Consensus “Cystic Fibrosis: definition, diagnostic criteria, treatment” Section “Microbiology and Epidemiology of chronic respiratory infections in cystic fibrosis”

Full Text

Микробиология и эпидемиология хронической респираторной инфекции при муковисцидозе. Введение Хроническая инфекция нижних дыхательных путей является ключевым признаком у больных муковисцидозом (МВ). Она является ведущим фактором, определяющим тяжесть клинического течения и прогноз заболевания. При изучении микрофлоры нижних дыхательных путей различных возрастных групп детей, больных МВ, исследователями различных стран установлено, что основными возбудителями инфекции легких у больных МВ являются Р. aeruginosa, S. aureus и H. influenzae. Показано [9, 20], что в первые годы жизни у больных МВ доминирует золотистый стафилококк, а затем основным возбудителем становится синегнойная палочка. При анализе данных микробиологических исследований установлено, что условно-патогенные микроорганизмы выделяются у 61,9 % детей в возрасте до 1 года, у 92,9 % - в возрасте 1-4 года, у 93,8 % - в возрасте 5-7 лет и в возрасте 8-14 и 15-18 у 100 % детей. Это свидетельствует о том, что колонизация легких микроорганизмами больных МВ начинается фактически с первых дней после рождения и достигает максимума уже к 5 годам жизни. При этом, если в группе детей до 1 года S. aureus выявляется только у 28,6 % детей, а P. aeruginosa - у 19 %, то в возрасте 5-7 лет золотистый стафилококк обнаружен у 87,5 % детей, а P. aeruginosa - у 31,2 % детей. Таким образом, в возрасте до 1 года более чем у 1/3 больных МВ нижние дыхательные пути еще не обсеменены микроорганизмами, в возрасте 1-4 лет нижние дыхательные пути обсеменены почти у всех больных (92,9 %), а к 8-18 годам - у 100 % больных. Хроническая стафилококковая, синегнойная или смешанная инфекция начинает диагностироваться у 25 % детей уже в возрасте 1-4 года, в возрасте 5-7 лет - у 50 % больных, в возрасте 8-14 лет - у 65 % и к 18 годам - у 80 % больных МВ [7, 10]. В последнее десятилетие очевидную клиническую значимость приобретают недостаточно изученные микроорганизмы - неферментирующие грамотрицательные микроорганизмы (НФМО) - Вurkholderia cepacia complex (Bcc), Stenotrophomonas maltophilia, Achromobacter xylosoxidans, нетуберкулезные микобактерии, грибы рода Aspergillus. При этом каждый патоген способен вызвать воспаление, которое может в той или иной степени привести к повреждению дыхательных путей, снижению легочной функции, ухудшению клинического статуса. Согласно международным рекомендациям о хронической инфекции, вызванной P. aeruginosa, может свидетельствовать идентификация патогена не менее 2 раз за последние 6 месяцев. Аналогичными критериями можно руководствоваться при выявлении у больного в монокультуре S. aureus и Bcc, а также при смешанной инфекции. С практической точки зрения приемлемыми являются и критерии, предложенные Lee et al. (2003), согласно которым обнаружение патогена более чем в 50 % образцов мокроты или смывов в течение предшествующих 12 месяцев может трактоваться как хроническая инфекция. Установлено, что в 2/3 случаев хроническая инфекция легких вызывается не монокультурой, а ассоциацией микроорганизмов, причем у госпитализированных больных, в отличие от амбулаторных больных, эти ассоциации представлены, как правило, не двумя, а тремя и более видами микроорганизмов. За рубежом [31, 35] эти показатели в два раза ниже - в 35 % исследуемых образцов бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) выявляют рост двух микроорганизмов и в 10 % случаев ассоциации представлены тремя и более видами микроорганизмов. По данным российских авторов [7, 10], наиболее часто встречающейся ассоциацией является сочетание P. aeruginosa + S. aureus (18,2 %), а также P. aeruginosa + Bcc (9,1 %). В 18 % случаев от больных в составе микробных ассоциаций выделяли одновременно P. aeruginosa мукоидный и немукоидный фенотипы. В составе ассоциаций, кроме P. aeruginosa, часто выделяли других представителей НФМО - S. maltophilia, A. baumanii [13, 26], что, вероятно, обусловлено тропизмом этих видов микроорганизмов к легочной ткани. Полученные данные послужили основанием для заключения, что для больных МВ характерным проявлением инфекционных осложнений является смешанная инфекция и что Bcc является типичным представителем госпитальной микрофлоры [7, 18]. Таким образом, при анализе микрофлоры детей, больных МВ, можно утверждать, что с увеличением возраста у больных формируются постоянные очаги хронической легочной инфекции, основными возбудителями которой являются P. aeruginosa и S. aureus. Особенностью бактерий P. aeruginosa, S. aureus и Bcc является устойчивость ко многим антибиотикам. Микробиологические свойства основных возбудителей хронической респираторной инфекции при муковисцидозе Микроорганизмы, инфицирующие больного МВ, определяют лечение, качество жизни, перспективы для трансплантации и общую выживаемость. Точная и своевременная идентификация возбудителей инфекций дыхательных путей имеет существенное значение для обеспечения своевременного начала лечения соответствующими антибиотиками с целью элиминации бактериальных патогенов и организации надлежащего инфекционного контроля для профилактики распространения патогенных микроорганизмов среди больных МВ. Ниже приведены основные микробиологические характеристики доминирующих возбудителей хронической респираторной инфекции и представлен алгоритм ее микробиологической диагностики. Staphylococcus aureus В настоящее время род Staphylococcus, относящийся к семейству Micrococcus, включает 45 видов [35]. Вид S. aureus - золотистый стафилококк - является одним из значимых патогенов для пациентов с МВ. Он вызывает хроническую инфекцию легких, приобретаемую в обществе и во время лечения в госпитальных условиях [31]. Бактерии S. aureus представляют собой грамположительные неподвижные кокки, при микроскопии располагающиеся в виде характерных скоплений - гроздей. Стафилококки не образуют спор, но могут образовывать капсулы. У больных МВ могут выделяться 3 морфологических типа колоний - мукоидные, немукоидные и с SCV (small colony varients)-фенотипом [31]. SCV-фенотип представляет собой мелкие без гемолиза и пигмента медленно растущие колонии на 5 % кровяном и шоколадном плотных