Biomodelling Angiogenesis

Full Text

Развитие традиционных моделей in vivo и in vitro для исследования ангиогенеза, начавшееся в прошлом столетии, интенсивно продолжается и в настоящее время. Использование современных биотехнологических и клеточных методических подходов в сочетании с микрофлюидными и литографическими технологиями позволяет в экспериментах воспроизводить состояния, наиболее приближенные к наблюдаемым в клинических условиях, чем это позволяют классические модели ангиогенеза. Примером таких подходов могут служить модели на трансгенных животных и новые классы биомоделей, такие как «орган-на-чипе» или комплексные микрофлюидные системы. Моделирование ангиогенеза in vitro Первые наблюдения ангиогенеза in vitro были произведены Джудом Фолкманом (Moses Judah Folkman) более 35 лет назад [26]. Наблюдая культуру эндотелиоцитов, исследователи фиксировали самостоятельную организацию клеток в капилляроподобные элементы микроангиона. Наличие в них просвета, достаточного для прохождения клеток крови, было подтверждено методами фазово-контрастной микроскопии и просвечивающей электронной микрографии. Просвет в капилляроподобных структурах является важнейшим критерием, определяющим факт формирования сосуда, при работе с культурами эндотелиоцитов. С точки зрения физиологии в идеальной модели ангиогенеза in vitro должны быть последовательно представлены все этапы развития кровеносного сосуда - от начальной миграции эндотелиоцитов до окончательного формообразования сосудистой трубки, развития внеклеточного матрикса и установления постоянной связи с системой уже функционирующих сосудов. Используемые в настоящее время модели, как правило, чаще всего подходят для описания лишь одного выбранного этапа ангиогенеза или его фрагмента (например, уровня экспрессии VEGF). Длительный период исследования эндотелиоцитов in vitro в различных условиях среды привел к созданию большого количества хорошо описанных клеточных линий, морфологические, биохимические и культуральные особенности которых могут существенно различаться между собой [21]. Наличие подобного разнообразия позволяет исследователям, наряду с внедрением в научную работу современных технических средств, отбирать для изучения конкретных стадий ангиогенеза линии эндотелиоцитов, оптимально (по своему фенотипу и уровню экспрессии молекулярных маркеров) подходящих для решения поставленных задач. Для поддержания нативных характеристик клеточной линии необходимо оптимально осуществлять жесткий контроль параметров среды после каждого рассева. Линии эндотелиоцитов могут быть распределены в виде монослоя, отдельных клеток или встроены в различные слои в структуре трехмерной модели. Как в двухмерных, так и в трехмерных моделях можно создать пространственную структуру, в которой эндотелиоциты будут находиться в окружении клеток других типов (фибробластов, миоцитов, миобластов, кардиомиоцитов, гепатоцитов или опухолевых клеток) в зависимости от особенностей изучаемого процесса. Комплекс выбранных типов клеток диктует подбор параметров питательной среды и режима культивирования. Выделяют три основных направления применения моделей in vitro для исследования отдельных стадий ангиогенеза: исследование пролиферативной активности, миграционной активности и дифференцировки эндотелиоцитов. Более сложные модели для комплексного изучения финальных этапов образования сети микрососудов широко используются для тестирования ангиогенных и антиангиогенных лекарственных соединений. В формировании капиллярных трубочек участвуют эндотелиальные клетки, как покрывающие поверхность гелевого матрикса (обычно на основе коллагена или полимерного фибрина), так и находящиеся внутри геля, под воздействием факторов, стимулирующих пролиферацию, дифференциацию и фиксацию эндотелиоцитов. Как правило, такие относительно простые модели используются для скринингового исследования роли потенциальных модуляторов ангиогенеза. Развитие капилляров наблюдают в течение 4-24 часов, фиксируют на камеру для дальнейшего морфометрического анализа [30]. Используя более сложно устроенную гелевую матрицу (например, Matrigel) для создания трехмерной структуры сосудистых каналов, можно с высокой точностью воссоздать условия, в которых происходит ангиогенез in vivo. Наиболее часто применяют «сэндвич-модели» из чередующихся