Biodistribution and kinetic characters of radiopharmaceutical medication based on biospecific antibodies to tumor-associated stroma elements and 177lutcium

Full Text

АКТУАЛЬНОСТЬ

Несмотря на значительные усилия в области организации оказания медицинской помощи пациентам, широкое внедрение диспансеризации, разработку новых, информативных методов и комбинированных подходов к диагностике опухолевого процесса, внедрение высокотехнологичных методов в онкохирургии и лучевой терапии злокачественных новообразований, а также создание инновационных противоопухолевых препаратов, в том числе высокоселективно воздействующих на специфические мишени опухолевых клеток, значительного качественного прорыва в лечении онкологических заболеваний по большинству направлений не произошло, и удельный вес онкологической патологии в общей структуре заболеваемости, смертности и инвалидизации населения остается стабильно высоким [5].

Одним из главных факторов, определяющих наблюдаемую диспропорцию между предпринимаемыми усилиями и результатами терапии злокачественных новообразований, является недостаточное понимание патогенеза заболевания и, в частности, роли микроокружения в развитии опухолей, изменений их инвазивного и метастатического потенциалов, уклонения от действия элиминирующих факторов защитных систем организма [2, 3, 14] или быструю и качественную репарацию нанесенных повреждений и формирование феномена множественной лекарственной устойчивости [1]. Основу микроокружения опухоли, так называемой опухоль-ассоциированной стромы, составляют различные типы клеточных популяций соединительной ткани, кровеносные сосуды и клетки иммунной системы, «рекрутированные» опухолевыми клетками за счет изменения цитокиновой регуляции, прежде всего макрофаги и другие клетки иммунной системы [9, 15]. Работа этих клеток создает необходимые условия для оптимальной метаболической, инвазивной и пролиферативной активности опухолевых клеток. При этом ассоциированные с опухолью клетки полностью или частично не способны выполнять свои основные физиологические функции и имеют отличный от неассоциированных с опухолевым процессом групп клеток качественный и количественный набор продуцируемых соединений и иной уровень экспрессии рецепторов на своей поверхности [10, 12–14].

Подобные фенотипические особенности элементов опухоль-ассоциированной стромы делают их перспективной целью для разработки таргетных соединений различного типа, в том числе радиофармацевтических лекарственных препаратов (РФЛП) для направленного радиационного воздействия на микроокружение новообразования с целью ингибирования работы всей системы жизнеобеспечения опухоли, а также прямого поражения трансформированных клеток. Это направление радиофармакологии относительно молодое с высокими перспективами дальнейшего развития, особенно при терапии опухолей, обладающих множественной лекарственной устойчивостью к традиционным способам лечения.

Наше исследование посвящено ключевому разделу фармацевтической разработки противоопухолевого РФЛП, селективно связывающегося одновременно с двумя консервативными мишенями микроокружения опухоли, — экспериментальной оценке распределения препарата в организме животного и его кинетических особенностей (накопление в нецелевых органах, пути выведения из организма и динамика выведения).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования — радиофармацевтический лекарственный препарат на основе радионуклида ¹⁷⁷Lu и биспецифических антител к мембранному гликопротеину 4, ассоциированному с цитотоксическими Т-лимфоцитами (cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4; CTLA4) и мембранному протеину, рецептору группы фактора некроза опухоли [glucocorticoid Induced Tumor Necrosis Factor Receptor (GITR или TNFRSF18)] — ¹⁷⁷Lu-DOTA-anti-CTLA4-GITR. Состав РФЛП приведен в табл. 1.

 

Таблица 1. Состав активных и вспомогательных компонентов радиофармацевтического лекарственного препарата ¹⁷⁷Lu-DOTA-anti-CTLA4-GITR (на мл)

Table 1. Composition of active and accessory components in radiopharmacalogical medication ¹⁷⁷Lu-DOTA-anti-CTLA4-GITR (per ml)

Показатель / Parameter	Состав / Composition
Активные компоненты / Active components	177Lu — не менее 1,5 МБк; таргетный носитель — антитело — 0,1 мг / 177Lu — at least 1.5 МBq; target carrier — antibody — 0,1 mg
Вспомогательные компоненты / Accessory components	Натрия хлорид — 9 мг / Sodium Chloride — 9 mg Гентизинат натрия — 5 мг / Sodium Hensionate — 5 mg Вода для инъекций до 1 мл / Water for injections up to 1 ml

 

В качестве вещества-растворителя использовали 0,9 % раствор натрия хлорида (ООО «Гематек», Россия). Серия: 21250421.