агаризованных средах. Особое значение для больных муковисцидозом имеют метициллинустойчивые стафилококки, которые обладают устойчивостью ко многим антибиотикам. Метициллинустойчивые (MRSA) стафилококки обнаруживаются во многих больницах большинства стран мира. MRSA распространяются от человека к человеку, обычно с рук медперсонала [8]. Однако могут встречаться и другие механизмы передачи, например воздушно-капельный. Некоторые штаммы являются чрезвычайно трансмиссибельными, распространяясь внутри палат, между палатами и из больницы в больницу [8]. Неферментирующие грамотрицательные микроорганизмы Среди возбудителей хронической инфекции легких у больных МВ значимое место занимают НФМО, общими признаками которых являются природная устойчивость ко многим антибиотикам, высокая резистентность к дезинфектантам и распространение в больничных стационарах от больного к больному [11]. НФМО, наиболее часто вызывающие инфекции, принадлежат к нескольким родам и условно могут быть разделены на оксидазоположительные - роды Pseudomonas (кроме видов P. luteola и P. oryzihabitans), Burkholderia, Moraxella, Chryseobacterium и оксидазоотрицательные - роды Stenotrophomonas, Acinetobacter, Bordetella (кроме B. pertussis, B. avium, B. bronchiseptica, B. hinzii) [16, 23, 32]. Большинство из упомянутых выше родов и видов НФМО обладают высокой степенью фенотипического и генотипического родства с бактериями рода Pseudomonas, и многие из них еще в 90-х годах прошлого века относились к данному роду. Все эти микроорганизмы могут быть выделены из окружающей среды, однако клинической значимостью характеризуются только отдельные виды некоторых родов. PSEUDOMONAS AERUGINOSA Первоначальная классификация рода Pseudomonas, состоящего из пяти соответствующих rRNA-групп, подверглась радикальному пересмотру, закончившемуся изменением классификации многих видов рода Pseudomonas и объединением в отдельные роды. Эти роды включают Burkholderia, Stenotrophomonas, Comamonas, Shewanella, Ralstonia, Methylobacterium, Sphingomonas, Acidovorax и Brevundimonas. Род Pseudomonas (sensu stricto) включает соответствующую rRNA-группу 1 и объединяет 11 видов: Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, P. putida, P. veronii, P. monteilii, P. stutzeri, P. mendocina, P. pseudoalcaligenes, P. alcaligenes, P. luteola, P. oryzihabitans. Псевдомонады являются аэробными неспоробразующими грамотрицательными палочками, которые могут быть прямыми или слегка изогнутыми. Они составляют от 1,5 до 5 мкм в длину и от 0,5 до 1,0 мкм в ширину и обладают строгим дыхательным метаболизмом с использованием кислорода как конечного акцептора электронов. Некоторые изоляты могут расти в анаэробных условиях с использованием нитратов или аргинина в качестве конечных акцепторов электронов. Псевдомонады подвижны благодаря присутствию одной или более полярных флагелл. Клинические изоляты являются оксидазоположительными (за исключением P. luteola, P. oryzihabitans) и каталазоположительными, а также растут на агаре Мак-Конки как лактозонегативные колонии [23]. Псевдомонады широко распространены в природе с преимущественным обитанием в окружающей среде, связанной с водой. Они обнаружены в воде, почве, на растениях, включая овощи и фрукты. Из-за их способности выживать в водной среде эти микроорганизмы, особенно P. aeruginosa, стали одной из основных проблем как возбудители госпитальных инфекций [23]. Бактерии P. aeruginosa являются ведущей причиной нозокомиальных инфекций дыхательного тракта. Особое значение имеют для больных МВ. Основную роль в патогенезе инфекции легких у больных МВ играет мукоидный фенотип P. aeruginosa и воспалительные реакции больного [4, 9, 31]. Бактерии Burkholderia cepacia complex (Bcc) Бактерии Bcc - это группа грамотрицательных, неспорообразующих бактерий. В мазках, окрашенных по Граму, эти микроорганизмы представляют собой полиморфные прямые грамотрицательные палочки размером 0,5-1,0 × 1,5-5 мкм. После культивирования на 5 % кровяном агаре при t = 30 °C в течение 48 часов бактерии Bcc образуют серые гладкие колонии с ровными краями размером 1-2 мм с резким характерным запахом гнили. При наличии пигмента колонии могут быть окрашены в желтый цвет различной интенсивности. Вокруг колоний могут образовываться зоны гемолиза. На средах - Эндо и Мак-Конки колонии Bcc размером 1 мм окрашены в светло-розовый цвет (лактозонегативные). В настоящее время вид B. cepacia sensulato включает 20 близкородственных видов (табл. 1). Все геномовары могут выделяться от больных муковисцидозом, однако преобладающим является геномовар III - B. cenocepacia, обнаруженный в 70 % случаев инфекции, вызванной Bcc в Англии, Бельгии, США, Канаде [33]. В России от больных муковисцидозом, как и при исследовании образцов от больных с пневмонией в отделениях интенсивной терапии различных клиник города Москвы, также были выявлены бактерии Bcc, преимущественно принадлежащие к геномовару III A-B. cenocepacia [1, 4]. Клиническое значение бактерий Bcc и патогенез вызванной ими инфекции О колонизации легких Bcc у больных муковисцидозом впервые сообщено в начале 1970-х гг. [17]. Приблизительно у 20 % больных, колонизированных Bcc, возникал так называемый «цепация синдром», характеризующийся некротизирующей пневмонией с лихорадкой, бактериемией, увеличением скорости оседания эритроцитов и лейкоцитозом, который приводил к быстрому летальному исходу. Было высказано предположение, что появление Bcc является основной причиной неблагоприятного исхода у больных МВ. В настоящее время установлено, что Bcc представляет особую опасность для больных МВ. Хроническая микробная колонизация основных дыхательных путей ведет к развитию легочной инфекции - основной причины заболеваемости и смертности у больных МВ. Установлено, что особенностью инфекции при МВ является персистенция ассоциаций микроорганизмов в 59,4 % случаев. Особенностью персистенции штаммов Bcc является тяжелое течение в виде смешанной инфекции в ассоциации с бактериями P. aeruginоsa. Бактерии Bcc, способные персистировать у больных МВ, характеризуются устойчивостью ко многим антибиотикам. Доказана длительная (до 1 года 5 мес.) персистенция штаммов Bcc, выделенных от одного больного, с помощью мониторинга микрофлоры нижних дыхательных путей. Штаммы Bcc, колонизируя нижние