слоев эндотелиальных клеток и слоев внеклеточного матрикса (гель). На начальных этапах (0-7 сут) капиллярная сеть образуется только в горизонтальной плоскости. На второй неделе эксперимента ответвления сосудов прорастают в гель и формируют трехмерную сеть канальцев [27]. В качестве альтернативы «сэндвич-модели» применяются микросферы, покрытые эндотелиальными клетками, которые перемешиваются с гелевыми сферами. В таких условиях можно наблюдать формирование капиллярной сети уже на седьмой день [40]. Существенным ограничением для вышеуказанных методов получения трехмерной структуры кровеносных сосудов in vitro является требование к толщине слоев геля - он должен быть достаточно тонким, чтобы обеспечить диффузию кислорода и питательных веществ к пролиферирующим клеткам, и при этом сохранять потенциал для пространственного роста канальцев. Модели in vitro в основном используются для быстрого получения тех или иных количественных характеристик ангиогенеза или для оценки влияния факторов, влияющих на него. Так, для изучения миграционной активности эндотелиальных клеток применяют трансфильтрационную модель ангиогенеза в модифицированной камере Бойдена [22]. Эти эксперименты, проводимые на трехмерной платформе развития кровеносных сосудов, характеризуют миграцию эндотелиальных клеток, посеянных на поверхности фильтра (диаметр пор около 8 мкм), через которые возможно только активное прохождение клеток в сторону хемоаттрактирующего стимула, помещенного в нижней камере [19]. Поверхность фильтра может быть модифицирована белковыми молекулами, коллагеном, фибронектином, комплексными гелевыми матрицами для приближения условий исследования к условиям нативного микроокружения [18]. К достоинствам модели можно отнести высокую чувствительность даже к малым различиям в градиентах концентраций, хорошую воспроизводимость и быстрое получение результата (4-6 часов). Важно отметить, что методика может быть использована для дифференцировки хемотаксиса (направленной миграции по градиенту концентрации хемоаттрактантов) и хемокинеза (ненаправленной локомоторной активности) за счет чередования положительных, отрицательных и нулевых градиентов, изменяя концентрацию соединений-стимулов в верхней и/или нижней камере. Основными недостатками трансфильтрационной модели ангиогенеза являются сложность ее подготовки, необходимость поддержания трансфильтрационных градиентов-стимулов на постоянном уровне в течение длительного периода времени (трудность дозированного восполнения естественной диффузии стимулов с течением времени), отсутствие точной текущей информации о генерируемом градиенте и невозможность наблюдать движение клетки в ходе эксперимента [39]. Более сложной модификацией трехмерных моделей ангиогенеза in vitro является использование микрофлюидных систем, изготовленных методами литографии. В настоящее время подобные тест-системы широко применяются для максимально приближенного к физиологическим условиям моделирования работы различных тканей и органов человека, а также при исследованиях биологии клеточных линий, формирующих в микрофлюидной среде ткани организма. В простом случае на основе двумерного чипа создаются трехмерные клеточные структуры типа «клеточного пласта» (cell-sheet). Использование такой методики позволяет выращивать из клеточной культуры тканеподобную структуру с заданными морфологическими параметрами. Этот метод был впервые представлен в 2003 году в качестве эксперимента по выращиванию клеточной линии кардиомиоцитов [37]. Примером использования такой модели может служить трехмерная модель микроциркуляторного русла человека объемом около 1 мм3 [34]. К недостаткам подхода можно отнести невозможность его использования для объективной оценки процессов тубулогенеза (образования капиллярного русла). Другим направлением исследований ангиогенеза in vitro является изучение влияния различных комбинаций ангиогенных и антиангиогенных факторов на формирование сосудистого русла в условиях перфузируемой сети кровеносных сосудов [24, 25]. Использование таких моделей позволило получить дополнительные сведения, раскрывающие комплексный характер воздействия различных ангиогенных стимулов. В эксперименте на линии эндотелиоцитов пупочной вены человека (HUVEC) было показано, что присутствие в питательной среде только VEGF недостаточно для