The technical aspects of collecting and transporting the sputum cystic fibrosis patients

Full Text

Муковисцидоз (МВ) - кистофиброз поджелудочной железы - часто встречающееся генетически детерминированное заболевание, характеризуется поражением всех экзокринных желез жизненно важных органов и систем организма, отличается выраженной генетической гетерогенностью и клиническим полиморфизмом, наследуется по аутосомно-рецессивному типу [1, 2]. Наряду с распространенным поражением экзокринных желез для МВ характерны кистозное перерождение поджелудочной железы (ПЖ) и поражение желез кишечника и дыхательной системы из-за закупорки их выводящих протоков вязким секретом, возникающим вследствие изменения функций хлорных каналов мембран эпителиальных клеток [1, 2, 4]. При муковисцидозе в той или иной степени вовлекается в патологический процесс весь организм, но в большей степени - органы дыхания, пищеварительный тракт, печень, поджелудочная железа, желчные пути, потовые железы и половые органы (особенно у лиц мужского пола). Ведущим в клинической картине МВ является поражение двух систем организма: бронхолегочной и пищеварительной, степень нарушения деятельности которых определяет исход заболевания [1, 2]. С рождения больные муковисцидозом предрасположены к развитию бактериальной инфекции дыхательных путей. В ее основе лежит затрудненная эвакуация из бронхиального дерева характерного для МВ густого вязкого секрета. Вирусная инфекция повышает риск и ускоряет развитие бактериальной инфекции [3]. Спектр бактериальных патогенов при МВ с возрастом больного постепенно расширяется. На первых годах жизни при инфицировании бронхиального дерева в посевах мокроты выявляется пневмококк, затем развивается стафилококковая, а в последующем респираторная инфекция, обусловленная H. influenzae и Ps. aeruginosa. В последнее время возросла роль анаэробов и Burkholderia cepacia, при обсеменении которыми значительно осложняется терапия МВ [1-4]. В разных клинических центрах больные МВ дети с хронической синегнойной инфекцией составляют от 15 до 50 % всех пациентов. Среди взрослых более половины больных имеют хроническую синегнойную инфекцию, утяжеляющую течение заболевания и приводящую к увеличению затрат на лечение. Применяемые в настоящее время различные режимы оральной, ингаляционной и внутривенной антибактериальной терапии могут предупредить или задержать развитие хронической инфекции дыхательных путей, вызванной синегнойной палочкой. Своевременная диагностика инфекционного процесса у больных муковисцидозом является первостепенной задачей. Особенно это важно для своевременного лечения при первичном высеве Ps. aeruginosa и Burkholderia cepacia. Раннее лечение позволяет в большинстве случаев предупредить формирование хронической синегнойной инфекции [1, 2, 4]. Это касается и повторных высевов Ps. aeruginosa после предшествующей эрадикации данной инфекции. Однако не во всех городах имеются лаборатории, достаточно оснащенные для качественного выполнения бактериологических анализов мокроты у пациентов с муковисцидозом, особенно для выделения Ps. aeruginosa и Burkholderia cepacia. В связи с этим актуален выбор метода сбора материала и способов его хранения и транспортировки в специализированные лаборатории. Целью работы явилось изучение возможности выполнения эффективных посевов мокроты больных муковисцидозом при доставке ее в сертифицированную бактериологическую лабораторию крупного города из отдаленных регионов в течение двух дней. Материалы и методы У 51 пациента с муковисцидозом в 5 городах (Мурманск, Петрозаводск, Псков, Вологда, Калининград) были проведены заборы мокроты, которые доставили для исследования в бактериологическую лабораторию ФГБУ НИИДИ ФМБА России в Санкт-Петербурге. У 5 пациентов произведен забор откашливаемой мокроты, у 12 - индуцированной мокроты, у 24 - проводился смыв с задней стенки глотки, у 8 - мазок с задней стенки глотки, родители 2 пациентов принесли мокроту, которую дети откашляли дома накануне. Согласно методическим указаниям МУ4.2.2039-05 [1], введенным в действие 01.07.2006, забор материала проводился натощак после полоскания рта кипяченой водой в асептических условиях в стерильные контейнеры. Мазок из зева проводили с использованием шпателя стерильным тампоном (миндалины, небные дужки, задняя стенка глотки), не касаясь щек, языка, десен и губ. Смыв с задней стенки глотки брали в виде аспирата в стерильный контейнер после инстилляции 2 мл стерильного физиологического раствора в глотку [2]. Индуцированную мокроту получали после ингаляции 10-20-30 мл 5 % раствора NaCl через ингалятор Омрон U-17. Перед ингаляцией первой порции раствора пациент получал ингаляцию беродуала (15 капель). Откашливаемую самостоятельно мокроту (без индуцирования гипертоническим раствором) также собирали в стерильные контейнеры[3]. После сбора мокроту с помощью стерильного тампона помещали в специальную транспортную среду: ESwab Collection and Transport System, которая должна была сохранять бактерии в течение 5 дней при комнатной температуре или 7 дней при температуре +40 °C. Образцы мокроты собирались сотрудниками ДГБ Св. Ольги в каждом городе в субботу или в воскресенье, а утром в понедельник доставлялись в лабораторию ФГБУ НИИДИ ФМБА России в Санкт-Петербурге. Хранение образцов проводилось во время первой поездки (в Мурманск) при комнатной температуре, а в последующие поездки - в сумке-холодильнике [4]. В бактериологической лаборатории ФГБУ НИИДИ ФМБА России исследование мокроты включало предварительную микроскопию мазков клинического материала, окрашенных по Граму, и культуральный посев. При помощи бактериоскопии мазков мокроты оценивали количество полиморфноядерных лейкоцитов, эпителиальных клеток, а также грамположительных и/или грамотрицательных кокков и/или палочек. Бактериологический посев мокроты производили стандартным полуколичественным методом, число микроорганизмов определяли в 1 мл исследуемого материала. Для бактериологического посева мокроты использовали различные стандартные питательные среды. Для выявления «прихотливых» микроорганизмов, таких как пневмококк, менингококк и др., непосредственно перед посевом в лаборатории готовили кровяной агар на основе колумбийского агара (bioMerieux, Франция) c добавлением 5 % донорской эритроцитарной массы и 10 % лошадиной сыворотки. Микроорганизмы рода Haemophilus выращивали на шоколадном агаре с ростовыми добавками Poly Vitex (bioMerieux, Франция). При посеве мокроты на шоколадный агар для селекции гемофилов, устойчивых к бацитрацину, использовали диски с бацитрацином 10 ЕД (НИИ им. Пастера). Посев клинического материала с целью выявления представителей семейства Enterobacteriaceae и неферментирующих грамотрицательных микроорганизмов (P. aeruginosa, B. cepacia и др.) осуществлялся на агар Мак-Конки (bioMerieux), агар Эндо (Микроген, Москва), для выделения S. aureus - на маннитол-солевой агар (bioMerieux, Франция). Для обнаружения патогенных грибов использовали агар Сабуро (НИЦФ). Инкубация кровяных и шоколадных чашек проводилась в атмосфере с повышенным содержанием СО2 (3-7 %) при температуре 36 ºС в течение 24 часов. Идентификация пневмококков осуществлялась на основе характерной морфологии колоний на кровяном агаре, наличия α-гемолиза, чувствительности к оптохину (bioMerieux, Франция), лизиса в присутствии солей желчных кислот c 10 % раствором дезоксихолата натрия (Sigma, США). Идентификация микроорганизмов осуществлялась на MALDI-Tof MS Biotyper Microflex LT (Bruker Inc., Germany). Чувствительность выделенных патогенов к антибактериальным препаратам определяли на агаре Мюллера - Хинтона (bioMerieux, Франция) диско-диффузионным методом в соответствии с рекомендациями EUCAST: Breakpoint table v5.0 2015. Для оценки антибиотикочувствительности Streptococcus pneumoniae использовали 5 % кровяной агар на основе агара Мюллера - Хинтона. Для определения чувствительности Streptococcus pneumoniae к бета-лактамным антибиотикам проводили скрининг с диском, содержащим 1 мкг оксациллина, что позволяло разделить микроорганизмы на чувствительные и устойчивые к