дыхательные пути больных МВ, способны длительно персистировать и передаваться от пациента к пациенту [3, 6, 7]. Другие, более редко встречающиеся возбудители хронической респираторной инфекции Achromobacter xylosoxidans А. xylosoxidans - оксидазо- и каталазоположительный грамотрицательный неферментирующий микроорганизм, способный вызывать оппортунистические инфекции. Обладает природной резистентностью ко многим антибиотикам. В последнее время хроническая инфекция, вызванная Achromobacter xylosoxidans, у больных МВ встречается часто. Согласно полученным данным третий по частоте встречаемости из НФМО является Achromobacter xylosoxidans, который при исследовании образцов от больных детей за 2012-2013 гг. выделяли в 9 % случаев [4]. Род Acinetobacter Номенклатура видов Acinetobacter находится в процессе развития. В настоящее время получили наименование 7 видов. Для рутинных клинических целей в номенклатуре достигнут компромисс и организмы обозначаются как комплекс Acinetobacter calcoaceticus-baumanni. Большинство клинических лабораторий могут дифференцировать биовар anitratus от биовара lwoffii на основе окисления глюкозы (anitratis) или неокисления последней (lwoffii). Подобно P. aeruginosa, бактерии рода Acinetobacter распространены в окружающей среде. У 25 % здорового населения этим микроорганизмом колонизированы кожные покровы, а у 7 % колонизирована глотка. Виды Acinetobacter чаще всего вызывают внутрибольничную пневмонию. В больничном учреждении факторами риска для возникновения внутрибольничной пневмонии являются интубация, лечение антибиотиками, пребывание в палатах интенсивной терапии. Описан ряд инфекций, связанных с использованием медицинских приборов, например нозокомиальные менингиты. Чаще всего пневмонии как внутрибольничные инфекции возникали у больных раком и с травмами, а у ожоговых больных возникала раневая инфекция [11]. Stenotrophomonas maltophilia Этот микроорганизм, ранее обозначавшийся как Pseudomonas maltophilia (до 1988), позднее Xanthomonas maltophilia (1995-1997), является распространенным комменсалом, легко выделяемым из воды, почвы и сточных вод. Значимость этого микроорганизма при выделении не всегда ясна и может зависеть от наличия факторов риска. Так, в одном исследовании, проведенном в общем госпитале в 1979 г., показано, что только 6 (4,6 %) из 128 изолятов оказались клинически значимыми, то есть вызывали внутрибольничную инфекцию (ВБИ). С другой стороны, исследования в раковом центре показали, что ВБИ вызывали 114 (48 %) из 237 изолятов. S. maltophilia наиболее часто связана с пневмонией, особенно у больных с МВ, но может также вызывать широкий круг других ВБИ. Наибольшее число инфекций встречается в больничных учреждениях, где факторы риска включают злокачественные опухоли, использование центральных венозных катетеров и лечение антибиотиками. В исследовании 91 случая бактериемий, вызванных S. maltophilia, у 78 % больных были злокачественные опухоли, а источником инфекции был центральный венозный катетер. Показатель смертности от ВБИ в данном исследовании составил 38 %. Недавно описаны несколько необычных проявлений инфекции, вызванной S. maltophilia. Так, в сообщении о 114 инфекциях из ракового центра у 17 больных наблюдали инфекции слизистой облочки и кожных покровов и/или инфекции мягкой ткани, 6 имели метастатические целлюлиты, представлявшие собой кожные узлы с окружающими целлюлитами и 1 - повреждение в виде гангренозной эктимы. Каждый из рассматриваемых нами НФМО микроорганизмов способен вызывать развитие хронической пневмонии у больных с МВ, исход которой, как правило, неблагоприятен для больного [11]. Микобактерии, не принадлежащие к виду Mycobacterium tuberculosis В последние годы возросло количество случаев инфицирования больных муковисцидозом микобактериями, не относящимися к виду M. tuberculosis (Nontuberculous mycobacteria (NTM)). Из мокроты пациентов выделяли Mycobacterium avium-intracellulare (MAI), Mycobacterium chelonei, Mycobacterium fortuitum [22]. Среди пациентов в США бактерии NTM идентифицировали в 12,5 % случаях, причем наиболее часто выделяли Mycobacterium avium complex (MAC). На втором месте по частоте высева были Mycobacterium abscessus [28]. Особенностью культивирования микобактерий явяется дительный период роста на питательной среде Левенштейна-Йенсена. Кроме того, у больных муковисцидозом образцы мокроты контаминированы P. aeruginosa и другими микроорганизмами. Рекомендуется обрабатывать образцы мокроты от больных муковисцидозом для устранения контаминации перед посевом 0,25 % N-ацетил-L-цистеином и 1 % гидроксидом натрия (NALC-NaOH), а затем добавлять 5 % oxalic acid (OXA). Особое значение для идентификации и типирования этих микроорганизмов имеют молекулярно-генетические методы (ПЦР, мультилокусное секвенирование, секвенирование генома). Для точной постановки диагноза необходимо выделение культуры микобактерий и дальнейшее генетическое типирование с использованием молекулярно-генетических методов [19]. Анаэробные микроорганизмы Использование анаэробных культуральных методик указывает на обнаружение в дыхательных путях больных МВ большого числа анаэробов [4, 36]. В исследовании M.M. Tunney et al. анаэробные бактерии, прежде всего Prevotella, Veillonella, Propionibacterium и Actinomyces, были изолированы в 64 % образцов мокроты у пациентов с МВ. Колонизация P. aeruginosa достоверно повышает вероятность присутствия анаэробов в мокроте. Сходные анаэробные штаммы были обнаружены в бронхоальвеолярной жидкости у детей с МВ. В двух исследованиях показано, что микроорганизмы из рода Prevotella особенно часто встречаются у больных МВ [36]. Более того, высказывается предположение об их провоспалительном действии, что подтверждается резким увеличением концентрации данных микроорганизмов в период обострения. Тем не менее точно определить клиническое значение этих бактерий на сегодня не представляется возможным. Алгоритм микробиологической диагностики хронической респираторной инфекции Идентификация возбудителей хронической респираторной инфекции является важнейшим звеном в прогнозе жизнедеятельности больного МВ, в связи с этим в настоящее время в лабораторной диагностике используются современные микробиологические, молекулярно-генетические и молекулярно-биологические