стимуляции ангиогенеза. При этом комбинация этого фактора роста со спингозинфосфатом (spingosine-1-phosphate) приводила к индукции миграции клеток, а комбинация с форбол-12-миристат-13-ацетатом (phorbol-12-myristate-13-acetate) запускала массовую миграцию эндотелиоцитов [35]. Моделирование ангиогенеза in vivo Несмотря на значительные успехи в области клеточной биологии и биотехнологии, воспроизведение ангиогенеза in vitro не позволяет ответить на целый ряд вопросов, касающихся влияния на динамику этого процесса различных системных и местных факторов, действующих в живом организме. Особенно это является критичным для финальных этапов доклинических исследований лекарственных соединений, оказывающих влияние на рост, развитие и функциональное состояние кровеносных сосудов. Это делает актуальной проблему моделирования ангиогенеза на лабораторных животных. Оценку динамики развития сосудистой сети производят как традиционными морфологическими методами на биопсийном и аутопсийном материале (плотность микроциркуляторного русла, уровень экспрессии соединений, отражающих функциональное состояние эндотелицитов, - VEGF, vWF, Ki-67, молекулы адгезии клеток), так и при помощи лазерной доплеровской флоуметрии, позволяющей неинвазивным способом оценить работу микроциркуляционного русла и перфузию тканей, и иммунологического анализа основных маркеров эндотелиальной дисфункии - VEGF, VEGFR, tPA, PAI-1, NO и эндотелины [10, 11, 13, 36]. Рассматривая имеющийся к настоящему времени задел в области изучения ангиогенеза на животных, следует отметить, что наиболее полно охарактеризованными являются модели опухольиндуцированного неоангиогенеза. Концепция ингибирования роста злокачественных новообразований путем блокирования факторов - индукторов ангиогенеза, рецепторов к ним или прямого разрушения стенки микрососудов, выдвинутая Джудом Фолкманом в 1971 году, послужила отправной точкой для углубленного исследования ангиогенеза на различных моделях in vitro и in vivo. Широкий спектр применяемых моделей онкогенеза позволяет изучить его с различных сторон, выявить общие закономерности опухолевого процесса, механизмы взаимодействия новообразований с различными тканями и органами, в том числе и системой кровообращения, и создать теоретическое обоснование методов терапии опухолей [5, 10, 31]. Экспериментальные модели позволяют проводить в сжатые сроки большой объем исследований, что существенно ускоряет апробирование новых лечебных и лечебно-диагностических методик. Различают спонтанные опухоли животных, в том числе опухоли у инбредных животных (высокораковые линии), перевиваемые (трансплантируемые), индуцированные опухоли и модели, использующие злокачественные опухоли человеческого организма. Наиболее часто используемыми моделями являются перевиваемые (трансплантируемые) опухоли [2, 4, 9, 10]. Одним из главных достоинств перевиваемых опухолей является их высокая воспроизводимость, что позволяет проводить потенциально неограниченное количество наблюдений и обеспечить системное изучение параметров опухолевого роста с высоким уровнем статистической значимости получаемых результатов. Способность неопластических клеток переносить криоконсервацию дает возможность создания банков перевиваемых опухолей, что позволяет осуществлять планирование работ с перевиваемым материалом и открывает возможности повторного использования материала в новых исследованиях. Также существенным является то, что практически любую опухоль животных можно превратить в перевиваемый клон. Базовые принципы трансплантации новообразований и создания группы перевиваемых опухолей впервые были разработаны Михаилом Матвеевичем Рудневым (1870) и блестяще воплощены на практике его сотрудником и учеником Мстиславом Александровичем Новинским в 1877 году. М.