Исследование проводили на 30 самцах лабораторных мышей линии BALB/c, полученных из специализированного питомника Института цитологии и генетики Сибирского отделения РАН. Подопытные животные находились на карантине в течение 14 сут с целью исключения из эксперимента животных с соматической и/или инфекционной патологией. На всем протяжении исследования ежедневно производился осмотр животных с оценкой их состояния: поведение, аппетит, масса тела, состояние шерсти, активность.

Содержание мышей соответствовало общепринятым правилам обращения с лабораторными животными в ходе научных экспериментов [4]. Ограничения в питании и питьевом режиме не вводились. Выведение животных из эксперимента осуществлялось путем введения высоких доз наркоза (Золетил, инъекционно). Все планируемые процедуры и манипуляции с использованием животных были предварительно согласованы с Комиссией по биоэтике НИЦ «Курчатовский институт» — ПИЯФ, и было получено положительное заключение (№ 04/1-КПБ-21 от 16 апреля 2021 г.).

Для моделирования злокачественного заболевания использовали клон экспериментальной аденокарциномы толстой кишки мышей (CT26 EGFR) из коллекции опухолевого материала НИЦ «Курчатовский институт» — ПИЯФ. Используемая модель опухолевого процесса является эквивалентной онкологическому заболеванию человека — колоректальному раку — и характеризуется высокой вероятностью успешной трансплантации, удовлетворительными темпами роста первичного опухолевого узла и умеренной активацией иммунной системы организма животного. Опухоль успешно используется в экспериментах по изучению механизмов канцерогенеза и доклиническому исследованию эффективности и безопасности противоопухолевых и антиметастатических лекарственных препаратов различных фармакологических групп [6–8, 11, 16, 17].

Опухолевые клетки CT26 EGFR вводили подопытным животным при помощи шприца в объеме 10⁶ кл./мышь, субкутанно в подкожную клетчатку в области перехода правого бока на нижнюю конечность. В основную серию эксперимента были взяты образцы опухолевой ткани от мышей-доноров со второго пассажа, после верификации гистологического типа опухоли. Для этого при помощи иммуногистохимического обследования с применением коммерческих наборов антител было оценено наличие в опухолевой ткани специфических антигенов-мишеней для действия исследуемых радиофармацевтических препаратов. В тканях используемой модели опухолевого процесса был верифицирован удовлетворительный уровень экспрессии целевых антигенов.

С учетом цели исследования была сформирована только одна экспериментальная группа животных, у которых воспроизводили опухолевый процесс и изучали характер и динамику распределения тестируемого препарата в различных органах и тканях. В ходе предварительных исследований оценивали гистологический тип и особенности роста экспериментального новообразования с использованием 10 мышей по следующим показателям:

• длительность латентного периода развития трансплантированной опухоли (сутки до появления первичного опухолевого узла; пальпаторно);
• динамика роста опухолевого узла (мм³);
• средняя продолжительность жизни (сутки).

Тестируемый препарат разводили до нужного объема 0,9 % раствором натрия хлорида (доза, введенная животным, составляла 0,5 МБк/мышь) и вводили мышам в хвостовую вену. Этот путь как планируемый способ применения препарата в клинической практике позволяет получить объективные данные о его распределении в организме.

Оценку биораспределения и кинетических характеристик ¹⁷⁷Lu-DOTA-anti-CTLA4-GITR производили общепринятым способом прямой радиометрии с использованием жидкостного сцинтилляционного радиометра TRI-CARB5110 TR. Анализ производился путем прямого определения содержания и относительного сравнения распределения радиофармацевтического лекарственного препарата в различных органах животных.

Изучалось распределение тестируемого препарата в следующих органах и тканях: кровь, сердце, легкие с трахеей, тимус, печень, поджелудочная железа, селезенка, мочевой пузырь, почки, надпочечники, предстательная железа, головной мозг, глаза, семенники, язык, пищевод, желудок, тонкая кишка, толстая кишка, костный мозг, первичный опухолевый узел и фрагмент хвоста с местом введения (±5 мм от места инъекции).

Оценка производилась в четырех контрольных точках исследования — через 4–24 и 48–120 ч после введения РФЛП. С учетом пилотного характера эксперимента и данных о периоде полураспада радионуклида в препарате, при изучении его биораспределения и кинетических характеристик оценивались данные, полученные от 5 особей мышей в каждой контрольной точке.