методы. Правильная микробиологическая диагностика мокроты больных МВ представляет трудности, так как микробная флора дыхательных путей у таких больных представлена часто ассоциациями, а некоторые микроорганизмы проявляют атипичные для своего вида фенотипические свойства, например ауксотрофные P. aeruginosa и SCV S. aureus. Разработанный нами алгоритм микробиологической диагностики хронической респираторной инфекции включает несколько этапов, позволяющих рационально и максимально достоверно провести диагностику смешанной хронической инфекции легких. Материалом при исследовании нижних дыхательных путей у больных МВ являются мокрота при кашле, мазок из зева после кашля, ларингенальный или назофарингеальный аспират, индуцированная гипертоническим раствором мокрота, бронхоальвеолярный лаваж, материал щеточной биопсии при бронхоскопии. По данным Equi et al., чувствительность и специфичность результатов посевов мазка из зева после кашля по сравнению с результатами посевов спонтанной мокроты составляет 34 и 100 % соответственно. Чувствительность показывает процент положительного результата, полученного методом посева мазка из зева, по сравнению с положительным результатом, полученным при посеве мокроты. Специфичность показывает процент отрицательного результата, полученного методом посева мазка из зева, по сравнению с отрицательным результатом, полученным при посеве мокроты [4]. Установлено, что любая задержка, в частности хранение при комнатной температуре (20-25 ºC), приводит к увеличению количества быстро растущих бактерий, что может привести к угнетению роста истинных патогенов, и, наоборот, хранение в холодильнике (4 ºC) может привести к гибели термофильных патогенных микроорганизмов. Перед посевом мокроту предварительно отмывают в стерильном изотоническом растворе хлорида натрия и гомогенизируют механическим перемешиванием в течение 10 мин стерильными микробиологическими бусами или химическим методами - обработка дитиотрейтолом. Обязательным для установления диагноза хронической инфекции, вызванной ассоциацией возбудителей, является неоднократное в течение 6 месяцев выделение чистой культуры микроорганизмов, так называемый «золотой стандарт». Поэтому посев мокроты осуществляют на универсальные среды - 5 % кровяной и шоколадный агары с накладыванием на поверхность дисков с гентамицином и оптохином для выявления Haemophilus influenza и Streptococcus pneumonia и селективные среды для выделения S. aureus, P. aeruginosa, Bcc, Candida spp., Enterobacteriacaee и НФМО (ЖСА, цетримидный агар, BCSA, Сабуро, Эндо). Идентификация основных возбудителей хронической инфекции Идентификация золотистого стафилококка Идентификацию стафилококков проводят на селективной среде - желточно-солевом агаре (ЖСА). На основании фенотипических свойств - наличия пигмента и лецитиназной активности штаммы стафилококков относят к виду S. аureus. Для подтверждения принадлежности стафилококка к виду S. аureus также необходимо использовать тест на коагулазу. Летициназоположительные стафилококки, характеризующиеся положительным тестом на коагулазу, относят к виду S. аureus. У больных МВ встречаются атипичные формы золотистого стафилококка, которые трудно выделять и идентифицировать общепринятыми методами, благодаря их замедленному росту и нетипичным для стафилококков свойствам. Такие атипичные формы называют штаммами с фенотипом мелких колоний (SCV). Бактерии медленно растут, в результате через 48 часов роста формируются очень маленькие без пигмента и гемолиза колонии, имеющие fried-egg-фенотип («яичницы глазуньи») или точечный фенотип, редко - мукоидный фенотип. SCV-стафилококки имеют также другие атипичные, нехарактерные для метаболически нормальных стафилококков, свойства. Могут быть лецитиназоотрицательными, слабо коагулазоположительными, характеризоваться отсутствием фермента маннитола, ауксотрофными по гемину, тимидину и менадиону и характеризоваться возможностью возврата в родительскую форму. Часто ассоциируются с персистентной инфекцией и обладают резистентностью к антибиотикам [11]. По данным Gómez-González et al., распространенность SCVs S. aureus в клинических экземплярах составляет приблизительно 1 %, а среди больных муковисцидозом - до 17 %. SCV S. aureus может часто высеваться от пациентов, которые получали гентамицин или другие аминогликозиды [16]. Лабораторная диагностика, определение чувствительности к антибиотикам атипичных форм золотистого стафилококка может иметь существенное значение для выбора тактики антимикробной терапии стафилококковой инфекции у больных МВ. В результате проведенных исследований было выявлено 12 штаммов SCV [4]. При этом в 6 случаях наблюдали смешанную инфекцию с Pseudomonas aeruginosa. Четыре из выделенных штаммов были резистентными более чем к трем группам антибиотиков, у двух из которых выявлен ген MecA. Поэтому при выделении штаммов с SCV-фенотипом необходимо подтвердить принадлежность к виду S. aureus с использованием молекулярно-генетических методов (ПЦР, MLST) и исследовать их на антибиотикочувствительность. При исследовании антибиотикочувствительности 208 штаммов стафилококков диско-диффузионным методом или с помощью ATB-стрипов (BioMerieux) было показано [4], что 31 (15 %) штамм устойчив к оксациллину. Пятнадцать из этих штаммов были коагулазоположительными, что позволило, учитывая также пигментообразование и лецитиназную активность, отнести их к MRSA, а остальные 16 штаммов - к метициллинрезистентным коагулазоотрицательным стафилококкам (КОС). Для определения устойчивости стафилококков к метициллину обычно используют диско-диффузионный метод [8]. Применяют диски с оксациллином (1 мкг), так как оксациллин является наиболее стабильным антибиотиком при хранении. Идентификацию осуществляют в условиях, способствующих экспрессии устойчивости, а именно на среде Мюллера-Хинтона с добавлением 4 % NaCl, инкубируя чашки Петри в течение 24 часов при 37 °С. Некоторые исследователи предлагают проводить инкубацию в течение 48 часов при 30 °С [8]. В связи с имеющейся гетерогенностью устойчивости к метициллину ряд исследователей рекомендуют проведение идентификации гена mecA молекулярно-генетическими методами с использованием ДНК-зондов или амплификацией гена в ПЦР. При выявлении у стафилококков устойчивости к метициллину диско-диффузионным