бета-лактамам. Для устойчивых штаммов Streptococcus pneumoniae чувствительность определяли методом серийных микроразведений. У штаммов Haemophilus influenzae и Haemophils parainfluenzae определяли чувствительность к ампициллину диско-диффузионным методом на шоколадном агаре и проводили тест на продукцию бета-лактамаз с нитроцефином (цефиназой). Для выявления метициллинрезистентного штамма S. aureus (MRSA) использовали скрининговый метод определения чувствительности к оксациллину (1 мкг) или цефокситину (30 мкг) (НИИ им. Пастера). Набор необходимых антибиотиков, учет и интерпретацию размеров зоны ингибиции роста исследуемого микроорганизма вокруг диска с антибиотиком определяли в соответствии с рекомендациями EUCAST. Результаты В 5 пробах из 11 (первая поездка в Мурманск), т. е. почти в половине случаев, при хранении образцов при комнатной температуре в посеве не было выявлено патогенов. Во всех следующих поездках образцы мокроты после сбора помещали в холодильник и транспортировали в сумке-холодильнике. При последующих поездках, когда образцы мокроты с транспортной средой хранились в холодильнике, во всех пробах определялись разнообразные бактерии. Не обнаружено преимуществ по высеваемости синегнойной палочки при получении индуцированной мокроты в сравнении со смывами с задней стенки глотки. В обоих случаях, когда родители принесли собранную накануне мокроту, не получено высева стафилококка и синегнойной палочки (в предыдущих посевах они выделялись). При проведении посевов мокроты пациентов с муковисцидозом в бактериологической лаборатории ФГБУ НИИДИ ФМБА у 15 человек отдельные микроорганизмы были выявлены впервые: Staphylococcus aureus (у 10 чел.), Pseudomonas aeruginosa (у 4 чел.), Achromobacter xylosoxidans (у 1 чел.). У пациентов из всех городов, которые периодически лечились в центрах Москвы, Санкт-Петербурга и Ярославля, в 2 раза чаще выделяли синегнойную палочку - 6 случаев из 19 (31 %) - в сравнении с пациентами, которые лечились в своем регионе, - 5 случаев из 32 (15 %; р = 0,323). Несмотря на отсутствие статистически значимых различий, можно говорить о тенденции, правомерность которой подтверждают следующие данные. Пациенты в городах, где нет оформленных центров муковисцидоза - Мурманск, Псков, Петрозаводск, госпитализировались реже, и у них реже выделяли Pseudomonas aeruginosa, который высевали статистически значимо чаще у регулярно госпитализируемых пациентов в тех городах, где есть оформленный центр муковисцидоза: 1 человек из 23 (4 %) против 9 человек из 28 (32 %; р = 0,0443). Выводы 1. Транспортировка образцов мокроты в течение 2 суток возможна с использованием специальной транспортной среды и при хранении образцов мокроты в холодильнике (сумке-холодильнике). Эта методика может использоваться при отсутствии сертифицированной лаборатории в регионе проживания больного муковисцидозом. 2. С учетом большей частоты выделения синегнойной палочки у часто госпитализируемых пациентов в регионах с оформленными центрами муковисцидоза для этих регионов актуальны рекомендации по более тщательной профилактике перекрестной инфекции в стационаре.

About the authors

Aleksandr V Orlov

Saint Petersburg “Child Hospital of St Olga”

Email: orlovcf@rambler.ru
MD, PhD, Associate Professor, Head, Infectious Boxed Department No 3

Viktor N Kovalev

Saint Petersburg “Child Hospital of St Olga”

Email: kovalevpma2009@rambler.ru
MD, PhD, Pediatrician, Infectious Boxed Department No 3

Marina N Ignatieva

Saint Petersburg “Child Hospital of St Olga”

Email: sinc.mariya@mail.ru
Pediatrician, Infectious Boxed Department No 3.

Lubov A Antipova

Saint Petersburg “Child Hospital of St Olga”

Email: twolusu@mail.ru
Pediatrician, Infectious Boxed Department No 3.

Ekaterina A Egorova

Saint Petersburg “Child Hospital of St Olga”

Email: Egorova-Ekat@mail.ru
Nurse, Admission Department

Marina O Volkova

FSBI “Scientifically-Research Institute of Children’s Infection” of FBMA of Russia

Email: mwolkowa@mail.ru
MD, PhD, bacteriologist

References

Supplementary files