Биологический материал для анализа забирали в контрольных точках исследования в условиях общего наркоза (инъекционный золетиловый наркоз, внутримышечно) при полной аутопсии животного. Отбору органов и тканей животного предшествовало взятие крови, которое производилось в объеме 0,8–0,9 мл в одноразовые шприцевые системы с антикоагулянтом (ЭДТА) мануальным методом путем пункции камер сердца животного, без предварительного ограничения доступа животных к корму и воде. После окончания процедуры взятия крови животное подвергалось эвтаназии путем получения дополнительной дозы наркоза; факт гибели животного дополнительно подтверждался разрушением структур центральной нервной системы. Органы и ткани были взвешены, размещены в стерильных пробирках и подвергнуты радиологическому анализу.

Математический анализ полученных результатов производился при помощи пакета программ SPSS Statistics. Данные приведены в виде медианы (Me), квартилей [Q₁; Q_3] и 95 % доверительного интервала. Проверку характера распределения данных проводили по критерию Колмогорова – Смирнова. Сравнение средних данных независимых выборок производилось при помощи U-критерия Манна – Уитни, так как распределение вариант в выборочных совокупностях было отличным от нормального. Взаимосвязь оцениваемых показателей анализировали при помощи двустороннего критерия корреляции Пирсона (r). Достоверным уровнем отличий считали вероятность не менее 95 % (р < 0,05), что является стандартом в медико-биологических исследованиях.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Субкутанная трансплантация злокачественных клеток CT26 EGFR мышам линии BALB/c приводила к развитию новообразования у всех лабораторных животных. Опухоль характеризовалась относительно стабильным латентным периодом удовлетворительной продолжительности (медиана составляла 19 [16; 21] сут), предшествующим моменту обнаружения первичного пальпируемого опухолевого узла (~2–3 мм³), что позволяло оценить все показатели опухолевого процесса в динамике. Общая средняя продолжительность жизни подопытных животных при этом находилась в прямой зависимости от предыдущего показателя интенсивности развития новообразования (r = 0,989; p = 0,001) и составляла в среднем 28 [24; 29] сут.

Первичный опухолевый узел CT26 EGFR развивался без особенностей (табл. 2); прогрессивное развитие опухоли приводило к быстрому ухудшению состояния животных и их гибели. У некоторых особей объем опухолевого узла в области трансплантации достигал значительных размеров, вызывал сильный и быстро нарастающий отек тканей конечности животных, что отрицательно сказывалось на качестве жизни. Случаев самоизлечения отмечено не было.

 

Таблица 2. Динамика роста опухолевого узла у мышей линии BALB/c с трансплантированной аденокарциномой толстой кишки мышей линии BALB/c CT26 EGFR, Me [Q₁; Q₃]

Table 2. Tumor node growth dynamics in BALB/c CT26 EGFR mice with transplanted colonic tumor, Me [Q₁; Q₃]

Период наблюдений, сут / Period of the studies (days)	Объем первичного опухолевого узла, мм3 / Primary tumor volume, mm3
20	12 [7–15]
22	24 [12–45]
24	108 [96–144]
26	216 [180–324]
28	765 [594–936]

 

При аутопсии подопытных мышей метастазирование CT26 EGFR было выявлено только у одной особи (mtc в паховые лимфоузлы). Это свидетельствует либо о низкой метастатической активности используемого в рамках исследования клона опухолевых клеток, либо о высокой напряженности к нему противоопухолевого иммунитета мышей. Полученные результаты указывают на существенное отличие СТ 26 EGFR от классического клона СТ 26, характеризующегося высокой метастатической активностью и по лимфогенному, и по гематогенному путям [7]. Именно этот факт делает применяемую модель опухолевого процесса наиболее релевантной задачам исследования, так как в случае массивного метастазирования оценить нецелевой, системный характер распределения таргетного РФЛП в организме животного было бы невозможно.

Сравнительные результаты прямой радиометрии, указывающей на кинетические характеристики и распределение исследуемого радиофармацевтического препарата ^1–8Lu-GITR/CTLA-4 в организме животного с трансплантированной опухолью, приведены на рис. 1. Данные представлены в виде оценки доли от общей введенной животному дозы, зарегистрированной в каждом органе или ткани.