методом и идентификации гена mecA генетическими методами такие штаммы рекомендуется далее тестировать на устойчивость к ванкомицину, так как большинство VISA и гетеро-VRSA обычно устойчивы к метициллину. Национальный комитет по клиническим лабораторным стандартам (NCCLS) установил, что стафилококки, у которых рост ингибируется 4 и менее мкг/мл ванкомицина, являются чувствительными, 8-16 мкг/мл - умеренно устойчивыми и 32 и более мкг/мл - резистентными. В соответствии с этими показателями в литературе умеренно устойчивые к ванкомицину штаммы S. aureus (MIC ванкомицина = 8 мкг/мл) обозначают VISA, а резистентные (MIC = 32 и более мкг/мл) - VRSA. Большинство VISA-изолятов первоначально выглядят в виде смешанной популяции, состоящей из различных по морфологии и пигменту колоний. Преобладают большие кремового цвета колонии и маленькие колонии серого цвета. Однако при тестировании различных по морфологии и цвету колоний на устойчивость к ванкомицину они демонстрируют идентичные профили антибиотикограмм и ДНК при тестировании с помощью пульс-электрофореза. Так как способность формирования биопленок является свойством штаммов, способных вызывать хроническую инфекцию, оптимальным для полной характеристики штаммов является определение способности к формированию биопленок штаммами золотистого стафилококка. Было изучено формирование биопленок у 106 штаммов стафилококков, выделенных от больных МВ [4]. Из 106 изученных штаммов у 16 (16,9 %) наблюдали выраженную способность к формированию биопленки, у 54 (57,2 %) - умеренную, у 36 штаммов (38 %) - низкую. Таким образом, для точной идентификации видов стафилококков необходимо использовать комплекс бактериологических, биохимических, молекулярно-генетических методов. Идентификация неферментирующих грамотрицательных микроорганизмов Идентификация Pseudomonas aeruginosa Род Pseudomonas (sensu stricto) включает 11 видов. Для больных муковисцидозом наиболее значимым является Pseudomonas aeruginosa. Типичные изоляты синегнойной палочки идентифицируют по таким свойствам, как пигментообразование, положительный тест на оксидазу, рост при 42 °C, характерный земляничный запах, рост на цетримидном агаре. При этом от больных МВ с хронической синегнойной инфекцией часто изолируют атипичные формы P. aeruginosa, которые трудно идентифицировать без применения молекулярно-генетических методов (ПЦР) [29]. Псевдомонады хорошо растут на стандартных лабораторных средах, таких как триптиказный соевый агар с 5 % бараньей кровью или шоколадный агар. Подобная среда может быть использована для выделения микроорганизмов из клинических проб, например цереброспинальной жидкости, тканевой жидкости или жидкости после перитонеального диализа, когда наиболее вероятным является выделение смешанной флоры. С целью выделения P. aeruginosa из образцов, содержащих смешанную флору, используются селективные среды. Агар Мак-Конки - наиболее часто используемая селективная среда для выделения большинства псевдомонад, включая мукоидные штаммы P. aeruginosa от больных муковисцидозом. Селективные среды, содержащие селективные агенты, такие как цетримид, ацетамид, нитрофурантоин и 9-хлор-9-[4-(диэтиламино) фенил]-9, 10-дигидро- 10-фенилакридингидрохлорид (С390) также могут быть использованы для изоляции P. aeruginosa из клинических образцов и образцов окружающей среды [4, 36]. Большинство изолятов P. aeruginosa легко распознаются на первичной питательной среде на основе морфологических характеристик колоний, продукции диффундирующего пигмента, а также характерного запаха культуры «земляничного мыла» или, как его характеризуют зарубежные микробиологи, запаха «винограда или зерна тако». Колонии обычно имеют плоскую поверхность и склонность к ползучему росту, неровные края и металлический блеск, который часто связан с аутолизом колоний. Существуют и другие виды колоний, включающие гладкие, колиформные колонии, а также слизистые, карликовые и мукоидные формы. Мукоидный вариант колоний преобладает в образцах из респираторного тракта больных муковисцидозом. P. aeruginosa продуцирует целый ряд водорастворимых пигментов. Когда пиовердин сочетается с голубым водорастворимым пигментом феназином, пиоцианин приобретает светло-зеленый цвет. Этот микроорганизм также может продуцировать один из двух водорастворимых пигментов: пиорубрин (красный) или пиомеланин (коричневый или черно-коричневый). Идентификация P. aeruginosa может быть подтверждена на основе положительного теста на оксидазу. Могут также встречаться беспигментные штаммы P. aeruginosa, очень часто это штаммы с повышенным содержанием мукоида, выделенные из секрета респираторного тракта больных муковисцидозом. На практике обнаружение мукоидных штаммов, представляющих собой грамотрицительные неферментирующие глюкозу палочки, выделенных из образцов респираторного тракта больных муковисцидозом, является достаточным для идентификации микроорганизма как P. aeruginosa. Однако если выделяется беспигментный штамм, необходимо проследить основные биохимические характеристики, включая рост при 42 °С, гидролиз ацетамида, редукцию нитратов с образованием нитрогенного газа. Значимым признаком для P. aeruginosa, как и для остальных представителей неферментирующих бактерий, является природная устойчивость к многим антибиотикам, что, вероятно, обусловлено, с одной стороны, тем, что для многих микроорганизмов основной экологической нишей является почва, а среди почвенных микроорганизмов известно достаточное число штаммов - продуцентов антибиотиков, а с другой - многообразием у этих представителей различных внехромосомных элементов (плазмид, бактериофагов), способных нести в составе генома детерминанты лекарственной устойчивости. Исследование чувствительности штаммов P. aeruginosa, выделенных от больных муковисцидозом, с помощью тест-системы АТВ и диско-диффузионным методом показало, что 100 % штаммов P. aeruginosa были чувствительны к колистину, 85,5 % - к цефтазидиму, 82 % - к меропинему, 71 % к имипенему, азлоциллину, левофлоксацину и тобрамицину, 75 % - к офлоксацину и ципрофлоксацину, 97 % - пиперациллин + тазобактам, 92 % - пиперациллину. 