы на рецидивирующие боли в животе. Гиперхолестеринемия наблюдается практически у всех больных. У части больных развиваются спленомегалия, варикозное расширение вен пищевода, носовые или кишечные кровотечения, почечная недостаточность. Накопление нейтральных жиров и эфиров холестерина в артериях предрасполагает к развитию атеросклероза. Хотя общий витальный прогноз благоприятный, некоторые пациенты могут погибать во второй или третьей декаде жизни от острой почечной недостаточности.

Суммарная частота болезни Вольмана не превышает 1 : 350 00 новорожденных.

Биохимические основы патогенеза

Кислая липаза А — одна из лизосомных гидролаз. Ее основная функция состоит в гидролизе в лизосомах эфиров холестерина, связанных с ЛНП. Высвобождение холестерина супрессирует его дальнейший синтез и стимулирует эстерификацию.

Активность кислой липазы А полностью отсутствует или снижена более чем в 200 раз у пациентов с неонатальной формой болезни Вольмана и от 50 до 100 раз при болезни накопления эфиров холестерина [18]. Таким образом, различия в характере течения этих двух аллельных заболеваний определяются остаточной активностью фермента.

Картирование гена LIPA

Методом соматической гибридизации ген лизосомной кислой липазы А человека — LIPA — был картирован в длинном плече хромосомы 10 [39]. В дальнейшем с использованием метода флуоресцентной гибридизации in situ было показано, что ген LIPA расположен в области 10q23.31 [13]. Он состоит из 10 экзонов, распределенных на площади в 36 кб геномной ДНК [14]. Изоляция и секвенирование кДНК гена LIPA позволили определить аминокислотную последовательность кислой липазы А [12].

Мутации в гене LIPA

Окончательным доказательством аллельной природы неонатальной болезни Вольмана и болезни накопления эфиров холестерина стало обнаружение мутаций в гене LIPA у пациентов с каждым из этих двух заболеваний. Из 6 идентифицированных в гене LIPA мутаций 3 приводят к преждевременному прекращению синтеза белка, 2 нарушают процесс сплайсинга и 1 сопровождается заменой аминокислоты, разрушающей структуру альфа-спирали белка [1, 12, 15, 28, 37, 53]. Причем последняя мутация Leu179Pro, так же как инсерция одного нуклеотида 1-BP INS, 634T, в компаунде с другими мутациями была найдена как при неонатальной болезни Вольмана, так и при болезни накопления эфиров холестерина. Одна из сплайсинговых мутаций, сопровождающаяся в 97 % случаев ошибочным вырезанием экзона 8, по-видимому, является мажорной, так как часто обнаруживается у неродственных пациентов с болезнью накопления эфиров холестерина [15]. В 3 % случаев сплайсинг оказывается не нарушенным, и синтезируется нормальный фермент. Остаточная активность кислой липазы А у больных, несущих эту мутацию, может достигать 9 %, что и объясняет мягкое течение заболевания.

Экспериментальные модели

Путем направленного разрушения гена Lip1 создана трансгенная «нокаут»-линия мышей с нулевой активностью лизосомной кислой липазы А — Lal(–/–) [23]. У гетерозиготных животных активность кислой липазы составляла около 50 % и не наблюдалось накопления липидов. Гомозиготные мутанты развивались нормально, несмотря на массивные, в 30 раз превосходящие норму накопления эфиров холестерина и триглицеридов во многих органах. В возрасте 21 дня печень животных была вдвое больше нормы и имела желто-оранжевую окраску. При этом мутантные самцы и самки сохраняли плодовитость. Эта линия мышей Lal(–/–) фенотипически моделирует болезнь накопления эфиров холестерина человека, хотя биохимически и гистопатологически она в большей степени похожа на болезнь Вольмана.

На этой модели показана возможность генной коррекции основных клинических проявлений болезни накопления эфиров холестерина. Введение 2-месячным мутантным Lal(–/–) мышам путем инъекции в хвостовую вену нормального гена LIPA человека в составе экспрессирующего вектора (phLAL) и обеспечение его доставки в лизосомы с помощью рецептора М6 приводило после 30 дней лечения к исчезновению желто-оранжевой окраски печени и снижению ее веса на 36 % [24]. При этом содержание эфиров холестерина и триглициридов в печени уменьшилось на 50 %, в селезенке — на 69 % и в тонком кишечнике — на 50 %.

Лабораторная диагностика и лечение

Диагностика заболевания основана на определении активности кислой лизосомной липазы в сочетании с клиническими проявлениями заболевания и биохимическими показателями накопления эфиров холестерина и триглицеридов. С привлечением специалистов различных медицинских профилей — клинических генетиков, гепатологов, гастроэнтерологов, кардиологов и гастроэнтерологов — разработана международная программа для раннего выявления больных с недостаточностью кислой лизосомной липазы, их мониторинга и определения клинических критериев прогноза заболевания [40]. Цель этой программы — развитие междисциплинарного подхода для оказания интегрированной медицинской помощи взрослым пациентам с накоплением эфиров холестерина.

Предложена и прошла 3-ю фазу клинических испытаний ФЗТ для детей и взрослых с недостаточностью кислой лизосомной липазы [19]. Она основана на использовании рекомбинантного фермента — себелипазы альфа. Испытание продолжалось 20 нед., в нем приняли участие 66 пациентов. Наблюдали достоверное улучшение состояние печени, оцениваемое по содержанию уровня аланинаминотрансферазы и некоторых других патологических проявлений дислипидемии. Таким образом, себелипаза альфа рассматривается как перспективный препарат для лечения болезни накопления эфиров холестерина [63].

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Информированное согласие на публикацию. Авторы получили письменное согласие пациентов и их представителей на публикацию медицинских данных.

ADDITIONAL INFORMATION

Author contribution. Thereby, all authors made a substantial contribution to the conception of the study, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the article, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the study.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Consent for publication. Written consent was obtained from the patients for publication of relevant medical information.

About the authors

Victoria N. Gorbunova

St. Petersburg State Pediatric Medical University

Email: vngor@mail.ru

Dr. Sci. (Biol.), Professor, Department of Medical Genetics

Russian Federation, Saint Petersburg

Natalia V. Buchinskaia

St. Petersburg State Medical Diagnostic Center (Genetic medical center)

Author for correspondence.
Email: nbuchinskaia@gmail.com

MD, PhD, Pediatrician, Geneticist

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files