А. Новинский впервые осуществил успешную перевивку злокачественной опухоли от одной собаки другой. Впоследствии на основе этих разработок были созданы многочисленные сингенные модели злокачественных опухолей, исследования на которых придали необходимый импульс развитию онкологии. При сингенной перевивке новообразования животные-реципиенты и трансплантируемые клетки опухоли имеют общий исходный геном. Поэтому пересаженные ткани не вызывают выраженный ответ иммунной системы реципиента, способный привести к отторжению трансплантата. Иммунная система реципиента в целом функционирует нормально, и механизмы взаимодействия злокачественных клеток с элементами своего микроокружения практически тождественны наблюдаемым при спонтанном канцерогенезе. Это позволяет использовать сингенные перевиваемые модели опухолей для воссоздания физиологически адекватного тканевого окружения новообразования, в том числе исследования механизмов неоангиогенеза. Злокачественные клетки можно трансплантировать в области с различным микроокружением: подкожно, внутримышечно, интраперитонеально - для исследования особенностей микроциркуляционного русла в области формирования первичного опухолевого узла, внутривенно - для изучения ангиогенеза в области развития метастазов [20, 32]. Очевидным недостатком этих моделей опухолевого роста являются значительные генотипические и фенотипические изменения трансплантируемых клеток, возникающие вследствие длительно протекающей опухолевой прогрессии, отличающиеся от клеток, эволюционирующих в спонтанных опухолях, что не позволяет говорить о полной эквивалентности перевиваемых опухолей новообразованиям человека. В последнее время, наряду с классическими перевиваемыми опухолями, исходно полученными от животных, в арсенал научных и доклинических исследований входят гетеротрансплантируемые новообразования человека, перевиваемые иммунодефицитным животным. Несмотря на то что очевидным преимуществом такого подхода является возможность использования опухолей человека, необходимо отметить, что из-за отсутствия влияния клеток иммунной системы на процессы опухолевой прогрессии и роста новообразования, не удается полностью воспроизвести «естественное» микроокружение опухоли. В ходе экспериментальных исследований ксенотрансплантантов новообразований у иммунодефицитных мышей наблюдались большие отличия показателей развития опухоли у человека, обусловленные нарушением механизмов иммунного ответа [16, 24]. Создание гуманизированных линий лабораторных животных, способных продуцировать иммунокомпетентные клетки человека, позволило улучшить результаты ксенотрансплантации опухолей. Ксенотрансплантируемые новообразования различного гистологического типа позволили получить убедительные доказательства о роли процессов ангиогенеза в развитии неоплазии и противоопухолевой эффективности моноклональных антител против VEGF, ангиопоэтинови рецепторов к ним. Так, было выявлено клинически значимое торможение роста опухолей на фоне антиангиогенной терапии (до 95 %) [29]. Помимо непосредственного воздействия на рост новообразований вследствие ограничения перфузии опухолевой ткани антиангиогенные препараты нормализуют структуру кровеносных сосудов в перитуморальной области, что способствует большей эффективности цитостатической терапии и препятствует метастазированию. Существенным недостатком многих моделей изучения неоангиогенеза оказывается быстрый рост опухолей и малая продолжительность жизни подопытных животных. Одним из путей преодоления этого ограничения является создание трансгенных животных с вызванной повышенной экспрессией определенных онкогенов, что приводит к образованию спонтанной опухоли в прогнозируемые сроки и развивающейся в течение более длительного периода. Для создания генетически модифицированных линий животных используются две основные методики: введение экзогенного участка гена в оплодотворенные ооциты, в результате чего инородная ДНК встраивается в случайную хромосому в произвольном месте, и гомологичная рекомбинация ДНК, введенной в культивируемую линию эмбриональных клеток, что позволяет осуществлять локус-специфические мутации. В результате можно получить либо повышенную экспрессию онкогенов, либо недостаточный уровень синтеза ингибиторов канцерогенеза. Именно исследования на трансгенных животных позволили установить ключевую роль ангиогенеза в развитии организма. Полная блокада ключевых факторов ангиогенеза (факторы семейства VEGF и FGF и/или рецепторов к ним) приводит к гибели животных уже на стадии эмбрионального развития [28]. Наряду с изучением опухоль-ассоциированного ангиогенеза большое значение имеют исследования развития кровеносной системы в жировой ткани подопытных животных. Жировая ткань является одной из наиболее васкуляризованных тканей организма (особенно высока плотность сосудов в бурой жировой ткани). Привлекательность