82 % штаммов P. aeruginosa были устойчивы к ампициллин - сульбактаму, 79 % - к ко-тримоксазолу, 79 % - к цефотаксиму, 62,5 % - к цефтриаксону и 83 % - к левомицитину. Идентификация и дифференциация бактерий Bcc Идентификация бактерий комплекса Bcc является многоэтапной и единственной в практике, где необходима комбинация фенотипических и генотипических методов, т.е. использование полифазного таксономического подхода. На 1-м этапе для выделения Bcc из образца осуществляют посев на селективную среду. Для выделения бактерий комплекса Bcc из мокроты больных муковисцидозом наиболее оптимальной является BCSA-агар (Burkholderia cepacia selective agar), содержащий 1 % лактозы, 1 % сахарозы на обогащенной основе казеина и дрожжевого экстракта с добавлением 600 мкг/мл полимиксина В, 10 мкг/мл гентамицина и 2,5 мкг/мл ванкомицина. На этой среде растут преимущественно бактерии комплекса Bcc, но наряду с ними могут расти B. gladioli, виды Ralstonia и S. maltophila. После выделения бактерий на селективной среде необходимо осуществить их идентификацию с помощью молекулярно-генетических методов. Могут использоваться и другие дополнительные тесты: определение гемолитической, протеазной активности, способности образования биопленки. На современном этапе для типирования используется метод мультилокусного секвенирования и секвенирование генома [3, 4, 6, 7]. Устойчивость к антимикробным препаратам Из анализа антибиотикограмм штаммов Bcc [5], выделенных от 67 больных детей от 5 до 17 лет и от 38 взрослых больных, в процессе динамического наблюдения выявлено, что все штаммы являются мультирезистентными. Установлено, что абсолютно все штаммы резистентны к амикацину, гентамицину, тобрамицину и имипенему. К ко-тримоксазолу резистентны 88,6 %, к хлорамфениколу - 58,7 %, к цефепиму - 80,8 %, к цефоперазону - 76,5 %, к ципрофлоксацину - 85,5 %, к цефриаксону - 60,8 %. Низкий процент резистентности был выявлен по отношению к меропенему и цефтазидиму - 14,1 и 17,9 % соответственно. 71,8 % штаммов были чувствительны к цефтазидиму, 56,4 % - к меропенему. 90,9 % штаммов Всс были чувствительны к комбинированному антибиотику пиперациллин-тазобактаму. При исследовании чувствительности к антимикробным препаратам также установлено, что все штаммы полирезистентны к 5 антибиотикам: имипенему, ко-тримазолу, тобрамицину, гентамицину и амикацину, что может свидетельствовать об их госпитальном происхождении. Таким образом, можно сделать заключение, что в процессе лечения штаммы приобретают устойчивость к антимикробным препаратам, что делает возможным длительную персистенцию микроорганизма и препятствует эрадикации возбудителя. Надо отметить, что данные антибиотикограмм, полученные в результате исследования in vitro, могут не отражать «истинную» чувствительность возбудителя в условиях in vivo. Тест определения антибиотикочувствительности может зависеть как от свойств самого возбудителя, в том числе и от способности образовывать биопленку, так и от условий его культивирования. Зарубежными авторами было показано, что при исследовании 101 образца мокроты из каждого образца было выделено по 4 морфотипа колоний одного генотипа P. aeruginosa [15]. Среди одного морфотипа практически каждая колония имела антибиотикограмму, отличную от других колоний одного морфотипа. 48 колоний P. aeruginosa, выделенных из одного образца мокроты, имели различные антибиотикограммы. Однако приведенные выше данные не отрицают, а подтверждают необходимость постоянного мониторинга антибиотикочувствительности штаммов микроорганизмов у больных МВ. Точная идентификация НФМО от больных МВ является наиболее сложной задачей. Очень часто нетипичные по фенотипическим свойствам микроорганизмы ошибочно могут диагностироваться как другие виды микроорганизмов. Ложная идентификация P. aeruginosa или Bcc может иметь нежелательные последствия, ведущие к выбору неправильной терапии и изоляции пациентов. Например, в проведенном исследовании 2 штамма атипичной P. aeruginosa и 2 штамма A. xylosoxidans были неправильно идентифицированы API 20NE как Всс, 12 штаммов Bcc биохимическими тестами (LaChema) были неправильно идентифицированы как другие НФМО [4]. Около 3,4 % штаммов биохимическими тестами не удалось идентифицировать вообще. Для окончательной точной идентификации были использованы молекулярно-генетические методы. Kiska et al. показали в своей работе, что точность идентификации НФМО 4 различных коммерческих тест-систем составляет 57-80 %, а точность идентификации Всс - 43-86 %. При этом все тесты идентифицировали НФМО, не являющиеся Всс, как Всс [24]. В связи с этим методы, основанные на ПЦР, в частности real-time ПЦР, могут быть незаменимы в сложных ситуациях. Для точной идентификации Всс необходимо соблюдать следующую схему: 1) посев мокроты на 5 % кровяной агар, BCSA с дальнейшим выделением чистой культуры; 2) исследование чистой культуры молекулярно-генетическими методами: ПЦР на ген recA [1]; 3) исследование мокроты молекулярно-генетическими методами [2]. Идентификация Achromobacter xylosoxidans А. xylosoxidans - оппортунистческий патоген, оксидазо- и каталазоположительный грамотрицательный неферментирующий микроорганизм. Обладает природной резистентностью ко многим антибиотикам. В последнее время хроническую инфекцию, вызванную A. хylosoxidans, ложно диагностируют как Всс в связи с фенотипическим сходством с Всс при культивировании на 5 % кровяном агаре и ростом на BCSA - селективной для Всс среде. Для подтверждения принадлежности бактерии к виду A. хylosoxidans необходимо использовать тест-системы API 20 NE (BioMerieux) и ПЦР для выявления локуса в 16S рДНК со специфическими праймерами AX-F1 и AX-B1 [25]. Идентификация анаэробной инфекции В результате процессов в легких при МВ, приводящих к нарушению мукоцилиарного очищения, нарушается газообмен в легких и могут создаваться анаэробные условия, что способствует возникновению анаэробной инфекции. Исследования показали [4], что причиной легочной инфекции могут быть также анаэробные микроорганизмы. У 2 детей классические бактериологические методы не позволили идентифицировать возбудителя легочной инфекции. При исследовании мокроты с помощью real-time ПЦР были выявлены анаэробные микроорганизмы. Для выращивания и идентификации анаэробов необходимы специальные анаэробные условия (анаэростат). При отсутствии анаэростата методом выбора является ПЦР real-time, при использовании которой идентификация анаэробов возможна непо