 

Рис. 1. Распределение радиофармацевтического лекарственного препарата ¹⁷⁷Lu-DOTA-anti-CTLA4-GITR в организме животного с трансплантированной опухолью. Доля введенной общей дозы животному, зарегистрированная в отдельном органе (Organ_dose)

Fig. 1. Distribution of ¹⁷⁷Lu-DOTA-anti-CTLA4-GITR radiopharmaceutical medication in the tumor target animal organism. The portion of the total dose introduced into the animal registered in a separate organ (Organ_dose)

 

В ходе проведенного исследования было показано удовлетворительное накопление разрабатываемого препарата ¹⁷⁷Lu-DOTA-anti-CTLA4-GITR в области роста экспериментальной опухоли при проведении прямой радиометрии, отчетливо прослеживаемое во всех контрольных точках.

Основной путь выведения препарата из организма — мочевыделительная система. При этом на всем протяжении периода наблюдений отмечалось максимальное содержание ¹⁷⁷Lu-DOTA-anti-CTLA4-GITR в тканях почек мышей. При этом содержание препарата в крови животных было сравнительно низким.

Помимо накопления тестируемого препарата в почках, анализ результатов прямой радиометрии указывает на выраженную тенденцию к накоплению ¹⁷⁷Lu-DOTA-anti-CTLA4-GITR и в некоторых других, нецелевых для терапии органах — печени и кишечнике. Оценка степени токсического воздействия на эти органы не являлась задачей нашего исследования, но должна быть обязательной целью изучения безопасности разрабатываемого радиофармацевтического лекарственного препарата. В остальных оцениваемых органах и тканях накопление препарата имело умеренный и, большей частью, транзиторный характер или практически не происходило (например, в головном мозге).

ВЫВОДЫ

1. Путем прямой трансплантации злокачественных клеток экспериментальной аденокарциномы толстой кишки мышей (АКАТОЛ; СТ 26 EGFR) воспроизведена модель опухолевого процесса — колоректального рака. Модель характеризовалась умеренным темпом роста первичного опухолевого узла и практически полным отсутствием метастазирования. Иммуногистохимический анализ тканей опухоли выявил удовлетворительный уровень экспрессии целевых антигенов для тестируемого препарата — мембранного гликопротеина 4, ассоциированного с цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTLA4), и мембранного протеина, рецептора группы фактора некроза опухоли (GITR).
2. Тестируемый препарат ¹⁷⁷Lu-DOTA-anti-CTLA4-GITR удовлетворительно накапливается в опухолевой ткани; основной путь выведения препарата из организма — мочевыделительная система.
3. Отмечено накопление препарата в нецелевых органах: почках, печени, толстой кишке.
4. Результаты исследования могут быть внедрены в практику доклинических исследований лекарственных средств и средств медицинского применения и являются основанием для проведения расширенного исследования механизмов действия радиофармацевтического препарата ¹⁷⁷Lu-DOTA-anti-CTLA4-GITR и его безопасности.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования. Работы выполнена за счет финансирования в рамках государственного задания Минздрава России на научные исследования и разработки «Разработка радиофармпрепаратов на основе моноклональных антител для иммуно-ПЭТ-диагностики и терапии ЗНО» (2019–2021 гг.) и при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (проект 075-15-2021-1360).

ADDITIONAL INFORMATION

Author contribution. Thereby, all authors made a substantial contribution to the conception of the study, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the article, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the study.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Funding source. The study was financed by the Ministry of Health State Research Contract “Elaboration of Monoclonal antibodies-based radiochemical preparations for PET-diagnostics and therapy of Malignant tumors” (Project No. 075-15-2021-1360).

About the authors

Alexander P. Trashkov

B.P. Konstantinov Petersburg Nuclear Physics Institute of National Research Centre “Kurchatov Institute”; National Research Center “Kurchatov Institute”

Author for correspondence.
Email: alexander.trashkov@gmail.com

MD, PhD, Head, Center of Preclinical and Clinical Research

Russian Federation, Leningrad Region, Gatchina; Moscow

Tamara D. Gagloeva

B.P. Konstantinov Petersburg Nuclear Physics Institute of National Research Centre “Kurchatov Institute”; National Research Center “Kurchatov Institute”

Email: gagloeva_td@pnpi.nrcki.ru

Junior Research Associate, Center of Preclinical and Clinical Research, B.P. Konstantinov Petersburg Nuclear Physics Institute of NRC “Kurchatov Institute”; Junior Research Associate, Neorocognitive Research Resource Center, National Research Centre “Kurchatov Institute”

Russian Federation, Leningrad Region, Gatchina; Moscow

Alexander I. Budko

B.P. Konstantinov Petersburg Nuclear Physics Institute of National Research Centre “Kurchatov Institute”