жировой модели ангиогенеза для исследователей, помимо очевидных причин, обусловленных данными эпидемиологических исследований, прямо указывающих на увеличение в популяции количества людей, страдающих ожирением, связана с хорошей визуализацией кровеносных сосудов в жировой ткани, что позволяет более точно фиксировать и описывать различные этапы их развития. В настоящее время для исследования ангиогенеза используется ряд охарактеризованных линий мышей, в том числе и генетически модифицированных (ob/ob-мутация, обусловливающая предрасположенность к ожирению, и db/db-аутосомно рецессивная мутация, вызывающая диабет и ожирение) [41]. Вместе с тем у людей ожирение часто обусловлено не только генетическими нарушениями, а связано с увеличением алиментарной нагрузки и неподвижным образом жизни. Это делает актуальными модели с использованием животных, содержащихся на различных диетах, обогащенных углеводами и/или жирами [12, 17]. Неоднородность питания среди животных, обусловленная различным социальным положением особей внутри исследуемых групп, оказывает существенное влияние как на развитие жировой ткани, так и на процессы, связанные с этим развитием (в том числе на ангиогенез), что оказывает негативное влияние на воспроизводимость полученных результатов, преодоление которого возможно либо путем индивидуального содержания животных, либо путем увеличения объема выборки. Перечисленные выше методы биомоделирования ангиогенеза, как правило, используются для поиска новых стратегий антиангиогенной терапии и тестирования лекарственных препаратов, ингибирующих развитие кровеносных сосудов. Наряду с этими исследованиями большой интерес представляют и другие модели, в которых воспроизводятся процессы стимулирования ангиогенеза, направленного на усиление репаративных процессов в различных органах и тканях. Фундаментальные и доклинические разработки в этой области легли в основу концепции «терапевтического ангиогенеза», являющегося дополнительным направлением профилактики и лечения ишемических поражений сердца, головного мозга и других органов, вызванных недостаточностью их системы микроциркуляции [3, 6-8, 38]. Для анализа эффективности и безопасности тех или иных воздействий (введение факторов роста, хирургические манипуляции, прекондиционирование) на динамику терапевтического ангиогенеза применяют классические биомодели, воспроизводящие широко распространенные заболевания - ишемическую болезнь сердца [1], инфаркт головного мозга [14, 15], острую ишемию сосудов задних конечностей животных [23, 33] и др. Заключение Несмотря на большое количество моделей, применяемых для исследований ангиогенеза, ни одна из них не является в настоящий момент «золотым стандартом». Разработка новых методов воспроизведения механизмов развития кровеносных сосудов ведется в основном в направлении компенсации недостатков существующих моделей, главным из которых является невозможность полностью воспроизвести условия микросреды в органе или ткани, в которых исследуется процесс ангиогенеза на всех его этапах. Предиктивная способность современных моделей ангиогенеза in vivo (а тем более in vitro) невелика, что подтверждают различия в эффективности наблюдаемых при испытаниях про- и антиангиогенных лекарственных средств в доклинических и клинических исследованиях. Значительный вклад в преодоление этого разрыва должны внести исследования с использованием трансгенных животных, позволяющие получить результаты, максимально близкие к эффектам, наблюдаемым при изучении различных аспектов ангиогенеза у человека.

About the authors

Nikolai A Verlov

St Petersburg National Research Academic University

Email: virlov@gmail.com
MD, PhD, Senior researcher

Alexander P Trashkov

Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry named after I.M. Sechenov

Email: trashkov@gmail.com
MD, PhD

Maria A Pahomova

St Petersburg State Pediatric Medical University Ministry of Health of the Russian Federation

Email: mariya.pahomova@mail.ru
MD, Senior researcher

Nikolai V Haitsev

St Petersburg State Pediatric Medical University Ministry of Health of the Russian Federation

Email: nvh195725@gmail.com
PhD, Professor

Evgeni I Malyshev

St Petersburg National Research Academic University

Email: virlov@gmail.com
Junior researcher

References

Supplementary files