About the authors

Igor A Shaginyan

N.F. Gamaleya Federal Scientific Research Center for Epidemiology and Microbiology

Email: shaginyan@gamaleya.org
MD, PhD, Dr Med Sci, Head of Laboratory Molecular Epidemiology of Hospital Infections. FSBI "N. F. Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology" of the Ministry of health of Russia

Marina Yu Chernukha

N.F. Gamaleya Federal Scientific Research Center for Epidemiology and Microbiology

Email: chernukha@gamaleya.org
MD, PhD, Leading Scientist, Laboratory Molecular Epidemiology of Hospital Infections. FSBI "N. F. Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology" of the Ministry of health of Russia

Nikolay I Kapranov

FSBI "Medical genetic research center"

Email: nikolay.i.kapranov@gmail.com
MD, PhD, Dr Med Sci, Professor, Chief. Scientific Researcher of the Scientific Advisory Department of Cystic Fibrosis. FSBSI “Research Centre for Medical Genetics”.

Elena I Kondratyeva

FSBI "Medical genetic research center"

Email: elenafpk@mail.ru
MD, PhD, Dr Med Sci, Professor Head of the Research Department of Cystic Fibrosis. FSBSI “Research Centre of Medical Genetics”

Nataliya Yu Kashirskaya

FSBI "Medical genetic research center"

Email: kashirskayanj@mail.ru
MD, PhD, Dr Med Sci, Professor, Leading Research Fellow, Laboratory of Genetic Epidemiology. FSBSI “Research Centre of Medical Genetics”

Elena L Amelina

FSBI "Scientific research Institute of pulmonology" FMBA of Russia

Email: eamelina@mail.ru
MD, PhD, Head of Cystic Fibrosis Laboratory. FSBI "Scientific Research Institute of Pulmonology" of the Federal Medical-Biological Agency of Russia.