Email: budko_ai@pnpi.nrcki.ru

MD, PhD, Laboratory Researcher, Center of Preclinical and Clinical Research

Russian Federation, Leningrad Region, Gatchina

Olyesya I. Timaeva

National Research Center “Kurchatov Institute”

Email: timaeva_oi@nrcki.ru

PhD, Academic Secretary, Kurchatov Complex of Nano-, Bio-, Informational, Cognitive and Socio-Humanitarian nature-like technologies

Russian Federation, Moscow

Marina Yu. Kopaeva

National Research Center “Kurchatov Institute”

Email: kopaeva_mu@nrcki.ru

Researcher, Resourse Center of Neurocognitive Technologies

Russian Federation, Moscow

Anton B. Cherepov

National Research Center “Kurchatov Institute”

Email: cherepov_ab@nrcki.ru

Leding Engeneer, Resourse Center of Neurocognitive Technologies

Russian Federation, Moscow

Nikolay V. Tsygan

B.P. Konstantinov Petersburg Nuclear Physics Institute of National Research Centre “Kurchatov Institute”; Kirov Military Medical Academy

Email: tsygan_nv@pnpi.nrcki.ru

MD, PhD, Dr. Sci. (Med.), Associate Professor, Leading Research Associate, Center of Preclinical and Clinical Research, B.P. Konstantinov Petersburg Nuclear Physics Institute of NRC “Kurchatov Institute”; Vice-Head, Department of the Nervous Diseases, Kirov Military Medical Academy

Russian Federation, Leningrad Region, Gatchina; Saint Petersburg

Andrei A. Stanzhevsky

B.P. Konstantinov Petersburg Nuclear Physics Institute of National Research Centre “Kurchatov Institute”; A.M. Granov Russian Scientific Center for Radiology and Surgical Technologies

Email: stanzhevsky_aa@pnpi.nrcki.ru

MD, PhD, Dr. Sci. (Med.), Associate Professor, Leading Research Associate, Center of Preclinical and Clinical Research, B.P. Konstantinov Petersburg Nuclear Physics Institute of NRC “Kurchatov Institute”; Vice-Director Research, A.M. Granov Russian Research Center for Radiology and Surgical Technologies, Ministry of Health of the Russian Federation

Russian Federation, Leningrad Region, Gatchina; Saint Petersburg

Andrey G. Vasiliev

St. Petersburg State Pediatric Medical University

Email: avas7@mail.ru

MD, PhD, Dr. Sci. (Med.), Professor, Head, Department of Pathologic Physiology with Courses Immunopathology and Medical Informatics

Russian Federation, Saint Petersburg

Mariya A. Pahomova

St. Petersburg State Pediatric Medical University

Email: mariya.pahomova@mail.ru

Senior Research Associate, Research Center

Russian Federation, Saint Petersburg

Dmitri N. Maistrenko

A.M. Granov Russian Scientific Center for Radiology and Surgical Technologies

Email: info@rrcrst.ru

MD, PhD, Dr. Sci. (Med.), Professor, Director

Russian Federation, Saint Petersburg

Christina A. Sergunova

National Research Center “Kurchatov Institute”

Email: sergunova_ka@nrcki.ru

PhD, Head Academic Secretary

Russian Federation, Moscow

Dmitri S. Sysoev

A.M. Granov Russian Scientific Center for Radiology and Surgical Technologies

Email: info@rrcrst.ru

PhD, Head, Group for research and production of equipment for nuclear medicine

Russian Federation, Saint Petersburg

Sergei V. Shatic

A.M. Granov Russian Scientific Center for Radiology and Surgical Technologies

Email: s_shatik@hotmail.com

PhD, Head Department Cyclotron Radiochemical Medications

Russian Federation, Saint Petersburg

Dmitri O. Antuganov

A.M. Granov Russian Scientific Center for Radiology and Surgical Technologies

Email: info@rrcrst.ru

Research Associate, Laboratory of Radiopharmaceutical Technologies

Russian Federation, Saint Petersburg

Andrei L. Konevega

B.P. Konstantinov Petersburg Nuclear Physics Institute of National Research Centre “Kurchatov Institute”; National Research Center “Kurchatov Institute”

Email: konevega_al@pnpi.nrcki.ru

PhD, Head of the Department Molecular and Radiological Biophysics, B.P. Konstantinov Petersburg Nuclear Physics Institute of NRC “Kurchatov Institute”; Head of the Department Biomedical Technologies, National Research Centre “Kurchatov Institute”

Russian Federation, Leningrad Region, Gatchina; Moscow

References

Supplementary files