Irina K Asherova

"Children's clinical hospital No 1"

Email: irina_asherova@mail.ru
MD, PhD, Dr Med Sci, Head of the Pulmonary Department. SIH of the Yaroslavl Region "Children's Clinical Hospital N 1"

Igor K Volkov

"First Moscow state medical University. I.M. Sechenov" of rmph

MD, PhD, Dr Med Sci, Professor. I. M. Sechenov First Moscow State Medical University.

T E Gembitskaya

Research Institute of pulmonology Scientific-practical research centre of sbee HPE "Pspb GMU. academician I.P. Pavlov" of the Ministry of health

Email: mukoviscidoz_otd@mail.ru
MD, PhD, Dr Med Sci, Professor, Head of Therapeutics Pulmonology Department. Pulmonology Scientific Research Institute of Pavlov First Saint Petersburg State Medical University.

Evgeniy K Ginter

FSBI "Medical genetic research center"

Email: ekginter@mail.ru
MD., PhD, Dr Med Sci, Professor. Director of the FSBSI “Research Centre of Medical Genetics”.

Nataliya A Ilyenkova

"Krasnoyarsk state medical University. Professor V.F. Voyno-Yasenetsky" of rmph

Email: ilenkova1@mail.ru
M.D., PhD, Dr Med Sci, Professor, Head of Child Diseases Department. Krasnoyarsk State Medical University named after Prof. V. F. Voino-Yasenetsky

Irina P Karimova

GBUZ "Chelyabinsk regional children's clinical hospital"

Email: eamelina@mail.ru
MD, PhD, Head of Pulmonology Department. GBUZ "Chelyabinsk regional children's clinical hospital".

Stanislav A Krasovsky

FSBI "Scientific research Institute of pulmonology" FMBA of Russia

Email: sa_krasovsky@mail.ru
MD, PhD, Research Fellow of the Laboratory of Cystic Fibrosis. FSBI "Scientific Research Institute of Pulmonology" of the Federal Medical-Biological Agency of Russia.

Nina B Merzlova

"Perm state medical University n. a. E.A. Wagner" of MOH of Russia

Email: nmerzlova@yandex.ru
MD, PhD, Dr Med Sci,Professor, Head of Department of Hospital Pediatrics. "Perm State Medical University n. a. E. A. Wagner" of the MOH of Russia

Ludmila P Nazarenko

FSBI "Sri of medical genetics"

Email: Ludmila.nazarenko@medgenetics.ru
MD, PhD, Dr Med Sci, Professor, Federal State Budgetary Institution “Research Institute of Medical Genetics”

Leila S Namazova-Baranova

FSBI "Scientific center of children health" of the Ministry of health of the Russian Federation

Email: namazova@nczd.ru
MD, PhD, Dr Med Sci, Professor. Director of the Research Institute of Pediatrics, FSB Institution "Scientific Center of Children's Health" of the Ministry of Health of the Russian Federation.

Alla F Neretina

"Voronezh state medical Academy n. a. N.N. Burdenko" Ministry of health of Russia

Email: neretinaalla@mail.ru
MD, PhD, Dr Med Sci, Professor. Voronezh State Medical University named after N. N. Burdenko.

Victoria S Nikonova

FSBI "Medical genetic research center"

Email: nikonovavs@mail.ru
MD, PhD, Scientific Researcher of Department of Cystic Fibrosis. FSBSI “Research Centre of Medical Genetics”.

Aleksandr V Orlov

"Children's City Hospital of St. Olga"

Email: orlovcf@rambler.ru
MD, PhD, Associate Professor, Head of Infectious Boxed Department N 3. Saint Petersburg "Child hospital of St. Olga"

Sergei S Postnikov

"Russian national research medical University named after N. And. Pirogov" of rmph

Email: clinpharm@rambler.ru
MD, PhD, Dr Med Sci, Professor. Department of Clinical Pharmacology. The Pirogov Russian National Research Medical University.

Tatiyana A Protasova

FSBI "Sri of medical genetics"

Email: protasova-oori@yandex.ru
Head of the Department of Acute Respiratory Infections, the Head of the Regional Center for Cystic Fibrosis for Kids. SAHI "Kemerovo Regional Clinical Hospital".

Sergei Yu Semykin

FSBI "Russian children's clinical hospital" of MOH of Russia

Email: dr.semykin@mail.ru
MD PhD, Head of Pediatrics Department. FSBI “Russian Pediatric Clinical Hospital”.

Diana F Sergienko

"Astrakhan state medical Academy" of rmph

Email: gazken@rambler.ru
MD PhD, Dr Med Sci, Associate Professor of Department of Faculty Pediatrics. Astrakhan State Medical University

Olga I Simonova

FSBI "Scientific center of children health" of the Ministry of health of the Russian Federation

Email: oisimonova@mail.ru
MD, PhD, Dr Med Sci, Professor, Head of Pulmonology and Allergology Department. FSB Institution "Scientific Center of Children's Health" of the Ministry of Health of the Russian Federation.

Irina D Uspenskaya

FSBI "Nizhny Novgorod research Institute of pediatric gastroenterology" of rmph

Email: uspenskaya.i.d@gmail.com
MD, PhD, Dr Med Sci, Head of "Clinical Pathology of the Small Intestine". FSBI "Nizhny Novgorod research Institute of Pediatric Gastroenterology".

Lidiya A Shabalova

FSBI "Medical genetic research center"

Email: shabalova.lidia@yandex.ru
MD, PhD, Scientific Researcher of Department of Cystic Fibrosis. FSBSI “Research Centre of Medical Genetics”.

Victoria D Sherman

FSBI "Medical genetic research center"

Email: tovika@yandex.ru
MD, PhD, Scientific Researcher of Department of Cystic Fibrosis. FSBSI “Research Centre of Medical Genetics”

References

Supplementary files